Summary
8 saat - vücuttan çıkarılır sonra, nöronal doku büyük ölçüde 6 sonra doku nihai bozulmasına sebep çevre koşullarından etkilenir. yakından takip eder ve dokunun hücredışı ortamı düzenleyen benzersiz inkübasyon yöntemi kullanılarak, doku canlılığını önemli ölçüde> 24 saat boyunca uzatılabilir.
Abstract
Diseksiyon Aşağıdaki 8 saat - nöronal doku preparatları, beyin kesitleri ve retina wholemount akut, genellikle 6 korunabilir. Bu deneysel zaman sınırlar ve çalışmanın başına kullanılan hayvanların sayısını artırır. Bu tür banyo uygulanan boyalar ile uzun süreli ön inkübasyon gerektiren kalsiyum görüntüleme gibi Bu sınırlama, özellikle etkiler protokolleri. 3 içinde Üstel bakteri üremesi - dilimleme sonra 4 saat sıkı doku sağlığı bir azalma ile ilişkilidir. Bu çalışma, büyüme faktörlerini içeren antibiyotiklere steril prosedürleri ya da doku kültürü ortamı gerek kalmadan zaman uzun süreli (> 24 saat) için geçerli nöronal doku sağlamak için, akut preparasyonlarda bakterilerin üremesini sınırlamak için bir yöntem tarif eder. UV ışınlaması yoluyla dışı sıvıyı bisiklet ve 15 özel tutma odasında doku tutarak - 16 ° C, doku elektrofizyolojik özellikleri, veya kalsiyum si fark gösterir> 24 saat postdissection hücre içi kalsiyum boyalar ile gnaling. Bu yöntemler akut nöronal doku kullananlar için deneysel süresini uzatmak kalmayacak, ama deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvanların sayısını azaltacak ve akut nöronal doku inkübasyon için bir altın standart ayarlar.
Introduction
Elektrofizyoloji ve fonksiyonel görüntüleme (kalsiyum, gerilim duyarlı boyalar) nörobilim alanında en sık kullanılan deneysel teknikler ikisidir. Beyin dilim hazırlıkları ve burada ele alınacaktır retina wholemount, anestezik veya kas gevşeticiler gelen kirlenme olmadan elektrofizyolojik özellikleri ve sinaptik bağlantı inceleme olanağını sağlamaktadır. Beyin dilimleri ve retina belli devreler ve beyin ağları 1 çalışma sağlayan kültürlerin veya hücre homojenatları farklı olarak, yapısal bütünlüğünü muhafaza wholemount. İzole doku Kayıtlar kalp atışı ve solunum ile ilişkili hareketler olarak in vivo kayıtları üzerinde avantajları ortadan kalkar var. Ayrıca, doğrudan görselleştirme hedef hücre spesifik sınıfları ve farmakolojik araçlar 2, 3 lokal uygulamaya izin verir.
Patch-kelepçe kayıtları ve kalkyum-yükleme boyası retina wholemount Retina Ganglion Hücre (RGC) katmanı kapsar ve hücrelere doğrudan erişimi engeller Membran (ILM), Sınırlama İç varlığı ile karmaşık. Tipik haliyle, bu membran, tek bir hücre üzerindeki bir gigaohm contanın bir yama pipet ve oluşum doğrudan uygulamaya izin vermek için bir cam pipet ile kazınarak. Buna ek olarak, küvet uygulanan kalsiyum boyalar ILM geçmez ve ya retrograd optik sinir 5 aşağıdaki enjeksiyon taşınan veya dokuya 6 boyunca elektroporasyon, bu zarın 4 altından enjekte edilmelidir. Retinitis pigmentosa kemirgen modeli kullanılırken Dahası, rd / rd fare, ILM daha kalın ve daha aşılmaz olduğunu. Burada, yama-kelepçe recordi için retina ganglion hücrelerinin her yerde kalsiyum boya yükleme ve doğrudan erişim hem de izin vermek, enzimatik sindirim 7 ile ILM kaldırmak için bir tekniği kullanırNGS 8.
