Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55397

Summary

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

Abstract

ışık mikroskobu düzeyinde tüm teknolojik gelişmelere rağmen, elektron mikroskobu böyle sinaptik kişiler gibi nöronların, ultrastrüktürel ve morfolojik ayrıntılarını incelemek ve karakterize edilmesi sinirbilimindeki tek uygulama. elektron mikroskobu için, beyin dokusunun iyi koruma titiz kriyo-sabitleme yöntemleri ile elde edilebilir, ancak bu teknikler oldukça maliyetlidir ve tanımlanan nöronal sistemler arasında bağlantı anlamak önemlidir immunolabeling kullanımını sınırlar. Dondurularak ikame yöntemleri immunolabeling ile kriyo-tespitin bileşimini sağlamak için geliştirilmiştir. Ancak bu metodolojik yaklaşımların tekrarlanabilirlik genellikle masraflı donma cihazlarda dayanır. Üstelik bu teknikle güvenilir sonuçlar elde çok zaman alıcı ve beceri zorlu olduğunu. Bu nedenle, özellikle akrolein sabitleyici geleneksel kimyasal sabit beyin, elektron birleştirmek için bir zaman etkili ve düşük maliyetli bir yöntem olmaya devam etmektedirimmünhistokimya ile mikroskopi. Burada, primat beyin dokusunun korunması yol açar ve immünohistokimya ve transmisyon elektron mikroskobik inceleme öncesi gömme uyumlu kimyasal akrolein fiksasyonu ile güvenilir bir deney protokolü sağlar.

Introduction

Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Işık mikroskopisi, 2, diğer şeylerin 1 arasında vivo nöronal süreçlerde okuyan için etkin bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Işık Mikroskobik (LM) seviyesinde tipik uzamsal çözünürlük gibi aşırı ultraviyole ve yumuşak X-ışını mikroskopi için farklı ışık kaynaklarını kullanarak yaklaşık 200 nm, son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler olmasına rağmen, özellikle bir, yaklaşık 10 nm uzaysal çözünürlük 3, bu çözünürlük artmıştır , 4, 5. Görüntülemede Diğer teknolojik gelişmeler histoloji ile manyetik rezonans görüntüleme birleştirildi ve in vivo olarak miyelin kılıfının sadece Elektron Mikroskobik (EM) seviyesi 6, 7, geleneksel olarak ölçülebildiği bir parametre kalınlığının ölçülmesi için yeni bir yöntem sağlamaktır içerir. AlthouGH LM seviyesinde bu gelişmeler, örneğin, sinaptik temasların olarak yaşayan işlemleri, yapıları detaylı bir görünümünü ve karakterizasyon incelenmesi için mükemmel bir araç sağlar, 0.5 nm ulaşabilir çözünürlüğe sahip EM ile elde edilebilir. Bununla birlikte, EM seviyesinde gözlem hücre mimarisini korumak amacıyla, kimyasal tespit ve dehidrasyon işlemleri ile, bazı açılardan, ölü ve değiştirilmiş olduğu numuneler gerektirir. Bu nedenle, yüksek çözünürlükte biyolojik örneklerinin incelenmesi bağlı radyasyon elektron ışını hasar, düşük kontrast, membranların yapısal sapma, ya da 8, 9, 10 gömme aşağıdaki dehidrasyon ve epoksi oluşabilir eserler da varlığına zor olabilir.

