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Neuroscience

पूर्व embedding Immunohistochemistry और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए गैर मानव प्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55397
Automatic Translation
1,2, 1
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Summary

यहाँ, हम एक आसान, कम लागत प्रदान करते हैं और समय कुशल प्रोटोकॉल रासायनिक एक्रोलिन बंधक के साथ प्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों को ठीक करने, लंबी अवधि के संरक्षण कि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए पूर्व embedding इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के साथ संगत है के लिए अनुमति देता है।

Abstract

प्रकाश माइक्रोस्कोपी स्तर पर सभी तकनीकी प्रगति के बावजूद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की जांच करने और इस तरह के synaptic संपर्कों के रूप में न्यूरॉन्स, की ultrastructural और रूपात्मक विवरण चिह्नित करने के लिए तंत्रिका विज्ञान में केवल उपकरण बना रहता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मस्तिष्क के ऊतकों की अच्छा संरक्षण कठोर क्रायो-निर्धारण के तरीकों के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है लेकिन इन तकनीकों बल्कि महंगी हैं और immunolabeling का उपयोग, जो पहचान न्यूरोनल सिस्टम की कनेक्टिविटी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है की सीमा। फ्रीज प्रतिस्थापन तरीकों immunolabeling साथ क्रायो-निर्धारण के संयोजन अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, इन प्रणाली वैज्ञानिक दृष्टिकोण के reproducibility आमतौर पर महंगा ठंड उपकरणों पर निर्भर करता है। इसके अलावा, इस तकनीक के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने बहुत समय लेने वाली और कौशल चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, पारंपरिक रासायनिक निश्चित मस्तिष्क, विशेष रूप से एक्रोलिन बंधक के साथ, इलेक्ट्रॉन गठबंधन करने के लिए एक समय कुशल और कम लागत वाली विधि बनी हुई हैइम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री साथ माइक्रोस्कोपी। यहाँ, हम एक विश्वसनीय प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल रासायनिक एक्रोलिन निर्धारण कि प्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों के संरक्षण की ओर जाता है और पूर्व embedding इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री और संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म परीक्षण के साथ संगत है का उपयोग कर सकते हैं।

Introduction

कोंफोकल और दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी सहित प्रकाश माइक्रोस्कोपी,, विवो न्यूरोनल प्रक्रियाओं में अध्ययन, अन्य बातों के 1 के बीच 2 के लिए एक कुशल उपकरण साबित हो गया है। हालांकि प्रकाश सूक्ष्म (एल एम) के स्तर पर ठेठ स्थानिक संकल्प लगभग 200 एनएम, हाल ही में तकनीकी विकास इस तरह के चरम पराबैंगनी और नरम एक्स-रे माइक्रोस्कोपी के रूप में विभिन्न प्रकाश स्रोतों, उपयोग कर रहा है, विशेष रूप से एक लगभग 10 एनएम स्थानिक संकल्प 3 को यह संकल्प में वृद्धि हुई है , 4, 5। इमेजिंग में अन्य तकनीकी विकास संयुक्त ऊतक विज्ञान के साथ चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और विवो में माइलिन आवरण, एक पैरामीटर है कि केवल इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म (EM) स्तर 6, 7 में पारंपरिक रूप से औसत दर्जे का था की मोटाई मापने के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करना शामिल है। Although एल एम स्तर पर इन अग्रिमों ऐसे synaptic संपर्कों के रूप में रहने वाले प्रक्रियाओं, संरचनाओं का एक विस्तृत विवरण और लक्षण वर्णन, अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं केवल ईएम, एक प्रस्ताव है कि 0.5 एनएम तक पहुँच सकते हैं प्रदान करता है जो के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, ईएम स्तर पर अवलोकन मर चुका है और बदल दिया, रासायनिक fixatives और निर्जलीकरण प्रक्रियाओं के साथ, कुछ मायनों में होने के लिए cytoarchitecture बचाने के लिए नमूनों की आवश्यकता है। इस प्रकार, उच्च संकल्प पर जैविक नमूनों की जांच इलेक्ट्रॉन बीम से विकिरण क्षति, कम विपरीत, झिल्ली की संरचनात्मक विचलन, या यहाँ तक कि कलाकृतियों कि निम्नलिखित निर्जलीकरण और epoxy 8, 9, 10 embedding हो सकता है की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

संरचनात्मक विश्लेषण के लिए अपने मूल रूप में नमूनों संरक्षण "vitrified अनुभागों का क्रायो ईएम" का उपयोग कर या CEMOVIS, एक सेक्शनिंग दृष्टिकोण से प्राप्त किया जा सकता है कितेजी से ठंड और कांच का बर्फ में नमूना एम्बेड करने और एक क्रायोजेनिक तापमान 11, 12 पर ईएम के तहत वर्गों की जांच शामिल है। यह प्रक्रिया इस प्रकार निर्जलीकरण की वजह से कलाकृतियों को नष्ट प्रक्रियाओं 13 वे अभी भी ठोस और पूरी तरह से हाइड्रेटेड हैं, जबकि नमूनों की जांच के लिए अनुमति देता है। हालांकि, इस विधि क्रम बहुत कम तापमान, जो महत्वपूर्ण अतिरिक्त लागत उत्पन्न पर इस अवलोकन अनुमति देने के लिए, क्रायो-ultramicrotomy के लिए अतिरिक्त उपकरणों, साथ ही मानक ईएम पर अतिरिक्त उपकरणों शामिल है। इसके अलावा, CEMOVIS दृष्टिकोण तकनीक immunolabeling, क्योंकि एंटीबॉडी आमतौर पर आर टी पर इनक्यूबेट किया जाना है के उपयोग के निवारण होता है। वैकल्पिक रूप से, यह एक फ्रीज प्रतिस्थापन दृष्टिकोण है, जिसके दौरान क्रायो-तय नमूनों धीरे धीरे जबकि क्रायो-सुरक्षात्मक रसायनों में immerged और वें हैं thawed हैं का उपयोग करके प्रतिरक्षाऊतकरसायन प्रक्रियाओं के साथ ultrastructural विश्लेषण गठबंधन करने के लिए संभव हैएन इस तरह के Lowicryls के रूप में विशेष रेजिन, में एम्बेडेड। पोस्ट-embedding immunolabeling तो ऐसी सामग्री 12 पर किया जा सकता। हालांकि, फ्रीज प्रतिस्थापन और क्रायो-निर्धारण तकनीक समय लगता है। वे अतिरिक्त उपकरणों की स्थापना की आवश्यकता है और अभी भी नमूने जैविक विलायक और रासायनिक बंधक कि cytoarchitecture को बदल सकते हैं को उजागर किया है, एक कम तापमान 14, 15 के उपयोग के बावजूद आवश्यकता होती है। इसलिए, दोनों एल एम और ईएम स्तर, मस्तिष्क के ऊतकों की रासायनिक निर्धारण, विशेष रूप से एक्रोलिन साथ सब पर तकनीकी विकास के बावजूद, ईएम 16 के साथ इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री गठबंधन करने के लिए एक कम लागत और समय कुशल पद्धति बनी हुई है।