beyin dilimleri veya retina wholemount birinden başarılı kayıtları diseksiyon ve canlı nöronal doku inkübasyon bağlıdır. Tipik olarak, doku, deney sabahı ekstre edilir ve kayıt için kullanılana kadar yapay serebrospinal akışkan (CSF) 'de inkübe edilmiştir. Bu zaman penceresinde aşağıdaki önemli ölçüde bozulma ile, 8 saat - Genellikle, doku 6 canlı kalır. Ancak, beyin dilimleri ve wholemount retinae hazırlıkları hem genelde bu kısa süre içinde kaydedilebilir daha fazla doku üretir. Sonuç olarak, bağ, genellikle gün sonunda atılır ve diseksiyon sonraki günlerde daha tamamlanır. Bu, başka bir hayvan kullanılmıştır ve kurulum ve diseksiyon / tekrarlanan boyama ~ 2 saat demektir. Aşağıdaki protokol kullanılmaktadır daha az hayvan anlamına fazla 24 saat boyunca, nöronal dokuda ömrünü uzatmak için bir yöntem tarif eder, ve daha çok deneysel kez mevcuttur. Doku canlılığını Welektrofizyolojik özellikleri ve kalsiyum dinamikleri kayıt yoluyla değerlendirilir ve bu özellikleri <4 saat ve> 24 saat postdissection arasındaki ayırt olduğu gibi.
Bu sonuçlar, uzun inkübasyondan sonra tek hücre özellikleri bozulmamış ve işlevsel değil sadece gösteriyor, ancak kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar ile değerlendirilen ağ etkinliği, 24> değişmeden saat postdissection olduğunu. Ayrıca, kalsiyum boyalar herhangi bir zararlı etkiye neden olmadan uzun süreli dönemler için hücrelerde kalır olduğunu göstermektedir. Bu protokolün uygulanması dış çevre yüksek düzenlenir sonra akut nöronal dokuda nöronların fonksiyonel aktivitesi, uzun süreler boyunca muhafaza edilebileceğini göstermektedir. Doku canlılığı nedeniyle farklı inkübasyon protokolleri laboratuarlar arasında büyük farklılıklar Dahası, bu yöntem akut neu sağlığı değişkenliği azaltmak için uygulanması gereken ideal bir parametre için bir altın standardı belirlerronal dokusu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokol aşağıda C57BL / 6 ve C3H / He (retinally dejenere) Fare nöronal doku hazırlanmasını tarif, ancak benzer teknikler diğer türlere uygulanabilir. Bütün hayvanlar, sağlıklı ve standart sıcaklık koşulları, nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde, yiyecek ve suya serbest erişim ile ele ve herhangi bir amacıyla güç uyaran olmadan. Bütün deneyler onaylanmış ve Batı Sydney Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik komitesi göre yapılan ve hayvan kullanımı ve bakımı ana hatları (Hayvancılık Araştırma Kurumu # A9452, # A10396 ve # A8967) göre edildi.
1. Beyin Dilim Hazırlık
- izofluran (% 5) inhalasyon yoluyla hayvan anestezisi ve bir kemirgen giyotin kullanarak başını kesmek. Daha önce 9 tarif edildiği gibi hızlı bir şekilde beyin çıkarın ve buz gibi soğuk fizyolojik çözelti (ACSF) (mM olarak) içine yerleştirin: 125 NaCl, MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25 2.5 KCI, 1NaHCO 3, 25 dekstroz ve karbojen ile doyurulmuş (% 95 O 2/5% CO2 karışımı 310 mOsm, pH 7.4).
- titreşimli mikrotom ile 300 mikron kalınlığında, ilgilenilen bölgede, beyin dilimleri kesin.
- Daha önce 10, 11 açıklandığı gibi, carbogen akışı ve sıcaklık - yakından izler ve pH düzeyini (7.4 pH 7.2) kontrol eden bir özel inşa kuluçka sistemi dilim aktarın.
- 15 ila 35 ° C, ilk reaktör sıcaklığı ayarlama - 30 dakika, ve daha sonra yavaş yavaş 15 azaltmak - Şekil 1C'de gösterildiği gibi, 16 ° C. kadar gerekli sonra ya elektrofizyoloji veya görüntüleme için, kuluçka sisteminin dilimleri kuluçkaya yatmaktadır.
NOT: dilimleri kalsiyum görüntüleme için kullanılacak ise, RT altında doku soğutmadan önce aşağıdaki adımları izleyin.
2. Retina Wholemount Hazırlama ve İç Limitan Membran Soyulması
- Ya normal koşullarda retina wholemounts hazırlayınlaboratuvar aydınlatma koşulları veya loş kırmızı / kızıl ötesi ışık.
- servikal dislokasyon ve hemen aydınlatmak gözler hayvan Euthanize. Ames ortam veya ACSF içeren ya küçük ora serrata'dan boyunca kesilmiş ve yer (mM) sağlayın: 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glukoz, 0.5 L-glutamin ve karbojen ile doyurun (2/5,% CO2 karışımı% 95 O, ~ 300 mOsm, pH 7.4) ilave edilir.