Yapısal analiz için kendi doğal biçiminde numuneler koruma "Vitrifiye Kısımların Krio-EM" kullanılarak veya CEMOVIS bir kesit bir yaklaşım ile elde edilebilirhızlı dondurma ve camsı buz numune yerleştirme ve bir kriyojenik sıcaklık 11, 12 EM bölümü altında incelenmesi ile. Onlar hala sağlam ve tam sulu iken Bu prosedür böylece dehidrasyon nedeniyle eserler ortadan kaldırarak 13 işlediğinde, numunelerin incelenmesi için izin verir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli ek harcamalar, çok düşük sıcaklıklarda, bu gözlem olanak sağlamak amacıyla, kriyo-ultramikrotom için ilave cihazlar, hem de standart EM ek aygıtları kapsamaktadır. Buna ek olarak, CEMOVIS yaklaşım antikorlar genellikle oda sıcaklığında inkübe edilmesi gerekir, çünkü teknikleri ile immün kullanımını engeller. Seçenek olarak ise, kriyo-koruyucu kimyasal immerged ve inci ise cryo sabit Numuneler çözülür sırasında dondurularak ikame yaklaşım kullanılarak immünohistokimyasal prosedürlere ultrastrüktürel analiz birleştirmek mümkündürtr Böyle Lowicryls gibi özel reçineler, gömülü. Post-gömme immunolabeling sonra böyle materyal 12 üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, dondurularak ikamesi ve cryo-sabitleme teknikleri zaman alıcıdır. Bunlar, ilave donanım takılmasını gerektirir ve düşük bir sıcaklıkta 14, 15 kullanımına rağmen, bir organik çözücü ve hücre mimarisini değiştirebilir kimyasal sabitleyici maruz kalması örnekleri gerektirir. Bu nedenle, özellikle akrolein LM ve EM DÜZEYİ, beyin dokusunun kimyasal sabitleme, her ikisi de tüm teknolojik ilerlemelere rağmen, EM 16 immünohistokimya birleştirmek için bir düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlayan bir yöntem olmaya devam etmektedir.

Son birkaç on yılda, birçok girişimde iyi doku korunmasını sağlayan aldehitlerin karışımı bulmak için yapılmıştır. 1960'lardan önce, EM için kabul edilebilir sonuçlar vermiştir sadece kimyasal sabitleyici ozmiyum tetroksit oldu. Bununla birlikte, ozmiyum tetroksit beyin gibi organları düzeltmek için damar sistemi aracılığıyla kullanımını engelleyen, son derece zehirli ve pahalıdır. Akrolein hücresel yapıların 17 EM, gözlem için uygun hayvan doku koruması için güvenilir bir yöntem olarak 1950'lerin sonlarında tanıtıldı. Bu daha derin doku nüfuz eder ve daldırma ile fiksasyonu için ve doku 17 minimum çekme sitoplazmik bileşenlerin iyi bir koruma sağlar, diğer aldehitler daha hızlı bir şekilde tepki verir. Bu tür enzimler ve diğer proteinleri 18 gibi moleküler bileşiklerin, canlı daha doğru bir lokalizasyonu ile, taze doku kullanıldığında Böyle bir özellik akrolein fiksasyon başka aldehitlerle üzerinde açık bir avantaj sağlar. Gerçekten de, bu etkin bir stabilitesine sahip olarak, Kurbağa ve kemirgenler de dahil olmak üzere pek çok türde, EM seviyesinde görselleştirme için fiksasyon kolay, verimli ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yıl boyunca doğrulanmıştırzes peptidler ve proteinler, antijenitesini muhafaza eden ve 16, 18, 19, 20, 21 tespit maddesi bir aldehit ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman nispeten sağlam ultrastrüktürel sağlar. Kemirgenlerde akrolein tespit için protokoller o zamandan beri standardize edilmiş ve EM 16, 22 için çift immunolabeling uygulamak, özellikle Pickel grup tarafından, yoğun kullandık. Birkaç grupları insan olmayan primat beyin dokusunda 23 akrolein fiksasyonunu kullandık. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, verimli EM 24 immunolabeling uyumlu insan olmayan primatlarda akrolein ile kimyasal fiksasyonunu açıklayan tek yayınlanmış protokol vardır.

Bu makalede, verimli kimyasal olarak uğultu düzeltmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlamaktırile immün ve iletim EM inceleme öncesi gömme birlikte, potansiyel olarak uzun süreli korunması için izin akrolein bir primat beyinler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Beyanı: hayvanların yer aldığı tüm protokoller Comité de Koruma des Animaux de l'Université Laval tarafından onaylandı ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı (Ed 2.) Hayvan Bakımı Kılavuzu Kanada Konseyi çerçevesinde yapılmıştır. Burada açıklanan protokol yaklaşık 800 g yetişkin hayvanlar için optimize edildi. sabitleştirici hacimleri hayvanın büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır.

