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Neuroscience

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55397
Automatic Translation
1,2, 1
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Summary

Aquí, proporcionamos una, de bajo costo fácil, y eficiente en el tiempo de protocolo para fijar químicamente el tejido cerebral de los primates con fijador acroleína, lo que permite la conservación a largo plazo que es compatible con inmunohistoquímica pre-inclusión para microscopía electrónica de transmisión.

Abstract

A pesar de todos los avances tecnológicos a nivel de microscopía óptica, microscopía electrónica sigue siendo la única herramienta en la neurociencia para examinar y caracterizar los detalles ultraestructurales y morfológicas de las neuronas, como los contactos sinápticos. Buena conservación de tejido cerebral para la microscopía electrónica se puede obtener por métodos crio-fijación rigurosos, pero estas técnicas son más bien costosos y limitar el uso de immunolabeling, que es crucial para entender la conectividad de los sistemas neuronales identificados. métodos de congelación y de sustitución se han desarrollado para permitir la combinación de la crio-fijación con inmunomarcación. Sin embargo, la reproducibilidad de estos enfoques metodológicos por lo general se basa en dispositivos de congelación costosos. Por otra parte, la obtención de resultados fiables con esta técnica es mucho tiempo y habilidad desafiante. Por lo tanto, el tradicional cerebro químicamente fija, particularmente con fijador acroleína, sigue siendo un método eficiente en el tiempo y de bajo costo para combinar de electronesLa microscopía con inmunohistoquímica. Aquí, proporcionamos un protocolo experimental fiable usando fijación acroleína química que conduce a la preservación de tejido cerebral de los primates y es compatible con pre-incrustación de inmunohistoquímica y la transmisión de electrones examen microscópico.

Introduction

Microscopía de luz, incluyendo confocal y microscopía de dos fotones, ha demostrado ser una herramienta eficaz para el estudio de los procesos neuronales in vivo, entre otras cosas 1, 2. Aunque la resolución espacial típica a nivel microscópico de luz (LM) es de aproximadamente 200 nm, los recientes avances tecnológicos utilizando diferentes fuentes de luz, como la luz ultravioleta extrema y microscopía de rayos X blandos, se han incrementado notablemente la presente resolución a una resolución espacial de casi 10 nm 3 , 4, 5. Otros avances tecnológicos en formación de imágenes incluyen combinar imágenes de resonancia magnética con histología y proporcionar un nuevo método para medir el espesor de la vaina de mielina in vivo, un parámetro que fue tradicionalmente mensurable sólo a nivel de microscopía electrónica (EM) 6, 7. although estos avances en el plano LM proporcionan una excelente herramienta para el estudio de los procesos vivos, una vista detallada y caracterización de estructuras, tales como contactos sinápticos, sólo puede lograrse con EM, lo que ofrece una resolución que puede alcanzar 0,5 nm. Sin embargo, la observación en el nivel EM requiere los especímenes estar muerto y alterado de alguna manera, con fijadores químicos y procesos de deshidratación, con el fin de preservar la citoarquitectura. Por lo tanto, el examen de muestras biológicas en alta resolución puede ser un reto debido al daño por radiación de haz de electrones, bajo contraste, las desviaciones estructurales de las membranas, o incluso la presencia de artefactos que pueden ocurrir después de la deshidratación y epoxi incrustación de 8, 9, 10.

La preservación de especímenes en su forma nativa para el análisis estructural se puede lograr mediante el uso de "Cryo EM de las secciones vitrificados" o CEMOVIS, un enfoque de seccionamiento queconsiste en congelar rápidamente y la incrustación de la muestra en hielo vítreo y el examen de las secciones bajo la EM a una temperatura criogénica 11, 12. Este procedimiento permite el examen de muestras, mientras que todavía son sólidos y completamente hidratado, la eliminación de artefactos causados por la deshidratación de este modo procesa 13. Sin embargo, este método implica dispositivos adicionales para la crio-ultramicrotomía, así como dispositivos adicionales en el estándar de EM, con el fin de permitir que esta observación a muy bajas temperaturas, que generan costes adicionales significativos. Además, el enfoque CEMOVIS impide el uso de técnicas de inmunomarcaje, ya que los anticuerpos por lo general tienen que ser incubaron a RT. Alternativamente, es posible combinar el análisis ultraestructural con procedimientos inmunohistoquímicos utilizando un enfoque de congelación-sustitución, durante el cual las muestras crio-fija se descongelan lentamente mientras sumergido en productos químicos crio-protector y son then incrustado en resinas especializadas, tales como Lowicryls. Post-incrustación immunolabeling entonces se puede realizar en tal material 12. Sin embargo, las técnicas de congelación-sustitución y crio-fijación son mucho tiempo. Requieren la instalación de equipo adicional y todavía requieren muestras de estar expuestos a disolvente orgánico y fijador químico que puede alterar la citoarquitectura, a pesar del uso de una temperatura baja 14, 15. Por lo tanto, a pesar de todos los avances tecnológicos tanto en el LM y el nivel EM, la fijación química del tejido cerebral, en particular con acroleína, sigue siendo un método de bajo costo y eficiente en el tiempo para combinar inmunohistoquímica con EM 16.