- Hemen küçük bir makas ile ora serrata boyunca kesme ve forseps ile lens ve vitrözü ile kornea, lens ve vitrözü çıkarın. Oda sıcaklığında inkübasyon sistemi doku yerleştirin.
Not: retinal doku 15 yavaş sıcaklık azaltma sonra, göz fincan korunabilir - ihtiyaç kadar inkübasyon sistemine> 24 saat boyunca, 16 ° C. - Earl's- 30 U / ml papain, 1 mM L-sistin, 0.5 mM EDTA ve% 0.005 DNaz içeren küçük bir cam kavanoza retina içeren göz fincan transfer ILM kaldırmak için20 dakika için 37 ° C 'de dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS). Kapaktan çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 uygulayın, ancak kabarcık yok. Genç hayvanların (<6 hafta) doku kullanılırsa, yarı gücü seyreltilir.
- Earl BSS 10 dakika süreyle bir ovomukoid (10 mg / ml) ve BSA (10 mg / ml) çözelti içinde doku yerleştirerek, enzimatik sindirim durdurun. 16 ° C - Yıkama doku iyice aCSF ile inkübasyon sistemine aktarılmadan önce ve 15 sıcaklığını düşürmek.
- ihtiyaç kadar göz fincan retina dokusu korumak. mikroskop transfer için, göz bardaktan retina izole ve bir traş bıçağı ile 4 parçalar halinde kesilmiş. Tüm retina gerekiyorsa, düz yalan izin vermek için retinanın periferinde dört küçük kesikler yapın.
NOT: görüntüleme deneyleri, kuluçka sistemine aktarılmadan önce kalsiyum boya ile yük için aşağıya bakın.
3. enkubatörde Doku bakımı
- Çözelti içinde kayan bakteri saçmak için (5W / 2P sterilizatör UV lambası, 254 nm), ana bölmeden izole edilmiş ve UVC ışığı B 1.1 maruz (daha önce tarif edildiği gibi 12 inşa UVC odası), bir ikinci bölme ile aCSF sirküle (Şekil 1A). aCSF aşırı ısınmayı önlemek için 30 dakika - her 15 dk 15 ila 26 değişen zamanlarda ON döner rastgele özelliğini kullanarak programlanabilir zamanlayıcı ile kontrol UVC ışığı zamanlama.
- 12 ml UVC odasında akış hızını ayarlamak / dk önce olduğu gibi 12 bildirdiler. nöronal dokulara zarar verebilir odasının dışında UVC aydınlatma önlemek için alüminyum folyo ile UVC odasına örtün.
NOT: koyu adapte retina dokusunun için, ışık dışlamak için ana odaya ısmarlama kapak uygulayın. - Sirkü bir peristaltik pompa kullanmakte iki odaları aracılığıyla çözüm (CSF) ve 0 aralığında istenilen sıcaklıklara serin veya ana odayı ısıtmak birine soğutucu Peltier termoelektrik soğuk plaka - 50 ° C. Uzun vadeli canlılığı için 16 ° C - Optimum doku inkübasyon için, 15 kullanın.
4. Kalsiyum Boya Yükleme
- Bireysel araştırmacının tercihine göre kalsiyum boyalar seçin. Burada Fura-2AM, Flu-8 am veya Flu-4 am kullanın. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, diğer boyalar için uygulanabilir: 1 mM solüsyonu ve% 1 blok kopolimerleri DMSO içinde kalsiyum boyalar çözülür (örneğin, pluronik asit 127), 10 dakika boyunca son bir 50 uL hacmi ve sonikasyon.
- Retina 10 uM, beyin kesitleri% 0.01 blok kopolimerleri ve 20 uM (retina),% 0.02 blok kopolimerleri nihai konsantrasyona aCSF çözüm ekleyin. F; 37 ° C (Fura-02:00) ya da oda sıcaklığında (Fluo-4 AM genç hayvanlarda, 45 dakika için banyo yükten retinae (papain muamele edilmiş) ve beyin dilimleriluo-08:00).
- yetişkin hayvanların, (> 12 haftalık) için doğrudan beyin dilimleri üzerine boyalar (50 uL) pipet ve derin katmanlarına boyanın daha iyi nüfuz izin vermek için 75 dakika boyunca muhafaza edilir.