पिछले दशकों में, कई प्रयासों के एल्डीहाइड है कि सबसे अच्छा ऊतक संरक्षण प्रदान का एक मिश्रण खोजने के लिए किए गए थे। 1960 के दशक से पहले, केवल रासायनिक बंधक कि ईएम के लिए स्वीकार्य परिणाम दे दी है आज़मियम tetroxide था। हालांकि, आज़मियम tetroxide, बेहद जहरीला और महंगा है इस तरह के मस्तिष्क के रूप में अंगों को ठीक करने के नाड़ी तंत्र के माध्यम से इसके उपयोग प्रतिबंधित। Acrolein पशु ऊतक सेलुलर संरचनाओं 17 के ईएम अवलोकन के लिए उपयुक्त संरक्षण के लिए एक विश्वसनीय पद्धति के रूप में 1950 के दशक में शुरू की गई थी। यह ऊतक और अधिक गहराई से प्रवेश और अन्य एल्डीहाइड जब विसर्जन द्वारा निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया और cytoplasmic घटकों का अच्छा संरक्षण, ऊतक 17 के न्यूनतम संकोचन के साथ की अनुमति देता है तुलना में अधिक तेजी से प्रतिक्रिया करता है। इस तरह की एक विशेषता यह है जब ताजा ऊतक में प्रयोग किया जाता है, इस तरह के एंजाइम और अन्य प्रोटीन 18 के रूप में आणविक यौगिकों, जीने की एक और अधिक सटीक स्थानीयकरण अनुमति देकर एक्रोलिन निर्धारण अन्य एल्डीहाइड पर एक स्पष्ट लाभ देता है। वास्तव में, यह के रूप में यह कुशलतापूर्वक stabili, एक, आसान, कुशल और कम लागत उभयचर और कृन्तकों सहित कई प्रजातियों, में ईएम स्तर पर दृश्य के लिए निर्धारण की पद्धति के रूप में वर्षों के माध्यम से मान्य किया गया हैमाहिर पेप्टाइड और प्रोटीन, प्रतिजनकता को बरकरार रखे हुए है और जब एक और एल्डिहाइड साथ संयोजन में उपयोग लगानेवाला 16, 18, 19, 20, 21 अपेक्षाकृत बरकरार फैटी प्रदान करता है। कृन्तकों में एक्रोलिन निर्धारण के लिए प्रोटोकॉल तब से मानकीकृत और बड़े पैमाने पर इस्तेमाल, विशेष रूप से पिकेल समूह द्वारा, ईएम 16, 22 के लिए दोहरी immunolabeling लागू करने के लिए किया गया है। कुछ समूहों गैर मानव पशु मस्तिष्क के ऊतकों 23 में एक्रोलिन निर्धारण का इस्तेमाल किया है। हालांकि, हमारे ज्ञान करने के लिए, वहाँ केवल एक ही प्रकाशित प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक गैर मानव प्राइमेट में एक्रोलिन कि ईएम immunolabeling 24 के साथ संगत है के साथ रासायनिक निर्धारण का वर्णन है।

इस अनुच्छेद में, हम एक आसान और विश्वसनीय तरीका कुशलता से रासायनिक गैर हम ठीक करने के लिए प्रदान करते हैंएक्रोलिन के साथ एक प्राइमेट दिमाग, पूर्व embedding immunolabeling और पारेषण ईएम परीक्षा के साथ-साथ एक संभावित लंबी अवधि के संरक्षण के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

आचार कथन: जानवरों से जुड़े सभी प्रोटोकॉल Comité डी संरक्षण des Animaux डे ल Université Laval द्वारा अनुमोदित किया गया और देखभाल और उपयोग प्रायोगिक पशु की (सं 2।) करने के लिए पशु की देखभाल की गाइड पर कनाडा परिषद के अनुसार किए गए थे। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित लगभग 800 ग्राम की वयस्क जानवरों के लिए अनुकूलित किया गया था। बंधक की मात्रा जानवर के आकार के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।

1. transcardiac छिड़काव के लिए समाधान की तैयारी

  1. निम्न चरणों का पालन के अनुसार एक 50 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान के 1 एल तैयार करें। छिड़काव से पहले सबसे 24 घंटे में समाधान तैयार और उपयोग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
    1. एक 1 एल बीकर में आसुत जल के 800 एमएल का आकलन करें। द्विक्षारकीय निर्जल सोडियम फॉस्फेट के 5.87 छ जोड़ें (ना 2 HPO 4), अकेले आधार monohydrate सोडियम फॉस्फेट के 1.20 ग्राम (नः 2 पीओ 4 · एच 2 ओ), और 9 ग्रामसोडियम क्लोराइड के (NaCl)। भंग करने के लिए हलचल।
    2. धीरे-धीरे 5 एन NaOH जोड़कर 7.4 पीएच को समायोजित करें। आसुत जल जोड़ें 1 एल की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए
      चेतावनी: NaOH एक संक्षारक रासायनिक यौगिक है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने (पीपीई;। प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, सुरक्षात्मक काले चश्मे, आदि)।
  2. 4% paraformaldehyde (पीएफए) के लिए निम्न चरणों के अनुसार के 2 एल तैयार करें। यह समाधान सर्जरी से पहले अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए तैयार रहना चाहिए और उपयोग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा।
    1. एक 2-एल बीकर में उपाय आसुत जल के 1.5 एल। द्विक्षारकीय निर्जल सोडियम फॉस्फेट के 23.48 ग्राम (ना 2 HPO 4) और एक भस्मक monohydrate सोडियम फॉस्फेट के 4.80 छ जोड़ें (नः 2 पीओ 4 · एच 2 ओ)। भंग करने के लिए हलचल। आसुत जल जोड़ें 2 एल की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए
    2. एक निकाल हुड के नीचे समाधान गरम करें जब तक तापमान लगभग 45 तक पहुँच जाता है - 55 डिग्री सेल्सियस। 60 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी न करें।
    3. धीरे-धीरे समाधान के लिए पीएफए ​​के 80 ग्राम जोड़ें और हलचल जब तक पूरी तरह भंग (लगभग 30 - 60 मिनट)। तापमान की निगरानी के 60 डिग्री सेल्सियस नीचे इसे रखने के लिए रखें।
      चेतावनी: पीएफए ​​इसके पाउडर के रूप में अत्यधिक अस्थिर है। यह आंखों या त्वचा के संपर्क में अत्यधिक अगर विषैला होता है और साँस लेना या घूस के मामले में खतरनाक है। पीपीई पहनने और एक निकाल हुड के नीचे सावधानी के साथ उपयोग करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस और फिल्टर का हल को ठंडा। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. निम्न चरणों का पालन के अनुसार 0.1 एम फॉस्फेट बफर (PB) में 3% एक्रोलिन का 1 एल तैयार करें। पंजाब समाधान छिड़काव करने से पहले अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए तैयार रहना चाहिए।
    चेतावनी: Acrolein बेहद जहरीला है, तो साँस और तत्काल क्षति का उत्पादन कर सकते है। यह भी संक्षारक और बेहद जहरीला है, तो त्वचा के माध्यम से अवशोषित है। यह कैसरजन और mutagenic है। उपयुक्त पीपीई पहनें और एक निकाल हुड के नीचे का उपयोग करें।
    1. आसुत जल के 800 एमएल का आकलन करें। द्विक्षारकीय निर्जल सोडियम फॉस्फेट के 8.66 छ जोड़ें (Na 2 4 HPO) और एक भस्मक monohydrate सोडियम फॉस्फेट के 5.38 ग्राम (नः 2 पीओ 4 · एच 2 ओ)। हलचल जब तक सभी लवण भंग। आसुत जल जोड़ें 1 एल की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें।
    2. सर्जरी से पहले, एक 1 एल कांच कंटेनर के लिए पंजाब समाधान के 900 एमएल हस्तांतरण और एक निकाल हुड के नीचे 97% एक्रोलिन समाधान के 30.94 एमएल जोड़ें। पंजाब समाधान जोड़े 1 एल और हलचल की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए। समाधान फ़िल्टर और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।