Transkardiyak perfüzyon için Çözümler hazırlanması 1.

  1. aşağıdaki aşamalara göre bir 50 mM sodyum fosfat-tamponlu salin (PBS) çözeltisi 1 L'lik hazırlayın. perfüzyon önce en çok 24 saattir çözeltisi hazırlayın ve kullanılana kadar 4 ° C 'de devam edin.
    1. 1 L'lik bir şişeye damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 5.87 g ekleme (Na2 HPO 4), monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 1.20 g (NaH2 4 · H2O) ve 9 grsodyum klorür (NaCI). çözülmeye karıştırınız.
    2. 5 N NaOH eklenerek pH 7.4'e ayarlanmıştır. 1 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle
      DİKKAT: NaOH aşındırıcı kimyasal bileşiktir. Uygun Kişisel Koruyucu Ekipman Wear (PPE;. Laboratuvar mont, eldiven, koruyucu gözlük, vs).
  2. aşağıdaki adımlara uygun olarak% 4 paraformaldehit (PFA) 2 L hazırlayın. Bu çözelti, ameliyattan önce en fazla 24 saat hazırlandı ve kullanılana kadar 4 ° C 'de tutulması gerekmektedir.
    1. 2 L'lik bir kap içerisinde damıtılmış su, 1.5 L ölçülür. Dibazik susuz sodyum fosfat 23.48 g (Na2 HPO 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 4.80 g ekleme (NaH2 4 · H2O). çözülmeye karıştırınız. 2 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle
    2. 55 ° C - sıcaklık yaklaşık 45 ulaşıncaya kadar bir havalandırma başlık altında çözelti ısıtılır. 60 ° C'ye kadar ısıtın vermeyin.
    3. Yavaş yavaş çözeltiye PFA 80 g ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın (yaklaşık 30-60 dakika). 60 ° C'nin altında tutmaya sıcaklığının kontrolü tutun.
      DİKKAT: PFA olarak toz formunda çok uçucudur. Gözler veya deri ile teması halinde çok zehirlidir ve solunum veya sindirim durumunda tehlikelidir. PPE Aşınma ve bir havalandırma başlık altında dikkatli bir şekilde kullanın.
    4. 4 ° C ve filtreye çözeltiyi soğutun. 4 ° C'de saklayın.
  3. aşağıdaki adımlara uygun olarak 0.1 M fosfat tampon (PB) içinde% 3 akrolein 1 L hazırlayın. PB solüsyon, perfüzyon en fazla 24 saat hazırlanmalıdır.
    DİKKAT: Acrolein teneffüs ve acil hasar meydana getirebilmektedir son derece toksiktir. Eğer deri yoluyla absorbe Ayrıca aşındırıcı ve son derece toksiktir. Bu kanserojen ve mutajen olduğunu. Uygun PPE giyin ve bir havalandırma başlık altında kullanın.
    1. damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 8.66 g ekleme (Na2 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 5.38 g (NaH2 4 · H2O). Bütün tuzlar eriyene kadar karıştırın. 4 ° C'de çözüm tutun 1 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle.
    2. Ameliyat öncesi 1 L'lik bir cam kaba PB çözeltisinden 900 mL kadar transferi ve bir havalandırma başlık altında% 97 akrolein çözeltisi 30.94 ml. 1 L ilave edin ve karıştırın toplam hacme ulaşmak için PB solüsyonu ekleyin. çözüm Filtre ve 4 ° C'de saklayın.