En las últimas décadas, se hicieron muchos intentos para encontrar una mezcla de aldehídos que proporcionan la mejor conservación del tejido. Antes de la década de 1960, el único fijador químico que dio resultados aceptables para EM era tetróxido de osmio. Sin embargo, tetróxido de osmio es muy tóxico y caro, lo que impide su uso a través del sistema vascular para fijar órganos tales como el cerebro. La acroleína se introdujo a finales de la década de 1950 como un método fiable para la conservación del tejido animal adecuado para EM observación de las estructuras celulares 17. Se penetra en el tejido más profundamente y reacciona más rápidamente que otros aldehídos cuando se utilizan para la fijación por inmersión y permite una buena conservación de los componentes citoplasmáticos, con contracción mínima del tejido 17. Tal característica proporciona la fijación acroleína una clara ventaja sobre otros aldehídos cuando se usa en tejido fresco, por lo que permite una localización más precisa de vivir compuestos moleculares, tales como enzimas y otras proteínas 18. De hecho, se ha validado a través de los años como un método fácil, eficiente y de bajo costo de fijación para la visualización a nivel de EM en muchas especies, incluyendo anfibios y roedores, ya que de manera eficiente StAbILIzes péptidos y proteínas, conserva la antigenicidad y proporciona ultraestructura relativamente intacto cuando se utiliza en combinación con otro aldehído fijador 16, 18, 19, 20, 21. Los protocolos para la fijación de la acroleína en roedores Desde entonces se han normalizado y utilizado ampliamente, en particular por el grupo Pickel, para poner en práctica la doble inmunomarcación para EM 16, 22. Unos pocos grupos han utilizado la fijación acroleína en el tejido cerebral de primates no humanos 23. Sin embargo, para nuestro conocimiento, no es sólo un protocolo publicado que describe de manera eficiente fijación química con acroleína en primates no humanos que es compatible con EM immunolabeling 24.

En este artículo, proporcionamos un método sencillo y fiable para solucionar de manera eficiente químicamente no-humun cerebro de primates con acroleína, lo que permite una conservación potencialmente a largo plazo junto con pre-incrustación immunolabeling y EM transmisión examen.

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Protocol

Ética Declaración: Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección des Animaux de l'Université Laval y se hicieron de acuerdo con el Consejo Canadiense de la Guía del Cuidado de Animales para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2 ed.). El protocolo descrito aquí se optimizó para los animales adultos de aproximadamente 800 g. Los volúmenes de fijador se deben ajustar de acuerdo con el tamaño del animal.

1. Preparación de soluciones para perfusión transcardiaca

  1. Preparar 1 L de una solución 50 mM tamponada con fosfato de sodio salino (PBS) de acuerdo con los siguientes pasos. Preparar la solución de a lo sumo 24 h antes de la perfusión y mantener a 4 ° C hasta su uso.
    1. Medir 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 5,87 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na 2 HPO 4), 1,20 g de fosfato monobásico de sodio monohidratado (NaH 2 PO 4 · H 2 O), y 9 gde cloruro de sodio (NaCl). Agitar para disolver.
    2. Ajustar el pH a 7,4 mediante la adición gradual de NaOH 5 N. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 1 L.
      PRECAUCIÓN: NaOH es un compuesto químico corrosivo. Use el equipo de protección individual (EPI;. Bata de laboratorio, guantes, gafas de protección, etc.).
  2. Preparar 2 L de 4% de paraformaldehído (PFA) de acuerdo con los siguientes pasos. Esta solución debe prepararse un máximo de 24 h antes de la cirugía y se mantiene a 4 ° C hasta su uso.
    1. Mida 1,5 L de agua destilada en un 2-L vaso de precipitados. Añadir 23.48 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na 2 HPO 4) y 4,80 g de fosfato monobásico de sodio monohidratado (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Agitar para disolver. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 2 L.
    2. Calentar la solución en una campana de ventilación hasta que la temperatura alcanza aproximadamente 45 - 55 ° C. No caliente a más de 60 ° C.
    3. Añadir poco a poco 80 g de PFA a la solución y se agita hasta que se disuelva completamente (aproximadamente 30 - 60 min). Mantener el control de la temperatura para mantenerlo por debajo de 60 ° C.
      PRECAUCIÓN: PFA es altamente volátil en su forma de polvo. Es altamente tóxico si entra en contacto con los ojos o de la piel y es peligroso en caso de inhalación o ingestión. Usar el EPP y utilizar con precaución en una campana de ventilación.
    4. Enfriar la solución a 4 ° C y el filtro. Almacenar a 4 ° C.
  3. Preparar 1 L de 3% de acroleína en 0,1 M de tampón fosfato (PB) de acuerdo con los siguientes pasos. La solución de PB debe ser preparado como máximo 24 h antes de la perfusión.
    PRECAUCIÓN: La acroleína es altamente tóxico si se inhala y puede producir daños inmediatos. También es corrosivo y altamente tóxico si se absorbe a través de la piel. Es cancerígeno y mutagénico. Use el PPE apropiado y utilizar bajo una campana de ventilación.
    1. Medir 800 ml de agua destilada. Añadir 8,66 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na 2 4) y 5,38 g de fosfato monobásico de sodio monohidratado (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Se agita hasta que todas las sales se disuelven. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 1 L. Mantener la solución a 4 ° C.
    2. Antes de la cirugía, la transferencia de 900 ml de la solución de PB a un recipiente de vidrio de 1 L y añadir 30,94 ml de solución de acroleína 97% bajo una campana de ventilación. Añadir solución de PB para llegar a un volumen total de 1 L y se agita. Filtrar la solución y mantenerla a 4 ° C.