2. transcardiac छिड़काव और मस्तिष्क विच्छेदन

  1. पूरे शल्य प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर समाधान रखें। और जब तक कोई हवा नली में रहता है पर पंप मोड़; (50 मिमी पीबीएस) पहला समाधान इस्तेमाल किया जा करने के लिए ट्यूब रखकर पंप तैयार करें। एक मकाक बंदर के transcardiac छिड़काव के लिए, एक 21 जी सुई का उपयोग करें और बहिर्वाह पर लगभग 80 एमएल / मिनट की स्थापना की।
  2. एक मिश्रण का एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ पशु anesthetizeketamine (20 मिलीग्राम / किग्रा), xylazine (4 मिलीग्राम / किग्रा), और acepromazine (0.5 / किलो मिलीग्राम) की संरचना कंपनी है। के तहत isoflurane (3%) बेहोश करने की क्रिया पशु बनाए रखें।
  3. एक निकाल मेज पर जानवर के अंगों देते हैं।
  4. एक छुरी के साथ, बगल के लिए त्वचा को हटा दें। पेट की मांसपेशियों को काटें। पसलियों ध्यान से महत्वपूर्ण अंगों से बचने के पार्श्व में कटौती के लिए हेवी-ड्यूटी शल्य कैंची का प्रयोग करें।
  5. शल्य कैंची के साथ डायाफ्राम कट और दिल को बेनकाब करने के रिब पिंजरे बढ़ा। एक बार जब डायाफ्राम कट जाता है, जल्दी से आगे बढ़ना है, क्योंकि दिल ही मिनटों के भीतर की धड़कन बंद हो जाएगा।
  6. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ पेरीकार्डियम निकालें और बाएं वेंट्रिकल में सुई डालें। एक छुरी के साथ, ध्यान से सही अलिंद लिए एक छोटा सा छांटना बनाते हैं। जल्दी 72 एमएल / मिनट पंप शुरू और जगह में सुई पकड़ो। यदि संभव हो, क्रम में दिल की तुलना में कम स्तर पर उसके सिर के लिए पशु झुका सकते हैं।
    ध्यान दें: जब सुई डालने interventricular पट बेध के प्रति सावधान रहें।
    1. Rinsई फेफड़ों तक पीबीएस के लगभग 300 एमएल के साथ खून सफेद होते हैं और कोई रक्त दायें अलिंद से बाहर आता है।
  7. पंप बंद करो, जल्दी से 3% एक्रोलिन समाधान के लिए नली / ट्यूब हस्तांतरण, और पंप फिर से शुरू करते हैं। एक बार दिल धड़कन बंद कर दिया है धीरे-धीरे 80 एमएल / मिनट के लिए पंप की गति बढ़ा सकते हैं। एक्रोलिन समाधान के लगभग 500 एमएल छिड़कना।
  8. पंप बंद करो, जल्दी से 4% पीएफए ​​समाधान के लिए नली हस्तांतरण, और पंप फिर से शुरू करते हैं। यह कदम पीएफए ​​का लगभग 1 एल की आवश्यकता है।
    ध्यान दें: निर्धारण पूरा हो गया है जब आगे के हाथ कठोर होते हैं और गर्दन कड़ी है।
  9. सिर कट और ध्यान से खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क काटना। शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ मस्तिष्क को नुकसान नहीं करने पर ध्यान दें। जब मस्तिष्क पीला (रक्त के कोई निशान) और कठोर (चित्रा 1 ए) है छिड़काव इष्टतम है।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​में बरकरार मस्तिष्क को डुबो दें।
  11. क्रमानुसार एक शीतलन vibratome (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ मस्तिष्क में कटौती50 सुक्ष्ममापी मोटी वर्गों में वांछित विमान में और उन्हें पीबीएस (0.1 एम) (चित्रा 1 बी) में एकत्र।
    नोट: यह कदम वांछित प्रोटोकॉल के अनुसार कई मायनों में किया जा सकता है। गोलार्द्धों काटने, या रखा पूरे vibratome से पहले अलग किया जा सकता। यदि मस्तिष्क vibratome मंच के लिए बहुत बड़ा है, यह छोटे खंडों में कटौती की जा सकती है। इस कदम के बाद, वर्गों एक लंबे एक एंटीफ्ऱीज़र समाधान 40% पंजाब (50 मिमी), 30% ग्लिसरॉल, और 30% इथाइलीन ग्लाइकॉल से बना में -30 डिग्री सेल्सियस पर समय की अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है।

3. पूर्व embedding Immunohistochemistry (चित्रा 1C)

  1. Tris-buffered खारा की एक 4 एल शेयर समाधान (टीबीएस, 50 मिमी, पीएच 7.6) के रूप में तैयार करें।
    1. उपाय आसुत जल के 2L एक 4 एल बीकर में, trihydroxymethyl aminomethane के 24.23 ग्राम जोड़ने (थाम, सी 4 एच 11 सं 3) को भंग करने, और हलचल।
    2. 1 एन एचसीएल के लगभग 148 एमएल के साथ 7.6 पीएच को समायोजित करें। एसिड Cauti साथ जोड़ा जाना चाहिएपर 7.6 के नीचे एक पीएच पहुंचने से बचने के। कुल मात्रा होना चाहिए 4 एल
      चेतावनी: एचसीएल उच्च संक्षारक है। उपयुक्त पीपीई पहनें।
  2. (कदम 2.11 से) का चयन वर्गों के हित के क्षेत्र युक्त ईएम इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए संसाधित करने के लिए।
  3. एंटीफ्ऱीज़र समाधान कुल्ला करने के लिए आर टी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में मुक्त रूप से प्रवाहित वर्गों 3x (0.1 एम, पीएच 7.4) को धो लें।
  4. NaBH 4 के एक 0.5% समाधान पीबीएस में पतला तैयार करें।
    1. NaBH 4 की 0.05 ग्राम वजन और पीबीएस के 10 एमएल में यह पतला। ढको मत। सिर्फ उपयोग करने से पहले इस समाधान तैयार करें।
  5. आरटी पर 30 मिनट के लिए ताज़ा तैयार NaBH 4 समाधान में वर्गों सेते हैं। धीरे रॉक। ढको मत।
  6. आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में धो 3x, प्रतिक्रिया गैस से कोई भी जब तक सख्ती कमाल बनी हुई है।
  7. 2% उचित सामान्य सीरम और 0.5% ठंड मछली जिलेटिन पीबीएस में पतला साथ ईएम के लिए एक अवरुद्ध समाधान तैयार करें।
    नोट: मात्रा shoulक्रम में गणना की जा d निम्नलिखित तीन चरण के लिए पर्याप्त है। एक ही जानवरों की प्रजातियों माध्यमिक एंटीबॉडी की मेजबानी से बनाया गया एक सीरम का प्रयोग करें। प्रतिजन पुनर्प्राप्ति तरीकों या ट्राइटन की थोड़ी मात्रा के अलावा के उपयोग से बचें (एंटीबॉडी के प्रवेश को बढ़ाने के लिए), के रूप में इन तरीकों में काफी ऊतक के गुणवत्ता से समझौता।
  8. आरटी पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में वर्गों सेते हैं। धीरे रॉक।
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान अवरुद्ध समाधान में पतला तैयार करें।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता आमतौर पर एल एम इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए के रूप में ही है, लेकिन विभिन्न एंटीबॉडी सांद्रता के साथ आयोजित करने पर विचार परीक्षण पहले से, जैसा कि कुछ प्राथमिक प्रतिरक्षी एक्रोलिन के साथ काम नहीं कर सकते हैं। (- 2% 0.1) और transcardiac छिड़काव के लिए 4% पीएफए ​​और इसी तरह के परिणाम प्राप्त यदि हां, तो यह glutaraldehyde के मिश्रण का इस्तेमाल करना संभव है। का अनुकूलन ऊष्मायन समय और तापमान के साथ-साथ।
  10. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में वर्गों सेतेरात भर कोमल कमाल के साथ आर टी पर। एक पहले से परीक्षण किया ऊष्मायन समय और तापमान का प्रयोग करें।
  11. कोमल कमाल के साथ आर टी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों 3x धो लें।
  12. biotinylated माध्यमिक अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी के 1,000 समाधान एक 1: तैयार करें।
    ध्यान दें: माध्यमिक एंटीबॉडी मेजबान प्राथमिक एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया प्रजातियों के खिलाफ उठाया जाना चाहिए।
  13. आरटी पर 1.5 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में वर्गों सेते हैं। धीरे रॉक।
  14. एक avidin-बायोटिन-peroxidase (एबीसी) समाधान में कम से कम 60 मिनट माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के अंत से पहले तैयार करें।
    1. 8.80 μL / समाधान ए और बी की एमएल मापने और उन्हें पीबीएस में पतला करने के लिए एक कैलिब्रेटेड विंदुक का प्रयोग करें।
    2. आरटी पर कम से कम 60 मिनट के लिए हल्का रॉक पूरा avidin और बायोटिन अणुओं के बीच बंधन अनुमति देने के लिए।
  15. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में ऊष्मायन के बाद, आर टी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 3x धोने।
  16. इसलिए एबीसी में वर्गों सेतेआरटी पर 1 घंटे के लिए lution। धीरे रॉक।
  17. कोमल कमाल के साथ आर टी पर 10 मिनट के लिए टीबीएस में पीबीएस में एक बार और दो बार धोएं।
  18. 0.005% एच 2 ओ 2 टीबीएस में पतला के साथ 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (थपका) के एक ताजा समाधान तैयार करें।
    1. डी ए बी की 12.5 मिलीग्राम वजन और ठंडे टीबीएस के 25 एमएल में यह पतला। लाइट से बचाएँ।
      चेतावनी: डी ए बी पाउडर अत्यधिक अस्थिर और हानिकारक है अगर साँस। यह कैंसर और टेराटोजेनिक है। इस प्रकार, गर्भवती या नर्सिंग महिलाओं को इस उत्पाद जब पतला हेरफेर नहीं करना चाहिए, भले। एक N95 मुखौटा का उपयोग करें जब जोड़ तोड़ और पीपीई पहनने।
    2. समाधान फ़िल्टर और सिर्फ उपयोग करने से पहले 30% एच 2 ओ 2 के 4.5 μL जोड़ें।
  19. आरटी पर 3 से 7 मिनट के लिए डी ए बी समाधान में वर्गों सेते हैं। धीरे रॉक।
    ध्यान दें: भूरे रंग के तलछट आदेश पृष्ठभूमि धुंधला के एक उच्च स्तर से बचने के लिए बहुत गहरे नहीं होना चाहिए। ऊष्मायन समय के हिसाब से अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  20. जल्दी से दो बार धोने से प्रतिक्रिया बंद करोठंड टीबीएस में, तो दो बार आरटी पर ठंड टीबीएस में 10 मिनट के लिए, पंजाब में दो बार 10 मिनट के, हल्के कमाल के साथ किया गया।
    नोट: पंजाब (और नहीं पीबीएस) के उपयोग के आदेश के रूप में यह आज़मियम और फार्म क्रिस्टल के साथ प्रतिक्रिया होगी, सोडियम क्लोराइड के किसी भी निशान को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है।

4. इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अवलोकन के लिए Osmification और एम्बेडिंग

  1. एक (Oso 4) 1% आज़मियम tetroxide का समाधान पंजाब में पतला तैयार करें। लाइट से बचाएँ।
    चेतावनी: आज़मियम बेहद जहरीला है और त्वचा, आंखों, या मुँह के साथ संपर्क में नहीं आना चाहिए और साँस नहीं किया जाना चाहिए। यह मौत है, तो किया जाता हो सकता है। यह केवल एक में उतार हुड के नीचे और उपयुक्त पीपीई के साथ किया जाना चाहिए।
  2. Oso 4 निकाल हुड (आंदोलन के बिना) के तहत आरटी पर 30 मिनट के लिए समाधान में वर्गों सेते हैं और उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए। पूरी तरह से Oso 4 समाधान जोड़ने से पहले वर्गों समतल।
    नोट: वर्गों बहुत ही गहरे और री बनgid और इस कदम निम्नलिखित देखभाल के साथ चालाकी से किया जाना चाहिए।
  3. osmification दौरान पानी से बचाने वाली क्रीम epoxy राल तैयार करें।
    1. epoxy राल मिश्रण (epoxy राल की 20 ग्राम, hardener के 20 ग्राम, त्वरक की 0.6 ग्राम और plasticizer के 0.4 ग्राम) के प्रत्येक घटक की उचित मात्रा में एक बड़े प्लास्टिक कप में जोड़े। एक लकड़ी की छड़ी या प्लास्टिक विंदुक के साथ हलचल जब तक एक सजातीय भूरे रंग प्राप्त की है।
      नोट: यह प्रत्येक घटक की सही अनुपात का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. उचित आकार के एल्यूमीनियम कप के बराबर मात्रा में स्थानांतरण, वर्गों की संख्या के आधार संसाधित करने के लिए। यह आराम करने के लिए अनुमति दें।
  4. धो osmificated वर्गों कम गति कमाल के साथ आर टी पर 10 मिनट के लिए पंजाब में 3 गुना।
  5. 2 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गीकृत इथेनॉल के निम्नलिखित श्रृंखला में वर्गों निर्जलीकरण: 35% इथेनॉल में 2 बार; 1 50 में प्रत्येक, 70, 80, 90, और 95% इथेनॉल समय; और 100% इथेनॉल में 3 गुना।
  6. dehydrati पूरा करने के लिए कांच की शीशियों को वर्गों स्थानांतरणप्रोपलीन ऑक्साइड में 2 मिनट के लिए वर्गों 3 बार विकासशील द्वारा प्रक्रिया पर।
    चेतावनी: Propylene ऑक्साइड एक अत्यधिक अस्थिर और विषाक्त कार्बनिक विलायक है। यह संपर्क के मामले में या साँस या किया जाता है, तो आँखें या त्वचा में गंभीर क्षति हो सकती। यह एक ग्रेड 2 कासीनजन पदार्थ के रूप में वर्गीकृत किया गया है। यह केवल एक में उतार हुड के नीचे और पीपीई के साथ किया जाना चाहिए। यह भी अत्यंत ज्वलनशील होते हैं और किसी भी गर्मी स्रोत से दूर रखा जाना चाहिए।
    नोट: इस कदम से पहले वर्गों को ध्यान से, कांच की शीशियों में स्थानांतरित किया जाना चाहिए के बाद से प्रोपलीन ऑक्साइड एक कार्बनिक विलायक है और प्लास्टिक के साथ असंगत है। इस बिंदु पर, वर्गों बहुत नाजुक होते हैं और देखभाल के साथ चालाकी से किया जाना चाहिए। धारा वैकल्पिक रूप से कदम 4.5 से पहले कांच की शीशियों को हस्तांतरित किया जा सकता है।
  7. स्थानांतरण वर्गों ध्यान से, एक के बाद एक, एल्यूमीनियम कप में और जितना संभव हो उतना हवा के साथ संपर्क से बचें। फ्लैट एम्बेड पहले से मिश्रित पानी से बचाने वाली क्रीम epoxy राल में वर्गों और उन्हें ventin के तहत रात भर सेतेआरटी पर छ हुड।
    नोट: इस चरण में, वर्गों पूरी तरह से निर्जलित और बहुत नाजुक होते हैं और देखभाल के साथ चालाकी से किया जाना चाहिए।
  8. खनिज तेल का उपयोग करना, तेल प्लास्टिक coverslips के साथ तेल में लिपटे गिलास स्लाइड तैयार करते हैं।
  9. ज्यादा से ज्यादा 12-15 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम कप विकासशील द्वारा राल नरम। ध्यान से गिलास स्लाइड के तेल तरफ वर्गों समतल। greased coverslip रखें और ध्यान से किसी भी शेष हवा बाहर धक्का।
  10. 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड सेते हैं।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है करने के लिए 48 घंटे ऊष्मायन समय से अधिक नहीं, के रूप में राल बहुत कठिन हो जाएगा है।
  11. प्लास्टिक coverslip निकालें।