- Boya inkübasyon sırasında su altı dilim yeterli oksijen sağlamak için, aCSF 2.5 mL içinde seyreltilmiş kalsiyum boyalar ile kapalı bir kapak (çap 2.5 cm, dairesel kavanoz, 3,5 cm yükseklik) olan bir cam yükleme bölmesine hazırlar. % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli oksijen. kabarcık etmeyin.
- Deneysel kullanıma kadar 16 ° C - boya yükleme sonrasında yavaş yavaş 15 sıcaklığını düşürmek, kuluçka sisteminin aCSF ve transfer ile doku yıkayın.
5. Elektrofizyolojik Kayıtlar ve Görüntüleme
- mikroskop altında dalgıç bir kayıt odasına doku yerleştirin ve 4 bir akış oranında oksijenli ACSF serpmek - RT (~ 22 ° C) ya da fizyolojik sıcaklıkta 5 mL / dakika, ya (~ 35 ° C). Holgerilir ve altın veya platin tel U şeklinde bir parça üzerinde yapıştırılmış bir naylon veya altın parçacıkları imal 'harp' özel yapılmış kullanılarak yerine D dokusudur.
- elektrofizyoloji için:
- 5-6 MQ nihai direncini elde etmek için bir mikropipet çektirmenin kullanarak 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın.
- Daha önce 13 açıklandığı gibi iç çözümü 4 mcL ve bir CCD kamera kullanarak kızılötesi Diferansiyel Girişim Kontrast (IR-DIC) altında hücrelerin görselleştirmek - 3 pipet doldurun. Hücre içi çözüm dikkatlice deneysel sonuçlar elde etmek için her bir deney uygun olmalıdır.
- Pozisyon pipet, pozitif basınç korurken bir micromanipulator kullanarak bir hücre zarında yer alan, pipet tutucu bir emme portu aracılığıyla başvurdu. ILM retina kaldırıldı beri, önceden zar kazıma gereklidir. Pipet hücre üzerinde sonra, nazik negatif uygulamakpipet basınç gigaohm mühür elde etmek. Daha sonra bir negatif basınç kısa bir miktarı ile, hücre zarı yırtılabilir.
- uygun şekilde standart teknikler kullanılarak bütün hücre akım-veya voltaj-kelepçe kayıtları sağlayın.
- Kalsiyum-görüntüleme:
- Fura-2 oran ölçer görüntüleme için, 340 nm ve 380 nm düzeyindeki uyarıcı dalga uzunluklannda sağlamak için bir ultra-yüksek hızlı dalga değiştiriciyi kullanın. 510 ± 20 nm emisyon filtresi aracılığıyla tek tek hücrelerin yayılan ışığı geçirin ve bir yüksek hassasiyet, yüksek hızlı dijital kamera ile yakalamak.
- 550 nm bant geçiren filtre - Bir 515 ile 490 nm bant geçiren filtre ve yayılan ışık - Flu-4, filtre uyarma 460 ışığın tek bir dalgaboyu için. En hızlı ve en hassas kayıt için böyle bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanın. gerektiği gibi görüntü kazanır.
- zamanın bir fonksiyonu ya tek bir dalga boyunda (Fluo-4) ya da dalgaboyu oranı kullanılarak floresan değişiklikleri ölçmekyöntemi (Fura-2), daha önce, 14 8 hazırlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnkübasyon sırasında aCSF bakteri yükü ve sıcaklık sıkı regülasyonu nöronal doku canlılığını korumak için şarttır. 16 ° C (Şekil 1) - Bu UVC ışığı ile ışınlama ve 15 aCSF sıcaklık muhafaza ile optimize edilebilir. (Şekil 1C APS), takip edildiği takdirde arasındaki değişkenliği azaltacak nöronal doku, kuluçka sırasında böylece parametreler için bir altın standart sunan, çevre koşullarının bir rekor (pH ve sıcaklık.) Ile deneyci sağlar Ayrıca, aCSF damga parametreleri deneyler.