2. transcardíaca de perfusión cerebral y disección

  1. Mantener las soluciones en hielo durante todo el procedimiento quirúrgico. Preparar la bomba colocando el tubo en la primera solución para ser utilizado (PBS; 50 mM) y girando la bomba hasta que no quede aire en la manguera. Para la perfusión transcardiaca de un mono macaco, utilizar una aguja 21 G y establecer el flujo de salida en aproximadamente 80 ml / min.
  2. Anestesiar al animal con una inyección intramuscular de una mezclature de ketamina (20 mg / kg), xilazina (4 mg / kg), y acepromacina (0,5 mg / kg). Mantener el animal bajo isoflurano sedación (3%).
  3. Fije las extremidades del animal a una mesa de ventilación.
  4. Con un bisturí, quitar la piel hasta las axilas. Cortar los músculos abdominales. Use las tijeras quirúrgicas de alta resistencia para cortar las costillas lateralmente, evitando cuidadosamente los órganos vitales.
  5. Cortar el diafragma con tijeras quirúrgicas y elevar la caja torácica para exponer el corazón. Una vez que se corta el diafragma, proceda con rapidez, ya que el corazón deja de latir en cuestión de minutos.
  6. Retire el pericardio con una hoja de bisturí e insertar la aguja en el ventrículo izquierdo. Con un bisturí, cuidadosamente hacer una pequeña escisión de la aurícula derecha. iniciar rápidamente la bomba a 72 ml / min y mantener la aguja en su lugar. Si es posible, incline el animal con el fin de tener su cabeza en un nivel más bajo que el corazón.
    NOTA: Tenga cuidado de no perforar el tabique interventricular al insertar la aguja.
    1. Rinse la sangre con aproximadamente 300 ml de PBS hasta que los pulmones son de color blanco y no sale sangre de la aurícula derecha.
  7. Parar la bomba, de forma rápida la transferencia de la manguera / tubo a la solución de acroleína 3%, y empezar de nuevo la bomba. Poco a poco aumentar la velocidad de bombeo a 80 mL / min una vez que el corazón ha dejado de latir. Perfundir aproximadamente 500 ml de la solución de acroleína.
  8. Parar la bomba, de forma rápida transferencia de la manguera a la solución de PFA al 4%, y empezar de nuevo la bomba. Este paso requiere aproximadamente 1 L de PFA.
    NOTA: La fijación se completa cuando las extremidades anteriores son rígidos y el cuello está rígido.
  9. Cortar la cabeza y diseccionar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo. Tenga cuidado de no dañar el cerebro con los instrumentos quirúrgicos. La perfusión es óptima cuando el cerebro está pálido (ningún rastro de sangre) y rígido (Figura 1A).
  10. Sumergir el cerebro intacto en PFA al 4% durante 1 hora a 4 ° C.
  11. En serie cortar el cerebro con un enfriamiento vibratome (4 ° C)en el plano deseado en 50! m de espesor secciones y recogerlas en PBS (0,1 M) (Figura 1B).
    NOTA: Este paso puede llevarse a cabo de muchas maneras según el protocolo deseado. Hemisferios se pueden separar antes de vibratome de corte, o toda mantenido. Si el cerebro es demasiado grande para la plataforma vibratome, se puede cortar en bloques más pequeños. Después de este paso, las secciones se pueden almacenar durante un largo período de tiempo a -30 ° C en una solución anticongelante hecha de 40% PB (50 mM), 30% de glicerol, y 30% de etilenglicol.

Inmunohistoquímica 3. Pre-incrustación (Figura 1C)

  1. Preparar un 4 L solución madre de tampón Tris salino (TBS, 50 mM, pH 7,6) como sigue.
    1. Mida 2 l de agua destilada en un vaso de precipitados de 4 L, añadir 24,23 g de aminometano trihidroximetil (THAM; C 4 H 11 NO 3), y agitar hasta disolver.
    2. Ajustar el pH a 7,6 con aproximadamente 148 ml de HCl 1 N. El ácido se debe añadir con ITUACen para evitar llegar a un pH inferior a 7,6. El volumen total debe ser de 4 L.
      PRECAUCIÓN: HCl es altamente corrosivo. Llevar el EPP apropiado.
  2. Seleccione las secciones (de la etapa 2.11) que contienen la región de interés a ser procesados ​​para EM inmunohistoquímica.
  3. Lavar las secciones de flotación libre 3x en PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 5 min a RT para enjuagar la solución anticongelante.
  4. Preparar una solución de 0,5% de NaBH 4 diluido en PBS.
    1. Pesar 0,05 g de NaBH4 y se diluye en 10 ml de PBS. No cubrir. Preparar esta solución justo antes de su uso.
  5. Incubar las secciones en la solución recién preparada NaBH 4 durante 30 min a RT. Agite con cuidado. No cubrir.
  6. Lavar 3x en PBS durante 10 min a TA, meciéndose vigorosamente hasta que ninguno de gas de reacción se mantiene.
  7. Preparar una solución de bloqueo durante EM con 2% de suero normal apropiado y 0,5% de gelatina de pescado frío diluido en PBS.
    NOTA: La cantidad should ser calculado con el fin de tener suficiente para los tres pasos siguientes. Utilizar un suero a partir de la misma especie animal que alojan el anticuerpo secundario. Evitar el uso de métodos de recuperación de antígeno o adición de pequeñas cantidades de triton (para aumentar la penetración de los anticuerpos), ya que estos métodos comprometer significativamente la calidad del tejido.
  8. Incubar las secciones en la solución de bloqueo durante 1 h a TA. Agite con cuidado.
  9. Preparar la solución de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo.
    NOTA: La concentración del anticuerpo primario es generalmente el mismo que para la inmunohistoquímica LM, pero debe tener en cuenta la realización de ensayos con diferentes concentraciones de anticuerpo de antemano, ya que algunos anticuerpos primarios pueden no funcionar con acroleína. Si es así, es posible utilizar una mezcla de glutaraldehído (0,1 - 2%) y 4% PFA para la perfusión transcardiaca y obtener resultados similares. Optimizar el tiempo de incubación y la temperatura también.
  10. Incubar las secciones en solución de anticuerpo primariodurante la noche a RT con agitación suave. Utilice un tiempo de incubación previamente probado y temperatura.
  11. Lavar las secciones 3x en PBS durante 5 min a TA con suave balanceo.
  12. Preparar una solución 1: 1000 de anticuerpo secundario biotinilado diluido en la solución de bloqueo.
    NOTA: El anticuerpo secundario debe elevarse contra la especie huésped utilizadas para generar el anticuerpo primario.
  13. Incubar las secciones en solución de anticuerpo secundario durante 1,5 h a TA. Agite con cuidado.
  14. Preparar una solución de avidina-biotina-peroxidasa (ABC) al menos 60 min antes de la final de la incubación el anticuerpo secundario.
    1. Utilizar una pipeta calibrada para medir 8,80 l / ml de las soluciones A y B y se diluye en PBS.
    2. Roca suavemente durante al menos 60 min a RT para permitir la unión entre las moléculas de avidina y biotina completa.
  15. Después de la incubación en solución de anticuerpo secundario, lavar 3x en PBS durante 10 min a TA.
  16. Se incuban las secciones en el modo ABClution durante 1 h a TA. Agite con cuidado.
  17. Lavar una vez en PBS y dos veces en TBS durante 10 min a TA con suave balanceo.
  18. Se prepara una solución fresca de 0,05% de 3,3'-diaminobencidina (DAB) con 0,005% de H 2 O 2 diluido en TBS.
    1. Pesar 12,5 mg de DAB y diluir en 25 ml de TBS frío. Proteger de la luz.
      PRECAUCIÓN: El polvo DAB es muy volátil y nocivo si se inhala. Es cancerígeno y teratogénico. Por lo tanto, las mujeres embarazadas o lactantes no deben manipular este producto, incluso cuando se diluye. Usar una máscara N95 al manipular y usar el EPP.
    2. Filtrar la solución y añadir 4,5 l de 30% de H 2 O 2 justo antes del uso.
  19. Incubar las secciones en la solución DAB durante 3 a 7 min a TA. Agite con cuidado.
    NOTA: El precipitado marrón no debe ser demasiado oscuro para evitar un alto nivel de tinción de fondo. El tiempo de incubación debe ser optimizado en consecuencia.
  20. Detener la reacción lavando dos veces rápidamenteen TBS frío, luego dos veces durante 10 min en TBS frío a TA, seguido de dos veces durante 10 min en PB, con balanceo suave.
    NOTA: El uso de PB (y no PBS) es crítica con el fin de eliminar cualquier traza de NaCl, ya que reaccionaría con cristales de osmio y la forma.