5. Ultrathin सेक्शनिंग और अवलोकन के लिए नमूना तैयार करना एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना

  1. ब्याज की क्षेत्र खोजने के लिए दूरबीन का उपयोग करें और एक छुरी के साथ लगभग 1 मिमी 2 के एक छोटे चौकोर टुकड़ा काट।
  2. एक राल ब्लॉक के टिप फ़ाइल और qu गोंदadrangular टुकड़ा यह पर (चित्रा 1C)। गोंद कम से कम 1 घंटे या रात भर सेक्शनिंग से पहले के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
  3. एक ultramicrotome का उपयोग करना, 80 सुक्ष्ममापी मोटी वर्गों (चित्रा 1 डी) में चौकोर टुकड़ा काट।
    1. ऊर्ध्वाधर स्थिति में एक ultramicrotome डेक में राल ब्लॉक रखें और, एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग कर, धीरे-धीरे चिकनी पक्षों के साथ एक समलम्ब बनाने के लिए राल ब्लॉक के प्रत्येक पक्ष काटा।
    2. इसके क्षैतिज स्थिति में डेक रखो और ब्लॉक तक समलम्ब की लंबाई की ओर नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहा है बारी बारी से।
    3. चौकोर टुकड़ा की सतह ट्रिम करने के लिए एक हीरे की काट-छाँट उपकरण या एक गिलास चाकू का प्रयोग करें। ultramicrotome 1 मिमी / s पर 300 सुक्ष्ममापी मोटी वर्गों में कटौती करने के लिए सेट करें। खड़ी हो चौकोर टुकड़ा के समानांतर और लगभग 1 ° का एक बहुत छोटा क्षैतिज कोण प्रदर्शित करने के लिए करने के लिए चाकू को समायोजित करें।
      ध्यान दें: इस कोण लगभग ख की सतह के समानांतर उपयोगकर्ता ऊतक दृष्टिकोण करने की अनुमति देगाताला, जहां immunolabeled तत्वों अधिक पाया जाने की संभावना है। हीरा ट्रिमिंग उपकरण के साथ इन मानकों का उपयोग कर, राल एक चमकदार सफेद रंग प्रदर्शित करता है। जब ऊतक में कटौती की जा रही है, यह एक बैंगनी या हरे रंग में बदल जाएं।
    4. एक अति 45 ° हीरा एक नाव आसुत जल से भरा 80 सुक्ष्ममापी मोटी वर्गों में कटौती करने के साथ सुसज्जित चाकू का प्रयोग करें, कागज xylene में टिप को अवशोषित के एक टुकड़े के साथ उन पर पारित करके वर्गों को सुगम, और formvar में लिपटे निकल स्लॉट ग्रिड या पर सीरियल अनुभागों को एकत्र नंगे 150 जाल तांबा ग्रिड (चित्रा 1E)।
  4. एक ग्रिड भंडारण बॉक्स में ग्रिड रखें।
  5. नेतृत्व साइट्रेट के साथ ग्रिड दाग।
    1. फ़िल्टर किए गए नेतृत्व साइट्रेट शेयर समाधान के 1 समाधान और फ़िल्टर्ड आसुत जल: एक 5 एमएल सिरिंज और एक 1 तैयार करने के लिए एक 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का प्रयोग करें। प्रकाश से बचाने के।
      नोट: नेतृत्व साइट्रेट का जायजा समाधान ठोस depos के गठन से बचने के लिए हर महीने नए सिरे से बनाया जाना चाहिएआईटी इस। शेयर नुस्खा के लिए सामग्री डाटा शीट देखें। इसके अलावा, यदि ग्रिड के कई श्रृंखला दाग होने की जरूरत है, पतले घोल को बदल जब यह दूधिया हो जाता है।
    2. पतले घोल की एक बूंद पर प्रत्येक ग्रिड रखें, समाधान के साथ संपर्क में अनुभाग के साथ। 3 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. ग्रिड धारण करने के लिए छोटा सा चिमटी का प्रयोग करें, और अच्छी तरह से दो आसुत जल से युक्त बीकर में कुल्ला।
    4. धीरे अवशोषित कागज का उपयोग करके अतिरिक्त पानी निकाल दें। एक ग्रिड बॉक्स में ग्रिड की दुकान। (; चित्रा 1F TEM) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्गों की जांच से पहले 30 मिनट के इंतजार करें।

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Representative Results

इस खंड में, हम प्रतिनिधि परिणाम है कि, अवलोकन निम्नलिखित प्राप्त किया गया संचरण ईएम स्तर पर, immunostained प्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों रासायनिक 3% एक्रोलिन का एक मिश्रण और 4% पीएफए ​​के साथ तय की प्रस्तुत करते हैं। के रूप में अपेक्षाकृत बरकरार माइलिन आवरण और डबल झिल्ली (चित्रा 2A) की साफ दृश्य ने संकेत दिया हम, फैटी का अच्छा संरक्षण हासिल की। Synaptic संपर्क, सूक्ष्म पर्यावरण से न्यूरोनल तत्वों, के साथ आसानी से पहचाना जा सकता है (चित्रा 2 बी)। साथ diaminobenzidine (थपका) immunoprecipitate लेबल neuronal तत्वों को उनके भरा कोशिका द्रव्य या अक्षतंतुद्रव्य द्वारा ईएम स्तर पर पहचाने जाते हैं। प्लाज्मा झिल्ली और अंगों की बाहरी सतह भी आम तौर पर इलेक्ट्रॉन घने तलछट (चित्रा 3) के साथ पंक्तिवाला रहे हैं।

इस विशेष प्रयोग में, हम एंटीबॉडी आगा इस्तेमाल कियासेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SERT), कोलीन acetyltransferase (चैट), या tyrosine hydroxylase (वें) बाह्य (GPe) या आंतरिक (जीपीआई) गिलहरी बंदर ग्लोबस पैलिडस (चित्रा 3) के खंड में immunolabeled न्यूरोनल तत्वों कल्पना करने के लिए Inst। ऐसा करने के लिए हम बंधक के रसायन होते हैं जो प्रतिजनकता को संरक्षित फैटी के साथ ही का एक संयोजन का इस्तेमाल किया, एक विस्तृत रूपात्मक जांच की इजाजत दी। कई एंटीबॉडी transcardiac छिड़काव ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा सकता है, तो हम अनुशंसा करते है कि उपयोगकर्ताओं को, पहले से अनुकूलन एकाग्रता परीक्षण करने के बाद से कुछ प्राथमिक प्रतिरक्षी एक्रोलिन निर्धारण के साथ इष्टतम immunolabeling प्रदान करने के लिए नहीं जाना जाता है। वैकल्पिक रूप से, जब एंटीबॉडी एक्रोलिन निर्धारण के साथ इष्टतम immunolabeling प्रदान नहीं करते हैं, 0.1 की एक कमजोर पड़ने - 4% में 2% glutaraldehyde पीएफए ​​transcardiac छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह ऊतक गुणवत्ता अपेक्षाकृत कई के लिए संरक्षित प्रतिजनकता साथ एक्रोलिन निर्धारित मस्तिष्क के ऊतकों के बराबर प्रदान करता हैएंटीबॉडी (चित्रा 4)।