2. transcardiac Perfüzyon ve Beyin Diseksiyon

  1. bütün cerrahi prosedür sırasında buz üzerinde çözüm tutun. (50 mM PBS) ve bir hava hortumu kalana kadar pompayı dönüm kullanılacak ilk çözelti içinde tüp yerleştirilmesi pompayı hazırlayın. bir makak maymunu transkardiyak perfüzyon için, bir 21 G iğne kullanımı ve çıkış yaklaşık 80 mL / dak ayarlayın.
  2. bir karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile anestezi hayvanketamin (20 mg / kg), ksilazin (4 mg / kg) ve asepromazin (/ kg, 0.5 mg) Ture. izofluran (% 3) sedasyon altında hayvan bakımı.
  3. Bir havalandırma masaya hayvanın uzuvları takın.
  4. bir neşter ile, koltukaltı cilt kadar kaldırın. Karın kasları kesin. dikkatle hayati organlara kaçınarak yanal kaburga kesmek için ağır cerrahi makas kullanın.
  5. Cerrahi makas ile diyafram kesip kalp açığa çıkarmak için göğüs kafesi yükseltmek. diyafram kesildiğinde kalp dakika içinde dayak durdurulmayacağından, hızla devam edin.
  6. Bir neşter bıçağı ile perikard çıkarın ve sol ventrikül içine iğne takın. bir neşter ile, dikkatlice sağ atriyuma küçük eksizyonu olun. Hızlı bir şekilde 72 ml / dakika pompayı çalıştırmak ve iğneyi yerinde tutun. Mümkünse, kalp daha düşük düzeyde başını sahip olmak için hayvan yatırın.
    NOT: İğneyi eklerken interventriküler septumu delmek için dikkatli olun.
    1. rinsakciğer kadar PBS yaklaşık 300 mL 'si ile, e Kan, beyaz ve kan sağ atriyum gelir.
  7. hızlı, pompa durdurma% 3 akrolein çözeltisine hortumu / tüp transferi ve tekrar pompayı çalıştırın. Kalp atışını durduktan sonra yavaş yavaş 80 ml / dk pompalama hızını artırmak. akrolein çözeltisi yaklaşık 500 ml serpmek.
  8. hızlı, pompayı durdurun% 4 PFA çözüm hortumu aktarmak ve tekrar pompayı başlatın. Bu adım, PFA, yaklaşık 1 L gerektirir.
    NOT: ön ayaklar bükülmezdir ve boyun sert olduğu zaman tespit tamamlanır.
  9. kafasını kesip dikkatlice kafatasının dışında beyin teşrih. cerrahi aletlerle beyin zarar vermemeye özen gösterin. Beyin, uçuk (kan eser) ve katı (Şekil 1A) olduğu zaman perfüzyon en uygunudur.
  10. 4 ° C'de 1 saat süresince% 4 PFA içinde sağlam beyin bırakın.
  11. Seri olarak bir soğutma vibratome (4 ° C) ile beyin kesilmişve 50 um kalınlıkta bölümler halinde istenilen düzlemde PBS (0.1 M) (Şekil 1B) bunları toplamak.
    NOT: Bu adım, istenen protokole göre birçok yönden yapılabilir. Yarıküreleri kesme, ya da muhafaza bütün vibratome önce ayrılabilir. Beyin vibratome platformu için çok büyükse, daha küçük bloklar halinde kesilebilir. Bu aşamadan sonra, bölümler% 40 PB (50 mM),% 30 gliserol ve% 30 etilen glikol yapılmış bir antifriz solüsyonu içinde -30 ° C de, uzun bir süre boyunca saklanabilir.

3. İmünohistokimya Ön gömme (Şekil 1C)