4. Osmification e incrustación de electrones observación microscópica

  1. Preparar una solución de 1% de tetróxido de osmio (OsO4) diluido en PB. Proteger de la luz.
    PRECAUCIÓN: El osmio es muy tóxico y no debe entrar en contacto con la piel, los ojos o la boca y no debe ser inhalado. Puede causar la muerte si se ingiere. Sólo se debe utilizar en una campana de ventilación y con PPE apropiado.
  2. Incubar las secciones en OsO4 solución durante 30 min a TA bajo el capó de ventilación (sin agitación) y cubrir con papel de aluminio para protegerlas de la luz. Completamente aplanar las secciones antes de añadir la solución de OsO4.
    NOTA: Las secciones se vuelven muy oscuro y riGID y deben ser manipulados con cuidado después de este paso.
  3. Preparar resina epoxi repelente al agua durante el osmification.
    1. Añadir cantidades apropiadas de cada componente de la mezcla de resina epoxi (20 g de resina epoxi, 20 g de endurecedor, 0,6 g de acelerador y 0,4 g de plastificante) a un gran vaso de plástico. Agitar con una varilla de madera o pipeta de plástico hasta que se obtiene un color marrón homogénea.
      NOTA: Es importante utilizar la proporción exacta de cada componente.
    2. Transferencia de cantidades iguales a recipientes de aluminio de tamaños apropiados, dependiendo del número de secciones a procesar. Deje reposar.
  4. Lavar las secciones osmificated 3x en PB durante 10 min a RT con balanceo de baja velocidad.
  5. Deshidratar las secciones en la siguiente serie de etanol graduado durante 2 minutos cada uno: 2 veces en 35% de etanol; 1 vez cada uno en 50, 70, 80, 90, y 95% de etanol; y 3 veces en etanol al 100%.
  6. Transferir las secciones a viales de vidrio para completar los dehydratien proceso mediante la incubación de las secciones 3 veces durante 2 minutos en óxido de propileno.
    PRECAUCIÓN: El óxido de propileno es un disolvente orgánico muy volátil y tóxico. Puede causar graves daños a los ojos o la piel en caso de contacto o si se inhala o se ingiere. Ha sido clasificado como una sustancia cancerígena grado 2. Sólo se debe utilizar en una campana de ventilación y con PPE. También es altamente inflamable y debe mantenerse alejado de cualquier fuente de calor.
    NOTA: Antes de este paso, las secciones deben ser transferidos cuidadosamente en viales de vidrio, ya que el óxido de propileno es un disolvente orgánico y es incompatible con el plástico. En este punto, las secciones son muy frágiles y deben ser manipulados con cuidado. Secciones se pueden transferir alternativamente a viales de vidrio antes de la etapa 4.5.
  7. secciones de transferencia con cuidado, uno por uno, en las copas de aluminio y evitar el contacto con el aire tanto como sea posible. -Flat incrustar las secciones en resina epoxi repelente al agua previamente mezclada y se incuba durante la noche bajo la venting campana a TA.
    NOTA: En este paso, las secciones son completamente deshidratado y muy frágil y debe manipularse con cuidado.
  8. El uso de aceite mineral, preparar portaobjetos de vidrio recubierto con grasa junto con cubreobjetos de plástico engrasados.
  9. Ablandar la resina mediante la incubación de tazas de aluminio a 60 ° C durante 12-15 min como máximo. aplanar cuidadosamente las secciones en el lado engrasado de la lámina de vidrio. Coloque el cubreobjetos engrasado y empuje con cuidado para sacar el aire restante.
  10. Incubar los portaobjetos a 60 ° C durante 48 h.
    NOTA: Es fundamental para no exceder de 48 h de tiempo de incubación, como la resina será demasiado duro.
  11. Quitar el cubreobjetos de plástico.