अंत में, हम अनुचित जोड़तोड़ निम्नलिखित प्राप्त ईएम photomicrographs के विशिष्ट उदाहरण प्रदान करते हैं। बदल मेलिन शीथ में एक गरीब निर्धारण परिणाम (चित्रा 5 ए, बी) और कठिनाइयों neurites की डबल झिल्ली (चित्रा 5C, डी), एक विश्वसनीय पहचान और लेबल और लेबल-रहित न्यूरोनल तत्वों के विश्लेषण को रोकने के दृश्य में। डी ए बी समाधान में एक अत्यधिक ऊष्मायन समय अत्यधिक पृष्ठभूमि और गैर विशिष्ट धुंधला है कि संभावित गलत सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं बनाता है। पृष्ठभूमि या गैर विशिष्ट धुंधला कभी कभी न्यूरोनल तत्वों के रूप में अधूरा धुंधला दिखाई देता है (चित्रा 6A, बी), लेकिन अधिक बार के रूप में कई और बारीकी से रंगीन न्यूरोनल तत्वों (चित्रा 6C, डी) स्थित है। अवरुद्ध समाधान में डिटर्जेंट के उपयोग में काफी ऊतक की गुणवत्ता को बदल देता है। यह लापता को जन्म दे सकतीलेबल तत्वों (चित्रा 7A) या मेलिन शीथ (चित्रा 7B) और सेलुलर झिल्ली (चित्रा 7C) की गिरावट, सूक्ष्म पर्यावरण मुश्किल से किसी तीव्र व्याख्या प्रतिपादन में अंगों। अंत में, इस तरह के धोने के समाधान सोडियम क्लोराइड युक्त का उपयोग कर के रूप में osmification प्रक्रिया में एक misstep,, अविश्वसनीय परिणाम जहां सेलुलर संरचनाओं भेद करने के लिए (चित्रा 7 दिन) मुश्किल हो जाता है पैदा करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल के आवश्यक कदम के Schematics। बंदर मस्तिष्क (ए) एक शीतलन vibratome (बी) के साथ धारावाहिक वर्गों में काटा जाता है। यह तो के लिए संसाधित किया जाता है पूर्व embedding इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, जिसके बाद ब्याज की क्षेत्र एक राल ब्लॉक (सी) की नोक पर रख दिया गया और 80 एनएम मोटी secti में काटा जाता हैएक ultramicrotome (डी) के साथ ऑन। Ultrathin वर्गों तो, नंगे 150 जाल तांबा ग्रिड या formvar में लिपटे निकल ग्रिड (ई) पर एकत्र कर रहे हैं नेतृत्व साइट्रेट और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एफ) के तहत मनाया जा करने के लिए तैयार के साथ दाग। स्केल सलाखों: 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: Acrolein-पीएफए transcardiac छिड़काव के बाद अच्छी तरह से संरक्षित प्राइमेट मस्तिष्क ऊतक। गिलहरी बंदर (Saimiri sciureus) जीपीआई (ए) और GPe (बी) दिखा प्रतिनिधि के मस्तिष्क के ऊतकों की इलेक्ट्रॉन micrographs एक्रोलिन-पीएफए transcardiac छिड़काव और immunoperoxidase-diaminobenzidine तकनीक प्रदर्शन के बाद अच्छी तरह से संरक्षित सामग्री। उन्हेंएक्सोन (क) की ब्रेस्ट्स म्यान (ए में Arrowhead देखें) अपेक्षाकृत सुरक्षित है और सामान्य फैटी अच्छी तरह से ए और बी वृक्ष के समान प्रोफाइल (घ) में संरक्षित है, छोटे बिना मेलिनकृत एक्सोन (क), और अक्षतंतु varicosities (एवी) आसानी से कर सकते हैं पहचाना जा। एक अक्षतंतु अपस्फीति एक वृक्ष के समान प्रोफ़ाइल (घ) के साथ (तीर के बीच) एक सममित synaptic संपर्क स्थापित करने का एक उदाहरण बी में दिखाया गया है। स्केल बार: 1 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: Immunoperoxidase-diaminobenzidine तकनीक का उपयोग करके गिलहरी बंदर GPe और Choline एसटीट्रांसफेरासी के लिए जीपीआई immunolabeled (चैट), सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SERT), और tyrosine hydroxylase (वें) से धारा। इम्यूनोलेबल तत्वों को आसानी से अपने कोशिका द्रव्य या अक्षतंतुद्रव्य इलेक्ट्रॉन घने डी ए बी तलछट से भर से पहचाना जा सकता। लेबल लगाए गए वृक्ष के समान प्रोफाइल, भरा microfilaments द्वारा मान्यता प्राप्त हैं के रूप में एक है, जहां जीपीआई में एक चैट-immunostained डेन्ड्राइट लेबल नहीं किए गए अक्षतंतु अपस्फीति (एवी) से (तीर के बीच) एक synaptic संपर्क प्राप्त करता है में देखा। बी में इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ एक अपेक्षाकृत अक्षुण्ण माइलिन आवरण जिसका अक्षतंतुद्रव्य वें के लिए immunolabeled है GPe में एक मेलिनकृत अक्षतंतु को दर्शाता है। सी में उदाहरण जीपीआई में एक अक्षतंतु अपस्फीति SERT के लिए immunolabeled से पता चलता है और एक डेन्ड्राइट (घ) के साथ (तीर के बीच) एक सममित synaptic संपर्क स्थापित करने के लिए देखा जाता है। इस उदाहरण में, डी ए बी लाइनों प्लाज्मा झिल्ली और अंगों (माइटोकांड्रिया और synaptic vesicles) की बाहरी सतह तलछट। अक्षतंतु डी में दिखाया गया है अपस्फीति GPe में मनाया और वें के लिए immunolabeled और डी ए बी का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता था पूरी तरह axop भरने वेगlasm, synaptic पुटिका के साथ दिखाई देता है लेकिन चित्रित करने के लिए और अधिक कठिन जा रहा है। सूक्ष्म पर्यावरण के तत्वों को आसानी से पहचाना जा सकता है के रूप में मेलिनकृत और बिना मेलिनकृत एक्सोन (क) और सामयिक डेन्ड्राइट (घ) लेबल अक्षतंतु अपस्फीति आसपास के द्वारा उदाहरण। इलेक्ट्रॉन micrographs 25, 26, 27 से संशोधित कर रहे हैं। स्केल बार: 1 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: के बाद glutaraldehyde-पीएफए transcardiac छिड़काव प्राइमेट मस्तिष्क ऊतक के उदाहरण। Performi के बाद मकाक बंदर (macaca fascicularis) GPe (ए) और जीपीआई (BD) के मस्तिष्क के ऊतकों की प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन micrographs0.2% glutaraldehyde के साथ एनजी transcardiac छिड़काव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SERT) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ 4% पीएफए ​​और immunoperoxidase-diaminobenzidine तकनीक के साथ मिश्रित। चित्र 2 में के रूप में, immunolabeled तत्वों को उनके कोशिका द्रव्य और अक्षतंतुद्रव्य इलेक्ट्रॉन घने डी ए बी तलछट से भर से पहचाना जा सकता। जनरल फैटी अपेक्षाकृत बरकरार है और सूक्ष्म पर्यावरण के तत्वों को आसानी से पहचाना जा सकता है के रूप में मेलिनकृत और बिना मेलिनकृत एक्सोन (क) और सामयिक डेन्ड्राइट (घ) और अक्षतंतु varicosities (ए वी) लेबल अक्षतंतु varicosities आसपास के द्वारा दिखाया गया है, चित्रा 2 में वर्णित है। हालांकि, फैटी की गुणवत्ता में विसंगति, अच्छी तरह से परिभाषित प्लाज्मा झिल्ली (तीर) द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, लेकिन अपेक्षाकृत क्षतिग्रस्त माइलिन आवरण (तीर) ध्यान दें। स्केल बार: 1 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्र 5: प्राइमेट मस्तिष्क ऊतक प्राप्त के उदाहरण एक असफल transcardiac छिड़काव के बाद। एक असफल रासायनिक निर्धारण से परिणाम गिलहरी बंदर जीपीआई में यहां दिए गए हैं (ए - बी) और GPe (सी - डी) transcardially 0.9% सोडियम क्लोराइड धोने के समाधान और ठंडा 4% की एक मिश्रण के साथ भरकर रखा पीएफए और 15% रंगाई एसिड पतला 0.1 एम पंजाब में (7.4 पीएच)। दिमाग 4% पीएफए ​​और 30% sucrose में 4 डिग्री सेल्सियस पर बाद तय 1 घंटे और एक ठंडा vibratome साथ 60 सुक्ष्ममापी मोटी सैजिटल वर्गों में काट रहे थे। अनुपयुक्त तय मस्तिष्क के ऊतकों, साथ ही धुंधली या अपरिभाषित प्लाज्मा झिल्ली (सी और डी, उदाहरण के लिए तीर देखें) द्वारा एक क्षतिग्रस्त माइलिन आवरण (ए और बी, तीर) द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है। विभिन्न neuronal तत्वों dif कर रहे हैंficult पहचान करने के लिए, फैटी अविश्वसनीय के किसी भी व्याख्या हो जाता है। स्केल बार: 1 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: गिलहरी बंदर GPe में गैर-विशिष्ट चैट immunolabeling के उदाहरण। पृष्ठभूमि धुंधला या गैर विशिष्ट immunolabeling कभी कभी, ईएम बड़े सेलुलर तत्वों के रूप में आंशिक धुंधला नीचे दिखाई देता है के रूप में में एक सचित्र - बी (तीर)। इस तरह के unspecific धुंधला immunostained वर्गों की सतह पर अधिक बार दिखाई देता है। गैर विशिष्ट immunolabeling के अन्य उदाहरण छोटे, बिना मेलिनकृत एक्सोन आंशिक रूप से या पूरी तरह से डी ए बी से भरा है और बहुत से एक एक के पास स्थित आह्वान बहुत छोटे तत्वों के लगातार अवलोकन शामिलnother, के रूप में सी और डी में तीर द्वारा प्रदर्शन किया। स्केल बार: 1 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्र 7: क्षतिग्रस्त गिलहरी बंदर GPe इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करना में missteps के बाद ऊतक। इस तरह के ट्राइटन X-100 के रूप में डिटर्जेंट, का उपयोग करते हैं, अवरुद्ध समाधान, यहां तक कि 0.02% की एक कम एकाग्रता पर में, काफी फैटी की अखंडता डेन्ड्राइट की कोशिका द्रव्य (ए) या अक्षतंतु के माइलिन आवरण को नुकसान पहुँचाए से (बदल बी )। विभिन्न neuronal तत्वों के बाद से प्लाज्मा झिल्ली क्षतिग्रस्त और चित्रित करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं, एक दूसरे के (सी) से भेद करना मुश्किल भी कर रहे हैं। osmification प्रक्रिया als हैओ नमूना तैयार करने में एक महत्वपूर्ण कदम। धोने के समाधान (डी) में सोडियम क्लोराइड के उपयोग के ऊतक के निर्धारण को बदल देता है, बाद में विश्लेषण प्रतिपादन मुश्किल। स्केल बार: 800 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम गैर मानव प्राइमेट और ईएम नमूना परीक्षा के लिए उपयुक्त पूर्व एम्बेडिंग इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के transcardiac छिड़काव के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हालांकि ठेठ क्रायो-ईएम, इस तरह के CEMOVIS के रूप में, मस्तिष्क फैटी का एक अच्छा संरक्षण प्रदान करता है, यह भी इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री 12 के उपयोग की सीमा। क्रायो-प्रतिस्थापन और Tokuyaso तकनीक सहित अन्य तकनीकों, की अनुमति के बाद embedding इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, लेकिन इन तकनीकों की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक अतिरिक्त उपकरणों की वजह से महंगी होती हैं और समय लेने वाली और कौशल को चुनौती देने 12, 14, 15 हो सकता है। इसके अलावा, आदेश कुशलतापूर्वक क्रायो-निर्धारण विधि का उपयोग करने में, नमूना (मोटाई में 200 सुक्ष्ममापी अप करने के लिए जब उच्च दबाव वायुमंडलीय दबाव 29 में ठंड से 28 और 10 सुक्ष्ममापी का प्रयोग करके) अपेक्षाकृत छोटे हो गया है। आदर्श रूप में, अच्छा पाने के लिएप्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों की क्रायो-निर्धारण के साथ परिणाम, नमूना ब्याज की क्षेत्र के सटीक स्थान खोजने में समस्याओं के कारण, एक बायोप्सी से लिया जाना चाहिए। यह समस्या stereotaxic निर्देशांक का उपयोग करके उन्हें धोखा दिया जाना चाहिए। एक्रोलिन और पूर्व एम्बेडिंग तकनीक ऊपर प्रस्तावित के साथ रासायनिक निर्धारण एक आसान, कम लागत, समय, कुशल, और प्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों की नमूना तैयार करने के लिए विश्वसनीय विधि और ईएम के लिए immunolabeling प्रदान करता है। इन कदमों का अनुसरण करके एक प्रतिजनकता के साथ एक अच्छी तरह से संरक्षित फैटी प्राप्त सबसे प्रोटीन की immunolabeling के लिए अनुमति देने के लिए होगा। हालांकि, ईएम के लिए रासायनिक निर्धारण भी अपने नुकसान है। सबसे पहले, जबकि इस तरह के एक्रोलिन के रूप में बंधक समाधान मस्तिष्क के ऊतकों की रूपात्मक विवरण की रक्षा, यह संभव है कि रासायनिक निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान कुछ रूपात्मक परिवर्तन होते हैं और उन है कि CEMOVIS या क्रायो-प्रतिस्थापन तकनीक के साथ प्राप्त किया जाएगा की तुलना में परिणामों को बदल सकते। दूसरा, निर्धारण की प्रक्रिया औरबाद में निर्जलीकरण बाह्य तरल पदार्थ की सबसे हटाने और सेलुलर घटकों एक साथ निचोड़, ऊतक के दबाव है कि काफी अपने आकार को संशोधित करता है और क्रायो-तय कोशिकाओं 21, 30 की तुलना में आकार का कारण बन एम्बेडिंग राल के लिए की जरूरत है। बहरहाल, एल्डिहाइड निर्धारण दुनिया भर के कई प्रयोगशालाओं में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है और व्यापक रूप से न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं की ultrastructural सुविधाओं के अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय पद्धति के रूप में साहित्य में स्वीकार किया जाता है, के बावजूद पहले से चिंताओं 21, 30, 31, 32 का उल्लेख किया।