  1. aşağıdaki gibi Tris-tamponlu salin içinde bir 4 L'lik bir stok çözeltisi (TBS, 50 mM, pH 7.6) hazırlayın.
    1. , 4 L'lik bir beher içinde damıtılmış su 2L ölçün trihidroksimetil aminometan ve 24.23 g ekleyin (THAM C 4H 11 NO 3) ve bir karıştırma çözülmesi için.
    2. 1 N HCI, yaklaşık 148 mL 'si ile 7.6 arasında pH ayarlayın. asit cauti ile eklenmelidirile 7.6 altındaki bir pH değerine ulaşılana önlemek için. Toplam hacim olmalıdır 4 L
      DİKKAT: HCl aşındırıcı etkisi. Uygun PPE giyin.
  2. ilgi alanı ihtiva eden (aşama 2.11) bölümleri seçin EM imünohistokimya için işlenecek.
  3. antifriz solüsyonu durulama, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde serbest yüzen bölümler 3x (0.1 M, pH 7.4) yıkanır.
  4. PBS içinde seyreltilmiş NaBH4 bir% 0.5 çözelti hazırlayın.
    1. NaBH4 0.05 g tartın ve 10 ml PBS içinde seyreltin. Kapatma. Kullanımdan hemen önce bu çözelti hazırlayın.
  5. Oda sıcaklığında 30 dakika için taze hazırlanmış NaBH4 çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. Kapatma.
  6. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde yıkama 3x, reaksiyon gazının hiçbiri kadar kuvvetli bir şekilde sallanan kalır.
  7. % 2 göre normal serum ve PBS içinde sulandırılmış% 0.5 soğuk balık jelatininin EM için bloke edici bir çözelti hazırlayın.
    NOT: Miktar shouliçin hesaplanır d Aşağıdaki üç adım için yeterli olması. ikincil antikor barındıran aynı hayvan türlerinden oluşan bir serum kullanın. bu yöntemler, önemli ölçüde doku kalitesini tehlikeye antijen alma yöntemleri ya da Triton az miktarda ilave kullanımını önlemek, (antikorlar penetrasyonunu artırmak için).
  8. Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici çözelti içinde bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
  9. bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi hazırlayın.
    Not: Primer antikor konsantrasyonu, genel olarak LM immünohistokimya ile aynıdır, ancak bazı birincil antikorlar akrolein çalışmayabilir olarak, daha önce farklı bir antikor konsantrasyonları ile testler düşünün. (-% 2 0.1) ve transkardiyak perfüzyon için% 4 PFA ve benzer sonuçlar elde Eğer öyleyse, o glutaraldehit bir karışımını kullanmak da mümkündür. inkübasyon süresinin ve sıcaklığın yanı sıra duruma getirin.
  10. Primer antikor solüsyonu içinde bölümleri inkübegece boyunca hafifçe çalkalanarak ilave edilir. önceden test edilmiş inkübasyon süresi ve sıcaklığı kullanın.
  11. hafif sallama ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde bölümleri 3 kez yıkanır.
  12. bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor 1000 çözeltisi: Bir 1 hazırlayın.
    NOT: ikincil antikor birincil bir antikor üretmek için kullanılan konakçı türlerine karşı yükseltilmelidir.
  13. Oda sıcaklığında 1.5 saat için ikincil antikor çözeltisinin bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
  14. en az 60 dakika önce ikincil antikor inkübasyonun sonunda bir avidin-biyotin-peroksidaz (ABC) çözeltisi hazırlayın.
    1. A ve B solüsyonlarının 8.80 uL / ​​mL ölçmek ve PBS içinde seyreltilmesi, kalibre edilmiş bir pipet kullanın.
    2. avidin ve biyotin molekülleri arasındaki bağlanma tamamlaması izin vermek için oda sıcaklığında en az 60 dakika boyunca hafif sallayın.
  15. İkincil antikor çözeltisi içinde inkübe edildikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 3 kez yıkanır.
  16. böylece ABC bölümleri inkübeOda sıcaklığında 1 saat boyunca Devriminin. hafifçe sallayın.
  17. hafif sallama ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile TBS içinde bir kez PBS ile iki kez yıkanır.
  18. TBS içinde seyreltilmiş% 0.005 H2O 2% 0.05 3,3'-diaminobenzidin (DAB), taze bir çözelti hazırlayın.
    1. DAB 12.5 mg tartılır ve soğuk TBS 25 mL seyreltik. Işıktan koruyunuz.
      DİKKAT: Solunması DAB tozu çok uçucu ve zararlıdır. Bu karsinojenik ve teratojenik olduğunu. seyreltilmiş Dolayısıyla, hamile veya emziren kadınlar bile, bu ürünü manipüle olmamalıdır. işlenirken bir N95 maskesi kullanın ve PPE giyerler.
    2. Çözelti süzülür ve kullanımdan hemen önce,% 30 H2O 2 4.5 uL ekleyin.
  19. Oda sıcaklığında 3 dakika ila 7 DAB çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
    NOT: kahverengi çökelti arka plan boyama yüksek düzeyde önlemek için çok karanlık olmamalıdır. İnkübasyon süresi buna göre optimize edilmelidir.
  20. hızla iki kez yıkayarak reaksiyonu durdurunSoğuk TBS içinde, daha sonra iki kez oda sıcaklığında, soğuk TBS içinde 10 dakika kadar hafif bir sallama ile PB iki kez 10 dakika, ardından.
    Not: PB (olup PBS) kullanımı, osmiyum ve form kristalleri ile tepkimeye gibi, NaCI izlerini ortadan kaldırmak için kritiktir.