5. Preparación de muestras para ultrafino Seccionamiento y la observación usando un microscopio electrónico de transmisión

  1. Utilizar binoculares para encontrar la región de interés y cortar un pequeño trozo cuadrangular de aproximadamente 1 mm 2 con un bisturí.
  2. Archivo de la punta de un bloque de resina y la cola de la qupiece adrangular sobre ella (Figura 1C). Deje que el pegamento se seque durante al menos 1 h o durante la noche antes de seccionar.
  3. El uso de un ultramicrotomo, cortar la pieza cuadrangular en 80 secciones micras de espesor (Figura 1D).
    1. Coloque el bloque de resina en una cubierta ultramicrotomo en la posición vertical y, usando una hoja de afeitar afilada, corte gradualmente cada lado del bloque de resina para formar un trapecio con lados lisos.
    2. Ponga la cubierta en su posición horizontal y girar el bloque hasta que el lado más largo del trapecio quede hacia abajo.
    3. Utilice una herramienta de diamante de corte o una cuchilla de vidrio para recortar la superficie de la pieza cuadrangular. Ajuste el ultramicrotomo para cortar 300 micras de espesor secciones a 1 mm / s. Ajuste el cuchillo para ser verticalmente paralela a la pieza cuadrangular y para mostrar un ángulo muy pequeño horizontal de aproximadamente 1 °.
      NOTA: Este ángulo le permitirá al usuario acercarse al tejido casi paralelo a la superficie de la bbloquear, donde es más probable que se encuentre elementos immunolabeled. Cuando se utilizan estos parámetros con la herramienta de diamante de corte, la resina muestra un color blanco brillante. Cuando se corta el tejido, cambia a un color púrpura o verdoso.
    4. Utilice un ultra cuchillo de diamante 45 ° equipado con un bote lleno de agua destilada para cortar 80 micras de espesor secciones, suavizar secciones pasando por encima de ellos con un trozo de papel con punta en xileno de absorción, y recoger las secciones de serie en rejillas-formvar recubierto tragamonedas de níquel o desnudas 150 rejillas de cobre de malla (Figura 1E).
  4. Colocar las rejillas en una caja de almacenamiento de red.
  5. Tinción de las rejillas con citrato de plomo.
    1. Utilice una jeringa de 5 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras para preparar una solución 1: 1 de solución madre de citrato de plomo filtrada y agua destilada filtrada. Protegerlo de la luz.
      NOTA: La solución madre de citrato de plomo debe hacerse fresco cada mes para evitar la formación de sólidos DEPOSsus. Consulte la hoja de datos de la receta de valores. Además, si es necesario teñirlos muchas series de rejillas, cambiar la solución diluida cuando se vuelve lechoso.
    2. Colocar cada rejilla sobre una gota de la solución diluida, con la sección en contacto con la solución. Incubar durante 3 min.
    3. Utilice pequeñas pinzas para sostener la red, y enjuagar bien en dos vasos de precipitados que contienen agua destilada.
    4. Eliminar el exceso de agua mediante el uso suavemente papel absorbente. Almacenar las rejillas en una celda de la malla. Esperar 30 min antes de examinar las secciones por microscopía electrónica de transmisión (TEM; Figura 1F).

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Representative Results

En esta sección, se presentan los resultados representativos que se obtuvieron después de la observación, en el nivel EM transmisión, del tejido cerebral de primates a inmunotinción fija químicamente con una mezcla de 3% de acroleína y 4% PFA. Hemos logrado una buena conservación de la ultraestructura, como se indica por la vaina de mielina relativamente intacto y la visualización ordenada de membranas dobles (Figura 2A). Contactos sinápticos, además de elementos neuronales desde el microambiente, pueden ser fácilmente identificados (Figura 2B). elementos neuronales marcados con diaminobencidina inmunoprecipitado (DAB) se reconocen en el nivel EM por su citoplasma lleno o axoplasma. La membrana plasmática y la superficie exterior de los orgánulos también están típicamente alineados con el precipitado denso en electrones (Figura 3).

En este experimento particular, hemos utilizado anticuerpos against el transportador de serotonina (SERT), colina acetiltransferasa (ChAT), o tirosina hidroxilasa (TH) para visualizar elementos neuronales inmunomarcadas en la externa (GPE) o (GPI) segmento de la pallidus mono ardilla globo (Figura 3) interno. Con el fin de hacerlo, se utilizó una combinación de productos químicos fijadores que conservan la antigenicidad, así como ultraestructura, lo que permite una investigación morfológica detallada. Aunque muchos anticuerpos pueden utilizarse con el protocolo transcardíaca perfusión descrito anteriormente, se recomienda que los usuarios realizan pruebas de concentración optimización de antemano, ya que algunos anticuerpos primarios son conocidos por no proporcionar immunolabeling óptima con fijación acroleína. Alternativamente, cuando los anticuerpos no proporcionan immunolabeling óptima con fijación acroleína, una dilución de 0,1 - 2% de glutaraldehído en PFA al 4% puede ser utilizado para la perfusión transcardiaca. Se proporciona una calidad de tejido relativamente equivalente al tejido cerebral acroleína-fija con antigenicidad conservado para muchosanticuerpos (Figura 4).

Finalmente, proporcionamos ejemplos típicos de fotomicrografías EM obtenidos siguiente manipulaciones inadecuadas. Un pobre resultados de fijación en vainas de mielina alterados (Figura 5A, B) y dificultades en la visualización de los dobles membranas de neuritas (Figura 5C, D), la prevención de una identificación y análisis de elementos neuronales etiqueta y etiqueta fiable. Un tiempo de incubación excesiva en la solución DAB crea fondo excesivo y la tinción no específica que potencialmente pueden generar resultados falsos positivos. Antecedentes o no específica tinción veces aparece tinción como incompleta de elementos neuronales (Figura 6A, B), pero más a menudo tan numerosos y estrechamente situado elementos neuronales teñidas (Figura 6C, D). El uso de detergente en la solución de bloqueo altera significativamente la calidad del tejido. Todo ello puede conducir a la falta deorgánulos en los elementos marcados (Figura 7A) o la degradación de las vainas de mielina (Figura 7B) y de las membranas celulares (Figura 7C), haciendo cualquier interpretación aguda del microambiente difícil. Por último, un paso en falso en el proceso osmification, como el uso de solución de lavado que contiene cloruro de sodio, produce resultados poco fiables donde las estructuras celulares son difíciles de distinguir (Figura 7D).