Doku Çevre Sıkı Yönetmelik sağlar Şekil 1. Bir Kuluçka Sistemi. Bir soğutma Peltier plakası, ana odacık, peristaltik pompa ve UVC odasının oluşan kuluçka sisteminin, şematik. B,aCSF giriş ve çıkış noktalarını gösteren ana odacık yanı sıra carbogen giriş, sıcaklık ve pH probları Yandan görünüm. belirtildiği gibi doku ağ üzerine yerleştirilir. Tüm test çubukları yapısal kararlılık sağlamak için, kapak eklenir. İnkübasyon süresince aCSF sıcaklık ve pH anlatan C, aCSF Parametreleri Damga. D ölçüm sondaları için montaj delikleri gösteren ana odasının üstten görünümü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Doku canlılığını ağ aktivitesi (Şekil 2), hem de kalsiyum yanıtları (Şekil 2B, C) dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme yöntemleri vasıtasıyla ölçülebilir. Yerel, ağ etkinliğini izlemek için, biz aCSF potasyum klorid (30 mM KCl) yüksek konsantrasyonda içeren uygulamalıhangi uygulanan K + çevresinde içinde nöronların depolarizasyon ve glia yol açtı. Bu depolarizasyon, hücre canlılığı için fizyolojik bir göstergesi olarak hizmet veren geçici kalsiyum (Şekil 2B, C) ve engelleyici aktivitesi (Şekil 2B) 'de bir artış ile gözlenebilir. Sonuçlarımız inkübasyon sistemine> 24 saat daha inkübe edildi dilimleri aktivitesi spike "taze" dilim kısa süreler (Şekil 2B> 4 saat) inkübe benzer olduğunu göstermektedir. Ayrıca, istirahat membran potansiyeli, giriş direnci, zaman sabiti de dahil olmak üzere, hem pasif ve aktif membran özellikleri hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar aracılığıyla izlendi bireysel nöron canlılığı, ve aksiyon potansiyeli literatüründe 15 (Şekil 2E, F bildirilen parametrelere karşılaştırılabilir ).
Uzamış İnkübasyon sonrasında Beyin Dilimleri Şekil 2. Elektrofizyolojik ve Kalsiyum Özellikleri. Bir beyin dilim A, Görüntü ağ etkinliğini ölçmek için kullanılan iki hücre dışı kayıt elektrotları ile dilimleme sonra 28 saat alındı. Üçüncü bir elektrot (yıldız işareti ile işaretlenmiştir) KCI 30 mM puf için kullanılır. B, KCl banyo uygulamasını takiben hücre içi kalsiyum geçici bir artış gösteren> 24 saat boyunca Flu-4 am yüklü dilim Zaman atlamalı görüntüleri. C kısa KCl uygulaması (30 mM; 1 ler) aşağıdaki Hücre içi kalsiyum geçici. Kırmızı - ortalama sinyal, Gri - B görüldüğü gibi tek hücrelerde kalsiyum izleri. Ge öncesi ve KCl (kırmızı oklar) uygulanmasından sonra ağ etkinliğinin Hücre dışı fizyolojik kayıt "taze" dilimler arasında büyük ölçüde değişmeden olduğu (<4 saat postdissection) Ve inkübatör içinde> 24 saat daha inkübe edildi, bu. Depolarizasyon ile [K +] artmaya tepki canlı nöronların belirten KCl uygulamadan hemen sonra aktiviteyi spike artış dikkat edin. E ve K, pasif (E) ve 2 saat boyunca (mavi izleri) ve inkübasyon sistemine inkübasyondan 26 saat (siyah izleri) Aşağıdaki piramidal nöron aktif (F) membran özellikleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Retinally dejenere rd / rd farelerin wholemount retina ganglion hücre tabakası hücrelerine doğrudan erişim sağlamak için, ILM enzim, papain 7, 8 ile sindirilmiştir. sindirim sonra, RGCs ve yerinden amacrine hücreleri açıkça und görüntülenmiştir edilebilirer DIC aydınlatma (Şekil 3A) ve hücreler ILM önceden kazıma olmadan yama-kelepçe kayıtları için hedeflenebilir. Bir RGC Temsilcisi akım kelepçe kayıtları Şekil 3B gösterilmiştir. yama pipet üzerinden hücre depolarizasyonu papain tedaviden sonra hücre canlılığı gösteren doza bağlı aksiyon potansiyel oluşumunun neden oldu.
ILM uzaklaştırılması ayrıca büyük gösteren,, Fura-2AM (Şekil 3B) ve f 0 340/380 nm oranı nispeten büyük bir artış ile 30 mM KCI uygulamaya yanıt hücreleri ile ganglion hücre tabakası (GCL) her yerde lekeleme izin hücre içi kalsiyum konsantrasyonu (Şekil 3E) artış. Kalsiyum seviyesi uyarılmasının ardından taban çizgisine dönene kadar ve hücreler daha sonra benzer bir amplitüd cevabı üretmek için teşvik edilebilir. Ayrıca, bu yanıtları r arasındaki ayırt edilemez olduğunuetinae kaydedildi <4 saat ve> 24 saat postdissection (Şekil 3F, G).