Elektron Mikroskobik Gözlem 4. Osmification ve katıştırma

  1. PB içerisinde seyreltilmiş,% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi (OsO 4) hazırlanması. Işıktan koruyunuz.
    DİKKAT: Osmiyum çok zehirlidir ve deri, gözler ve ağız ile temas etmemelidir ve teneffüs edilmemelidir. Şayet yutulursa ölüme neden olabilir. Sadece bir havalandırma başlık altında ve uygun KKD ile kullanılmalıdır.
  2. (Çalkalama olmaksızın) havalandırma başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca OsO 4 çözelti içinde bölümleri inkübe ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapak. Tamamen OsO 4 çözümü eklemeden önce bölümleri dümdüz.
    NOT: bölümler çok karanlık ve ri halinegid ve bu adımda aşağıdaki dikkatle manipüle edilmelidir.
  3. osmification sırasında su geçirmez bir epoksi reçinesi hazırlayın.
    1. büyük bir plastik bardağa epoksi reçine karışımı (epoksi reçinesi 20 g, sertleştirici 20 g, hızlandırıcı 0.6 g ve plastikleştirici 0.4 g) her bir bileşenin uygun miktarlarını ekleyin. homojen kahverengi bir renk elde edilene kadar ağaç dalını ya da plastik bir pipet ile karıştırılır.
      NOT: Her bileşenin kesin oranını kullanmak için kritik öneme sahiptir.
    2. Uygun boyutlarda alüminyum bardak eşit miktarlarda transfer, bölümlerin sayısına bağlı olarak işlenecek. o dinlenmeye bırakın.
  4. osmificated bölümler düşük hızlı sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PB 3 kez yıkanır.
  5. 2 dakika her biri için derecelendirilmiştir etanol aşağıdaki dizi bölümleri kurutmak:% 35 etanol içinde 2 kez; 1 saat 50 içinde, her biri 70, 80, 90, ve% 95 etanol; ve% 100 etanol içinde 3 kat.
  6. dehydrati tamamlamak için cam şişe için bölümleri aktarınpropilen oksit içinde 2 dakika boyunca bölümlerini 3 kez inkübe edilerek süreci.
    DİKKAT: Propilen oksit çok uçucu ve toksik organik çözücüdür. Bu temas etmesi halinde veya solunması veya yutulması gözlere veya deride ciddi hasara neden olabilir. Bu bir sınıf 2 kanserojen madde olarak sınıflandırılmıştır. Sadece bir havalandırma başlık altında ve KKD ile kullanılmalıdır. Ayrıca son derece yanıcı ve uzak herhangi bir ısı kaynağından tutulmalıdır.
    Not: propilen oksit, organik bir çözücü madde ve plastik ile uyumlu olduğu Bu aşamadan önce, bölümler dikkatle cam şişelere transfer edilmelidir. Bu noktada, bölümler çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir. Bölümler, alternatif olarak 4.5 aşamasından önce cam şişelere transfer edilebilir.
  7. dikkatle Transferi bölümleri, alüminyum bardak birer birer ve mümkün olduğunca hava ile temasını engellemek. Düz gömmek önceden karıştırılmış olan su itici, epoksi reçinesi bölümleri ve VENTIN altında gece boyunca inkübeOda sıcaklığında g başlık.
    NOT: Bu adımda, bölümler tamamen susuz ve çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir.
  8. mineral yağ kullanılarak, yağlanmış plastik lamelleri ile birlikte yağ kaplı cam slaytlar hazırlar.
  9. en 12-15 dakika boyunca 60 ° C de, alüminyum bardak inkübe edilerek reçine yumuşatın. Dikkatle cam slayt yağlanmış tarafında bölümleri düzleştirmek. yağlanmış lamel yerleştirin ve dikkatlice kalan havayı dışarı itmek.
  10. 48 saat boyunca 60 ° C 'de slaytlar inkübe edin.
    NOT: Reçine çok zor olacağından, 48 saat inkübasyon süresi aşmayacak şekilde Bu kritik öneme sahiptir.
  11. plastik lamel çıkarın.