उपर्युक्त विधि से तुलना करके, postembedding इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री कि मेथाक्रिलेट राल में एम्बेडेड क्रायो-तय नमूने के लिए आवश्यक है, कम संवेदनशील है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र एंटीजन का पता लगाने के लिए सीमित है 14 33। हालांकि, एल्डिहाइड निर्धारण भी प्रतिजनकता के संबंध में अपनी सीमाएं हैं। इसलिए, यह ईएम तैयारी शुरू करने से पहले एल एम स्तर पर किसी दिए गए रासायनिक निर्धारण प्रोटोकॉल के लिए एंटीबॉडी की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक्रोलिन निर्धारित मस्तिष्क के ऊतकों पर इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री की गुणवत्ता भी पहले से रासायनिक निर्धारण द्वारा बनाई मजबूत एल्डिहाइड बांड तोड़ने पर निर्भर करता है। यह कदम (- 3.5 देखें कदम 3.3) सोडियम borohydride साथ इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री से पहले वर्गों विकासशील द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इस चरण को छोड़ने का निश्चित रूप से करने से इनकी immunostaining 34 में परिणाम होगा। (- 2% 0.1) 4% पीएफए ​​में पतला एंटीबॉडी प्रयोग की जाने वाली हैं मस्तिष्क वर्गों एक्रोलिन साथ तय हो गई पर इष्टतम धुंधला देना नहीं है, यह वैकल्पिक रूप से glutaraldehyde उपयोग करना संभव है। यह मस्तिष्क फैटी अच्छी तरह से सुरक्षित रखने के लिए पर्याप्त रूप से कई एंटीबॉडी के लिए प्रतिजनकता को बनाए रखने और मस्तिष्क के ऊतकों प्रदान करने के लिए सिद्ध हुआ हैकम से कम परिवर्तन 20, 21, 35, 36, 37 के साथ लंबी अवधि के भंडारण के लिए उपयुक्त। यह भी काफी घोल का पीएच को ऊपर उठाने के द्वारा अकेले अपेक्षाकृत अच्छी निर्धारण और प्रतिजनकता पीएफए के साथ ईएम के लिए उपयुक्त प्राप्त करने के लिए संभव है, लेकिन छिड़काव के दौरान एक से अधिक बंधक का एक संयोजन बेहतर परिणाम 34 प्रदान की गई है, और अध्ययन आम तौर पर समर्थन करने वाले पीएफए निर्धारण अकेले ईएम परीक्षा 38, 39 के लिए खराब संरक्षित ऊतक का उत्पादन। हालांकि, कुछ दुर्लभ मामलों में, प्रतिजनकता बहुत मुश्किल बनाए रखने के लिए है, और पीएफए ​​अकेले निर्धारण ईएम परीक्षा के लिए केवल व्यवहार्य विकल्प बना हुआ है।