Figura 1
Figura 1: Esquema de pasos esenciales del Protocolo. El cerebro de mono (A) se corta en secciones en serie con un vibratome de refrigeración (B). Se procesa entonces para pre-incrustación de inmunohistoquímica y microscopía electrónica, después de lo cual se coloca la región de interés en la punta de un bloque de resina (C) y se corta en 80 SECTI nm de espesorons con un ultramicrotomo (D). Secciones ultrafinas se recogen entonces en 150 rejillas de cobre de malla desnudos o rejillas de níquel-formvar recubierto (E), se tiñeron con citrato de plomo y listo para ser observado bajo microscopio electrónico de transmisión (F). Barras de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Bien conservado Tissue cerebro de los primates después de acroleína-PFA transcardíaca perfusión. Las micrografías electrónicas de monos ardilla (Saimiri sciureus) tejido cerebral de la GPi (A) y GPe (B) que muestra representativa de material bien conservados después de realizar la perfusión transcardiaca acroleína-PFA y la técnica de inmunoperoxidasa-diaminobencidina. Ellosvaina yelin de los axones (a) es relativamente intacto (véase punta de flecha en A), y la ultraestructura general está bien conservada en A y B. perfiles dendríticas (d), pequeños axones no mielinizados (a), y varicosidades axónicas (AV) puede fácilmente ser identificado. Un ejemplo de un varicosity axón se establece un contacto sináptico simétrica (entre las flechas) con un perfil dendríticas (d) se muestra en B. Barra de escala: 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Secciones de mono ardilla GPe y GPI immunolabeled para colina acetiltransferasa (ChAT), transportador de serotonina (SERT), y la tirosina hidroxilasa (TH) mediante el uso de la técnica de inmunoperoxidasa-diaminobencidina. inmunoelementos marcados pueden ser fácilmente identificados por su citoplasma o axoplasm lleno de precipitado DAB denso en electrones. Perfiles dendríticas marcadas son reconocidos por microfilamentos llenada, como se ve en A, donde una dendrita ChAT-inmunotinción en el GPi recibe un contacto sináptico (entre las flechas) a partir de un varicosity axón no marcado (av). La micrografía de electrones en B muestra un axón mielinizadas en el GPe con una vaina de mielina relativamente intacto cuya axoplasm se immunolabeled para TH. El ejemplo de C muestra un varicosity axón en el GPi immunolabeled para SERT y se observa para establecer un contacto sináptico simétrica (entre las flechas) con una dendrita (d). En este ejemplo, el DAB precipitar líneas de la membrana plasmática y la superficie exterior de los orgánulos (mitocondria y vesículas sinápticas). Se observó la varicosity axón se muestra en D en el GPe y immunolabeled para TH y representa un ejemplo de DAB precipitado enteramente llenando la axopELAM, con vesículas sinápticas de ser visible, pero más difíciles de delimitar. Elementos de la microambiente pueden ser fácilmente identificados, como se ejemplifica por axones mielinizados y no mielinizadas (A) y dendritas ocasionales (d) que rodean la varicosity axón etiquetado. Las micrografías electrónicas se modifican a partir de 25, 26, 27. Barra de escala: 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Ejemplos de tejido cerebral Primate después de glutaraldehído-PFA transcardíaca perfusión. Micrografías electrónicas representativas de mono macaco (Macaca fascicularis) el tejido cerebral de la GPe (A) y GPI (BD) después performiperfusión ng transcardíaca con 0,2% de glutaraldehído mezcla con PFA al 4% y la técnica de inmunoperoxidasa-diaminobencidina con un anticuerpo contra el transportador de serotonina (SERT). Como en la figura 2, immunolabeled elementos pueden ser identificados por su citoplasma y axoplasm lleno de precipitado DAB denso en electrones. Ultraestructura general es relativamente intacto y elementos del microentorno se puede identificar fácilmente, como se muestra por axones mielinizados y no mielinizadas (A) y dendritas ocasionales (d) y varicosidades axónicas (AV) que rodean las varicosidades de los axones marcados, como se describe en la Figura 2. Sin embargo, tenga en cuenta la inconsistencia en la calidad de la ultraestructura, denotado por membranas plasmáticas bien definidos (puntas de flecha), pero vaina de mielina relativamente dañado (flecha). Barra de escala: 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 5: Ejemplos de tejido cerebral Primate obtiene lo siguiente una Unsuccessful transcardíaca perfusión. Los resultados de una fijación química sin éxito se muestran aquí en el mono ardilla GPi (A - B) y GPe (C - D) transcardially perfundidos con 0,9% NaCl solución de lavado y una mezcla de helado de 4% de ácido PFA y 15% pícrico diluye en 0,1 M PB (pH 7,4). Los cerebros se post-fijaron 1 h a 4 ° C en 4% PFA y 30% de sacarosa y se cortaron en 60 micras secciones sagitales de espesor con un vibratomo de refrigeración. Inapropiada tejido cerebral fijo puede ser reconocido por una vaina de mielina dañada (A y B, puntas de flecha), así como por las membranas plasmáticas borrosas o no definidos (C y D, véase puntas de flecha para los ejemplos). Diferentes elementos neuronales se difficult para identificar, haciendo que cualquier interpretación de la ultraestructura poco fiable. Barra de escala: 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Ejemplos de Immunolabeling ChAT no específica en el mono ardilla GPe. La tinción de fondo o immunolabeling no específica a veces aparece bajo la EM tinción como parcial de grandes elementos celulares, como se ilustra en A - B (puntas de flecha). Tal tinción no específica aparece más a menudo en la superficie de las secciones inmunoteñidas. Otros ejemplos de immunolabeling no específica incluyen la observación frecuente de elementos muy pequeños evocando axones pequeñas, no mielinizadas parcial o completamente llenos de DAB y situadas muy cerca de uno unatro, tal como se demuestra mediante puntas de flecha en C y D. Barra de escala: 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7: tejido dañado Squirrel Monkey GPe después de pasos en falso en la preparación de muestras para microscopía electrónica de. El uso de detergente, tal como Triton X-100, en la solución de bloqueo, incluso a una baja concentración de 0,02%, altera sustancialmente la integridad de la ultraestructura al dañar el citoplasma de las dendritas (A) o la vaina de mielina de los axones (B ). Los diferentes elementos neuronales también son difíciles de distinguir una de otra (C), ya que las membranas de plasma están dañados y difíciles de delimitar. El proceso osmification es ALSo un paso importante en la preparación de muestras. El uso de cloruro de sodio en soluciones de lavado (D) altera la fijación del tejido, lo que hace difícil el análisis posterior. Barra de escala: 800 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este artículo, se presenta un protocolo fiable para la perfusión transcardiaca de primates no humanos y la inmunohistoquímica pre-incrustación adecuado para el examen de la muestra EM. Aunque típica crio-EM, tales como CEMOVIS, proporciona una buena preservación de la ultraestructura del cerebro, sino que también limita el uso de inmunohistoquímica 12. Otras técnicas, incluyendo la crio-sustitución y técnica Tokuyaso, permiten post-incrustación de inmunohistoquímica, pero estas técnicas son caros debido a los dispositivos adicionales necesarios durante el proceso y pueden consumir mucho tiempo y habilidad desafiante 12, 14, 15. Por otra parte, con el fin de utilizar de manera eficiente el método de la crio-fijación, la muestra tiene que ser relativamente pequeña (hasta 200 m de espesor utilizando congelación 28 y 10 micras, con la presión atmosférica 29 de alta presión). Idealmente, para obtener un buenresultados con crio-fijación del tejido cerebral de los primates, la muestra tiene que ser tomada de una biopsia, causando problemas para encontrar la ubicación exacta de la región de interés. Este problema debe ser evitado mediante el uso de las coordenadas estereotáxicas. La fijación química con acroleína y la técnica de pre-incrustación propuesto anteriormente proporciona una, de bajo costo fácil, eficiente en tiempo, y un método fiable para la preparación de muestras de tejido cerebral de los primates y inmunomarcaje para EM. Siguiendo estos pasos, se obtendrá una ultraestructura bien conservado junto con antigenicidad para permitir la inmunomarcación de la mayoría de las proteínas. Sin embargo, la fijación química para EM también tiene sus desventajas. En primer lugar, mientras que las soluciones fijadores tales como acroleína preservar los detalles morfológicos del tejido cerebral, es posible que algunos cambios morfológicos se producen durante el proceso de fijación química y alteran los resultados en comparación con los que se obtendrían con técnicas de crio-sustitución CEMOVIS o. En segundo lugar, el proceso de fijación ydeshidratación posterior necesario para la resina de la incrustación de eliminar la mayoría de los fluidos extracelulares y apretar componentes celulares juntos, provocando la contracción de tejido que modifica significativamente su tamaño y forma en comparación con las células de la crio-fija 21, 30. No obstante, la fijación de aldehído se ha utilizado con éxito en muchos laboratorios de todo el mundo y es ampliamente aceptado en la literatura como un método fiable para el estudio de las características ultraestructurales de las neuronas y células gliales, a pesar de las preocupaciones mencionadas anteriormente 21, 30, 31, 32.