Geçirimli Elektron Mikroskobu kullanılarak Ultra ince Kesit ve Gözlem 5. Numune Hazırlama

  1. Ilgi bölgeyi bulmak için dürbün kullanın ve bir neşter ile yaklaşık 1 mm 2 küçük dörtgen bir parça kesti.
  2. bir reçine bloğun uç dosya ve qu tutkaladrangular bir parçanın üzerine (Şekil 1C). Tutkal, en azından 1 saat ya da kesit önce gece boyunca kurumaya bırakın.
  3. Bir ultramikrotom kullanılarak, 80 um-kalınlıkta bölümler (Şekil 1D) içine dörtgen parça kesin.
    1. kademeli düz kenarlara sahip bir yamuk oluşturmak için reçine bloğun her tarafı kesilmiş, keskin bir tıraş bıçağı kullanılarak, dikey konumda bir ultramikrotom güverte reçine blok yerleştirin ve.
    2. yatay konumda üst koyun ve trapezoidin uzun kenarı aşağı doğru bakan kadar blok döndürmek.
    3. dörtgen parçanın yüzeyini kesmek için bir elmas kırpma aracı veya bir cam bıçak kullanın. ultramikrotom / s, 1 mm, 300 mikron kalınlığında kesitler kesilmiş olarak ayarlayın. dikey olarak dört köşeli bir parça olarak paralel ve yaklaşık olarak 1 ° 'lik bir çok küçük bir yatay açı göstermek için bıçak ayarlayın.
      NOT: Bu açı hemen hemen b yüzeyine paralel kullanıcı doku yaklaşım sağlayacakimmunolabeled elemanlar bulunabilir olasılığı daha yüksek olduğu, kilitleyin. Elmas kırparak aracıyla bu parametreleri kullanırken, reçine parlak beyaz rengi görüntüler. Doku kesiliyor olduğunda, mor ya da yeşilimsi bir renge dönüşür.
    4. ksilen içinde uçlu emici kağıt bir parça ile üzerinden geçen bölümler arasında pürüzsüz, 80 um kalınlığında kesitler kesmek için damıtılmış su ile dolu bir tekne ile donatılmış bir Ultra 45 ° elmas bıçak kullanarak ve formvar kaplı nikel yuvası ızgaralar ya da seri bölümlerini toplamak çıplak 150 örgü bakır ızgaralar (Şekil 1 E).
  4. bir ızgara, muhafaza kutusu ızgaraları yerleştirin.
  5. kurşun sitrat ile ızgaralar leke.
    1. 1 filtre kurşun sitrat stok çözeltisi çözeltisi ve filtre edilmiş, damıtılmış su: 5 ml şırınga ve bir 1 hazırlanması için bir 0.2 um şırınga filtresi kullanın. Işıktan koruyun.
      NOT: kurşun sitrat stok çözeltisi katı DEPOS oluşumunu önlemek için her ay taze yapılmalıdıronun. Stok tarifi için malzeme bir fiş bakınız. ızgaraları birçok dizi lekeli gerekiyorsa o sütlü hale Buna ek olarak, seyreltilmiş çözelti değiştirin.
    2. çözelti ile temas halinde bölümü ile seyreltilmiş bir çözelti damla üzerine her bir ızgara yerleştirin. 3 dakika süreyle inkübe edin.
    3. ızgara tutmak için küçük cımbız kullanarak ve damıtık su içeren iki kap içinde durulayın.
    4. hafifçe emici kağıt kullanarak fazla su çıkarın. bir ızgara kutusuna ızgaraları saklayın. (Şekil 1F TEM) Transmisyon Elektron Mikroskobu ile bölümleri incelenerek 30 dakika önce bekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu bölümde, kimyasal olarak% 3 akrolein karışımı% 4 PFA ile sabitlenmiş immüno primat beyin dokusu, iletim EM seviyesinde, gözlem yapıldıktan sonra elde edildi temsili sonuçları sunulmaktadır. Nispeten sağlam miyelin kılıfının ve çift zarlar (Şekil 2A) düzgün görselleştirme ile gösterildiği gibi, yapısı ile ilgili iyi bir koruma elde etti. Mikro nöronal maddelerle birlikte, sinaptik iletişim bilgileri, kolayca (Şekil 2B) tespit edilebilir. diaminobenzidin (DAB) ile etiketlenmiş immünoçökeltme Nöronal elemanları, dolgulu sitoplazma veya axoplasm ile EM seviyede tanınır. Plazma membranı ve organellerin dış yüzeyi ayrıca, tipik olarak elektron-yoğun bir çökelti (Şekil 3) ile kaplanmıştır.