इस प्रोटोकॉल में कई कदम आदेश में इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए ध्यान से पालन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, 4% पीएफए ​​समाधान की तैयारीआदेश पीएफए ​​पाउडर भंग करने के लिए अनुमति देने के लिए ऊपर 45 डिग्री सेल्सियस तापमान पर किया जाना चाहिए, लेकिन यह जरूरी है तापमान 60 डिग्री सेल्सियस से नीचे रहता है। अन्यथा, पीएफए समाधान formaldehyde और चींटी एसिड, जो ऊतकों को अलग ढंग से ठीक करता है और एक अम्लीय घोल है कि काफी ऊतक गुणवत्ता 40, 41 बदल सकता है रूपों में depolymerizes। इसके अतिरिक्त, यह है कि छिड़काव कदम, तेजी से बाहर किया जाना एक बार डायाफ्राम में कटौती की गई है के बाद से हाइपोक्सिया और हाइपरकेपनिया मस्तिष्क को अपरिवर्तनीय शारीरिक परिवर्तन है कि गुणवत्ता और ऊतकों 31 की अखंडता को बदल सकता है उत्पादन करेगा महत्वपूर्ण है। दोषपूर्ण निर्धारण मस्तिष्क के ऊतकों के संरक्षण के लिए हानिकारक हो सकता है और स्थायी रूप से इस तरह के प्लाज्मा झिल्ली माइटोकांड्रिया और synapses के रूप में ऊतक, के फैटी बदल देते हैं। इस प्रकार, समाधान तैयारी और छिड़काव चरणों देखभाल के साथ किया जा करने की जरूरत है। सफल ईएम नमूना preparation भी अत्यधिक आज़मियम tetroxide में एक अच्छा के बाद निर्धारण पर निर्भर करता है। दरअसल, आज़मियम tetroxide के साथ सीधे छिड़काव ईएम अवलोकन 21, 39 के लिए यथोचित बरकरार ऊतक के उत्पादन के रूप में वर्णित किया गया है। हालांकि, बाह्य अंतरिक्ष की राशि और आज़मियम-भरकर रखा और एल्डिहाइड-भरकर रखा पशुओं के बीच प्लाज्मा झिल्ली की उपस्थिति के मामले में कई मतभेद देखा गया है। इसके अलावा, काला और आज़मियम छिड़काव के बाद ऊतकों के सख्त खोपड़ी, बाद विच्छेदन, और सफेद और ग्रे मैटर के बीच अंतर और अधिक कठिन से मस्तिष्क को हटाने प्रदान की गई है, बेहतर ऊतक संरक्षण और आसान हेरफेर 21 के लिए एल्डिहाइड छिड़काव के पक्ष में। एल्डिहाइड निर्धारण अकेले बाह्य अंतरिक्ष, जो ऊतक की अखंडता को बदल देता है और टाइट जंक्शन जहां बाह्य अंतरिक्ष में देखा जाना चाहिए की छाप देता है कम करने के लिए, इस प्रकार दिखाने में नाकाम रहने के लिए प्रकट होता हैके बाद भी नेतृत्व साइट्रेट धुंधला 42 स्वीकार्य इलेक्ट्रॉन micrographs। सावधानी के साथ - हालांकि, आज़मियम tetroxide में postfixation ऊतक तत्वों के बीच एक सबसे निश्चित जुदाई, जो उनकी पहचान 42 के लिए आवश्यक है की अनुमति देकर इस स्थिति उलट है, इस प्रकार स्पष्ट रूप से osmification चरणों से बाहर ले जाने के महत्व को न्यायोचित ठहरा (4.2 4.1 कदम)।

स्थिति और सांद्रता जिसके तहत इन चरणों का किया जाता है विशेष रूप से पूर्व embedding इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री प्राइमेट मस्तिष्क वर्गों पर तलछट के रूप में डी ए बी प्रयोग करने के लिए, हमारे प्रयोगशाला में परीक्षण किया गया है। हालांकि कौशल को चुनौती देने, डबल इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री माध्यम से संभव है के बाद embedding सोने के साथ इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री कणों 43। इलेक्ट्रॉन घने डी ए बी, के बाद immunoperoxidase-diaminobenzidine तकनीक यहाँ प्रस्तावित ईएम स्तर पर पहचान करने के लिए बहुत आसान है प्राप्त वेग के बाद से यह प्लाज्मा झिल्ली और बाहर की रूपरेखाएर अंगों की सतहों, जबकि अभी भी इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया और synaptic संपर्कों के रूप में उप सेलुलर घटकों, की पहचान की इजाजत दी। साथ ही, एक बार वर्तमान तकनीक एकल इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए महारत हासिल है, यह संभव डी ए बी सोने के कणों, जो और अधिक आसानी से विभिन्न आकार के सोने के कणों से एक दूसरे से पहचाना जाता है करने के लिए तलछट के संयोजन के द्वारा डबल इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री प्रदर्शन करने के लिए है। हम ईएम के लिए मस्तिष्क वर्गों प्रक्रिया से पहले एंटीबॉडी विशिष्टता, आज़मियम सांद्रता, और ऊष्मायन समय और तापमान के कठोर परीक्षण कर रही है की सिफारिश करेंगे। पूर्व एम्बेडिंग और EM के लिए डबल इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित किया गया है और प्राइमेट मस्तिष्क के ऊतकों 16 के लिए अनुकूलित किया जा सकता।

अंत में, ऊपर प्रस्तुत गैर मानव प्राइमेट के लिए transcardiac छिड़काव प्रोटोकॉल है कि बाद में ईएम पूर्व embedding इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए इस्तेमाल किया जा सकता मस्तिष्क वर्गों की लंबी अवधि के भंडारण के लिए अनुमति देता है। धाराप्राप्त एनएस भी एल एम स्तर पर neuroanatomical अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं। इसलिए, एक प्रोटोकॉल दोनों ईएम और एल एम के लिए उपयुक्त है का उपयोग करके, यह संभव इस्तेमाल जानवरों की संख्या, एक लागत प्रभावी और नैतिक विचार कम करना है। यह भी एक ही जानवर पर एलएम पर प्राप्त परिणामों और ईएम स्तरों के बीच एक प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है और correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म (क्लेम) के अध्ययन के उपयोग की अनुमति देता। क्लेम पढ़ाई ज्यादातर अनुवांशिक इंजीनियर चूहों ऐसे EGFP के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन,, जो बाद में इलेक्ट्रॉन घने तलछट के साथ लेबल किया जा सकता है और कहा ईएम स्तर 44 पर व्यक्त करने का उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया। वैकल्पिक रूप से, क्वांटम डॉट्स 45, ठंड से पहले, ईएम स्तर 46 पर दृश्य अनुमति इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, क्रायो-निर्धारण की समस्या इलेक्ट्रॉन घने मार्करों, का एक intraneuronal इंजेक्शन साथ जोड़ा जा सकता नाकाम करने के लिए। हालांकि, क्वांटम डॉट्स biocompatible नहीं हैं, औरउनके उपयोग बाद में ऊतक तैयार करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त ठंड तंत्र की वजह से महंगी और समय लेने वाली है। हालांकि इन तकनीकों अभी भी क्रायो-निर्धारण के पक्ष में और फ्रीज-प्रतिस्थापन तरीकों, वहाँ अर्द्ध पतली (300 एनएम) वर्गों पर रासायनिक टैग का उपयोग सिंथेटिक fluorophores के साथ विभिन्न सेलुलर प्रोटीन लेबल करने के लिए है, जो ईएम विश्लेषण 47 के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है के लिए कुछ विकास कर रहे हैं । अनुमति उदाहरण के लिए तकनीक, एक विशिष्ट अक्षतंतु स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति का उपयोग करने और ईएम का उपयोग कर किसी दिए गए लक्ष्य संरचना के न्यूरॉन्स के साथ अपने अन्तर्ग्रथनी संबंध के बीच संबंध, बल्कि तंत्रिका तंत्र के संगठन की समझ के लिए आशाजनक, विशेष रूप से वानरों में कर रहे हैं। इस मामले में, एक्रोलिन निर्धारण, glutaraldehyde से अधिक इष्ट किया जाना चाहिए के रूप में बाद के autofluorescence कि एल एम स्तर पर मस्तिष्क संरचना का उचित दृश्य बदल सकता है का उत्पादन करेगा। हालांकि, इस प्रकार के बहुत कुछ अध्ययनों से वानरों में किए गए हैं, मीostly तकनीकी चुनौतियों और उच्च लागत कि इस तरह के प्रयोगों को लागू करने के कारण। इस प्रकार, नए घटनाक्रम ऐसे निर्धारण के तरीकों में सुधार या रासायनिक टैग दोनों एल एम और ईएम स्तरों पर दिखाई का उपयोग कर के रूप में वानरों में सफल और कम लागत से क्लेम अध्ययन, के लिए आवश्यक हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन प्राकृतिक विज्ञान और (मध्य प्रदेश के NSERC, 401,848-2011) कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया। सांसद Fonds डे Recherche du Québec-Santé (FRQ-एस) से एक कैरियर पुरस्कार प्राप्त किया। ले FRQ-S (FRQ-एस 14D 29,441) से एक डॉक्टरल फेलोशिप से सम्मानित किया गया। हम तकनीकी सहायता के लिए मैरी-जोस Wallman धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
NaOH EMD SX0590-1 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) Sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18 G 11/2
Needle terumo  NN-2713R 21 G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma S-9125
Normal horse serum (NHS) Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1,000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3,3'-diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0.005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152
4% 19150
 Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin Sigma A: M epoxy resin (44611)
B: hardener 964 (44612)
C: accelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plasticizer (44614) 		 Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate Sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter Corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

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Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

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