En comparación con el método descrito anteriormente, la inmunohistoquímica postembedding que se necesita para las muestras crio-fijo incrustados en resina de metacrilato, es menos sensible y la detección de antígenos del sistema nervioso central es limitada 14 >, 33. Sin embargo, la fijación de aldehído también tiene sus limitaciones en lo que respecta a la antigenicidad. Por lo tanto, es importante para probar la especificidad de los anticuerpos para un protocolo de fijación química dada en el plano LM antes de iniciar la preparación EM. La calidad de inmunohistoquímica sobre tejido cerebral acroleína-fija también depende de romper previamente los lazos de aldehído fuertes creados por la fijación química. Este paso se puede lograr mediante la incubación de las secciones antes de la inmunohistoquímica con borohidruro de sodio (consulte los pasos 3.3 a 3.5). La omisión de este paso definitivamente a inmunotinción subóptima 34. Si los anticuerpos a ser utilizados no se dé por tinción óptima en secciones de cerebro fijadas con acroleína, es posible utilizar alternativamente glutaraldehído (0,1 - 2%) diluido en PFA al 4%. Esto se ha demostrado bien preservar ultraestructura cerebro mientras se mantiene suficientemente la antigenicidad para muchos anticuerpos y para proporcionar tejido cerebraladecuada para el almacenamiento a largo plazo con alteraciones mínimas 20, 21, 35, 36, 37. También es posible lograr relativamente buena fijación y antigenicidad adecuada para EM con PFA solo mediante la elevación de manera significativa el pH de la solución, sino una combinación de más de un fijador durante la perfusión ha proporcionado mejores resultados 34, y estudios apoyan que la fijación PFA solos generalmente producir tejido mal conservado para su examen EM 38, 39. Sin embargo, en algunos casos raros, la antigenicidad es muy difícil de mantener, y PFA la fijación, sigue siendo la única opción viable para el examen EM.