Şekil 3: Retina Wholemount Elektrofizyolojik ve Kalsiyum Kayıtlar. Papain sindirim sonra GCL bir retina ganglion hücre bir yama-kelepçe kayıt A, Diferansiyel girişim kontrastlı görüntü. Sırasıyla 50, 100 ve 150 pA ile depolarize olduğunda B, Hücreler doza bağımlı spike yanıtları korur. C & D, Fura-2AM hamam uygulamasından önce iç sınırlayıcı membran çıkarılması retina ganglion hücrelerinin her yerde yükleme, görüntü 380 nm uyarma ile çekilen sağlar. D, 30 mM KCI ASCF uygulandığında, boyanmış hücrelerin% 85 340/380 oranında bir artış ile verdi. F & G, 30 mM KCI uygulandıktan sonra başlangıca 340/380 oranı getiri artış (kırmızı çubuklar), Ve hücreler daha sonraki uyarıya diseksiyonu aşağıdaki her iki <4 saat ve> 24 saat cevap. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, böylece deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvan sayısının azaltılması, görüntüleme ve elektrofizyolojik deneyler için akut nöronal doku canlılığını uzatmak için bir kuluçka yöntem açıklanır. İki ana süreçleri zamanla nöronal doku bozulmasını yöneten: i) artan bakteri düzeyleri ve serbest bakteriyel endotoksin eşlik eden artış ve travmatik dilimleme işlemi 10 aşağıdaki ii) eksitotoksi. Akut nöronal doku çevre savunmasız olduğundan, pH, sıcaklık ve bakteri seviyelerinin yakından takip ederek doku ortamının sıkı düzenleme ağ bütünlüğünün yanı sıra hücresel aktiviteyi sürdürmek için gereklidir. Diseksiyon ve doku tedavisi (papain sindirimi, kalsiyum boya yükleme) deney zaman içinde bir azalmaya neden tamamlanması üzerinde 2 saat sürebilir. Ancak, doku ölçülebilir bir kayıp olmadan> 24 saat boyunca kuluçka sisteminde tutulabilir çünkü benn canlılığı 7, 8, bu hazırlık sadece sonuçların> 24 saat elde etmek için bir defa tamamlanması gerekmektedir. 3R stratejisinin bir parçası olarak (Yedek, azaltma, Arıtma) hayvanların 16 etik kullanımı için yol gösterici ilkeler sağlamayı amaçlayan, bu yöntem deneyleri bu tür kullanılan hayvanların sayısını azaltarak büyük bir etkiye sahip olacaktır.
retina wholemount dokusunun ILM sindirimi patch-kelepçe kayıtları ve banyo uygulaması ile her yerde kalsiyum boya yükleme için GCL hücrelerin kolayca hedefleme sağlar. Bu teknikler ILM bir cam pipet ile ovalama ile ihlal daha kalın ve daha sert olan dejenere retinae için özellikle yararlıdır. Ayrıca, papain hazırlık GCL boşluk kavşak birleştiğinde hücrelerden kaydetmek için iki elektrot kullanılarak eşleştirilmiş hücre kayıtları gerçekleştirmek için bir yol, daha önce mümkün olmamıştır şey sağlar. ancakK + reseptör ekspresyon papain 6 ayrışma şu fotoreseptör değiştirilmesi için gösterildiği gibi, papain sindirimi olasılıkla Normal retinada bazı etkilere sahiptir. Retina mimarisi etkilendiğini de mümkündür. VELTE ve Masland bazı RGC somas ve dendritler ILM kaldırmak için papain tedavi ile hasar olmasına rağmen RGC çoğu nöronlarda soma distalinde dendritlerindeki dan, başarılı hücrelerin yapısal bütünlüğünü gösteren kayıt olabileceğini gösterdi ve 5 işler. Önemli olarak, yukarıda tarif edildiği gibi, retina pigment epiteli (RPE) ve sklera bağlı retina bırakarak papain difüzyon dış retinayı izole ve bu protokol WT retinae uygulandığında fotoreseptör dış bölümlerin üzerinde herhangi bir olumsuz etkilerini azaltabilir. Her iki durumda, papain tedavisi veya ILM kazıma olarak, meydana gelecek bazı hücre hasarı, deneyci experim için uygun yöntemi seçmelidirental soru.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).