Muchos pasos de este protocolo deben seguirse cuidadosamente con el fin de obtener los resultados óptimos. Por ejemplo, la preparación de la solución de PFA 4%debe realizarse a temperaturas superiores a 45 ° C con el fin de permitir que el polvo de PFA se disuelva, pero es imperativo que la temperatura permanece por debajo de 60 ° C. De lo contrario, la solución de PFA despolimeriza en formaldehído y ácido fórmico, que fija el tejido de manera diferente y forma una solución ácida que podría alterar significativamente la calidad del tejido 40, 41. Además, es fundamental que se realizarán los pasos de perfusión a cabo rápidamente una vez que el diafragma se ha reducido, ya que la hipoxia e hipercapnia producirán cambios fisiológicos irreversibles en el cerebro que podrían alterar la calidad y la integridad del tejido 31. fijación defectuosa podría ser perjudicial para la preservación de tejido cerebral y alterar permanentemente la ultraestructura del tejido, tales como membranas de plasma, las mitocondrias y las sinapsis. Por lo tanto, la preparación de la solución de perfusión y los pasos deben llevarse a cabo con cuidado. Otros preparados exitosa muestra de EMn también depende en gran medida a una buena post-fijación en tetróxido de osmio. De hecho, la perfusión directa con tetróxido de osmio se ha descrito como la producción de tejido razonablemente intacta para la observación EM 21, 39. Sin embargo, muchas diferencias en términos de la cantidad del espacio extracelular y la aparición de la membrana plasmática entre los animales de osmio-perfundido y aldehído-perfundido se han dado cuenta. Además, el ennegrecimiento y el endurecimiento de los tejidos después de la perfusión de osmio prestados la eliminación del cerebro del cráneo, la posterior disección, y la diferenciación entre materia blanca y gris más difícil, lo que favorece la perfusión aldehído para una mejor conservación del tejido y la manipulación más fácil 21. fijación aldehído solo parece reducir el espacio extracelular, lo que altera la integridad del tejido y da la impresión de uniones estrechas donde el espacio extracelular debe ser visto, en su defecto por lo tanto para mostrarmicrografías electrónicas aceptables incluso después de plomo tinción citrato 42. Sin embargo, postfixation en tetróxido de osmio invierte esta situación al permitir una separación más clara entre elementos del tejido, que es necesaria para su identificación 42, por lo tanto justificar claramente la importancia de llevar a cabo los pasos osmification (pasos 4.1 a 4.2) con precaución.

Las condiciones y concentraciones en que se realizan estos pasos se han probado en nuestro laboratorio, específicamente para inmunohistoquímica pre-incrustación utilizando DAB como el precipitado en secciones de cerebro de primates. Aunque habilidad desafiante, doble inmunohistoquímica es posible a través de post-incrustación de inmunohistoquímica con partículas de oro 43. El denso en electrones DAB precipitado obtenido después de la técnica de inmunoperoxidasa-diaminobencidina propuesto aquí es muy fácil de identificar en el nivel EM, ya que describe membranas de plasma y fueraer superficies de orgánulos, mientras que todavía permiten la identificación de los componentes subcelulares, tales como las mitocondrias y los contactos sinápticos. Además, una vez que la presente técnica se domina por solo inmunohistoquímica, es posible llevar a cabo doble inmunohistoquímica mediante la combinación de DAB precipitar a partículas de oro, que han de discernir más fácilmente una de otra que las partículas de oro de diferentes tamaños. Le recomendaríamos haciendo pruebas rigurosas de la especificidad del anticuerpo, las concentraciones de osmio, y el tiempo de incubación y la temperatura antes de procesar las secciones del cerebro para EM. Los protocolos para pre-incrustación y doble inmunohistoquímica para EM han sido publicados anteriormente y puede ser adaptado para el tejido de primate cerebro 16.

En conclusión, el protocolo de perfusión transcardiaca para primates no humanos presentado anteriormente permite el almacenamiento a largo plazo de las secciones del cerebro que posteriormente se puede utilizar para EM inmunohistoquímica pre-incrustación. seccións obtenidos también son adecuados para estudios neuroanatómicos en el plano LM. Por lo tanto, mediante el uso de un protocolo que es adecuado tanto para EM y LM, es posible reducir el número de animales utilizados, una consideración de coste eficiente y ética. También permite una comparación directa entre los resultados obtenidos en el LM y los niveles de EM en el mismo animal y permite el uso de estudios de microscopía electrónica (CLEM) correlativo Luz y. Estudios CLEM han centrado principalmente en el uso de ratones modificados genéticamente que expresan proteínas fluorescentes, tales como EGFP, que más tarde podría ser marcado con precipitado denso en electrones y los observados en el nivel EM 44. Alternativamente, para evitar el problema de la inmunohistoquímica, la crio-fijación se puede combinar con una inyección intraneuronal de marcadores densos en electrones, tales como puntos cuánticos 45, antes de la congelación, lo que permite la visualización en el nivel EM 46. Sin embargo, los puntos cuánticos no son biocompatibles, ysu uso es costoso y requiere mucho tiempo debido a la aparato de congelación adicional necesaria para la preparación del tejido posterior. Aunque estas técnicas todavía favorecen crio-fijación y métodos de sustitución se congelan, hay algunos desarrollos para el uso de etiquetas químicas en secciones semi-finas (300 nm) para etiquetar diferentes proteínas celulares con fluoróforos sintéticos, que puede ser correlacionado con el análisis de EM 47 . Técnicas que permiten, por ejemplo, la correlación entre una localización axón específica usando fluorescencia y su relación sináptica con las neuronas de una estructura diana determinada utilizando EM, son bastante prometedor para la comprensión de la organización del sistema nervioso, específicamente en primates. En este caso, la fijación acroleína debe ser favorecida sobre glutaraldehído, ya que éste producirá autofluorescencia que podría alterar la visualización correcta de las estructuras cerebrales a nivel LM. Sin embargo, muy pocos estudios de este tipo se han llevado a cabo en los primates, mdebido a ayorm ente desafíos técnicos y el alto costo que imponen tales experimentos. Por lo tanto, se necesitan nuevos desarrollos para estudios exitosos y CLEM bajo costo en primates, tales como la mejora de los métodos de fijación o el uso de etiquetas químicas visibles tanto en el LM y los niveles de EM.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, 401.848 a 2.011 a MP). MP recibió un premio de la carrera desde el Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE fue el beneficiario de una beca de doctorado de las FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Agradecemos a Marie-Josée Wallman para la asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
NaOH EMD SX0590-1 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) Sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18 G 11/2
Needle terumo  NN-2713R 21 G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma S-9125
Normal horse serum (NHS) Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1,000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3,3'-diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0.005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152
4% 19150
 Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin Sigma A: M epoxy resin (44611)
B: hardener 964 (44612)
C: accelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plasticizer (44614) 		 Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate Sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter Corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

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References

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

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Neuroscience Emisión 122 microscopía electrónica de transmisión mono neuroanatomía inmunohistoquímica anticuerpos acroleína la perfusión transcardíaca la incrustación ultramicrotomo
Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de
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Eid, L., Parent, M. Preparation of… More

Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

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