Bu özel deneyde, antikorlar aga kullanılanDış (GPe) veya sincap maymunu Globus pallidus (Şekil 3) iç (GPI) segmentinde imüno nöronal elemanları görselleştirmek için serotonin taşıyıcısını (SERT), kolin asetiltransferazı (ChAT) ya da tirosin hidroksilaz (TH) inst. Bunu yapmak için, biz detaylı morfolojik soruşturma izin ultrastrüktürdeki yanı sıra antijeniteyi korumak fiksatif kimyasalların bir arada kullanılmıştır. Birçok antikorlar yukarıda açıklanan transcardiac perfüzyon protokolü ile kullanılabilse de, bazı primer antikorlar akrolein tespitle optimum immunolabeling vermemeyi bilinmektedir beri kullanıcılar, önceden optimizasyon konsantrasyon testleri önerilir. antikorlar, akrolein tespit optimal ile immün sağlamayan Alternatif olarak, 0.1 bir seyreltme -% 4,% 2 gluteraldehit PFA ile transkardiyak perfüzyon şeklinde kullanılabilir. Birçok için korunmuş antıjenıkliğı akrolein tespit edilmiş olan beyin doku nispeten eşdeğer dokusu kalitesi sağlarantikorları (Şekil 4).

Son olarak, uygunsuz manipülasyonlar takip edilerek elde edilen EM fotomikrografların tipik örneklerini temin etmektedir. Güvenilir bir kimlik ve etiketlenmiş ve etiketlenmemiş nöronal elementlerin analiz önlenmesi nörit çift zarlar (Şekil 5C, D), bir görselleştirme zayıf bir sabitleme değiştirilmiş miyelin kılıfı ile sonuçlanır (Şekil 5A, B) ve zorluklar. DAB çözelti içinde aşırı bir inkübasyon süresi fazla arka plan ve potansiyel olarak yanlış pozitif sonuçlar üretebilir spesifik olmayan lekeler oluşturur. Arka plan veya non-spesifik boyama bazen (Şekil 6A, B), nöronal elementlerin eksik olarak boyama görünür, ancak daha sık olarak çok yakından lekeli nöronal elemanları (Şekil 6C, D) yer. bloke edici çözelti içinde deterjan kullanımı önemli ölçüde doku kalitesini değiştirir. Kayıp yol açabilirzor mikro herhangi akut yorumlanması oluşturma etiketli elemanlar (Şekil 7A) veya miyelin kılıfı (Şekil 7B) ve hücre membranları (Şekil 7C) bozulması, içinde organeller. Son olarak, sodyum klorid içeren yıkama solüsyonu kullanılarak osmification işleminde bir yanlış adım, hücresel yapılar (Şekil 7D) ayırt etmek zordur güvenilir sonuçlar verir.

Şekil 1
Şekil 1: Protokol temel adımlar Şemalar. Maymun beyin (A), bir soğutma vibratome (B) seri bölümler halinde kesilir. Daha sonra, için işlenir ön gömme ilgi bölgesi 80 nm kalınlığında bir SECTI bir reçine blok (C) ucu üzerine yerleştirilmiş ve kesilir ve bundan sonra immünohistokimya ve elektron mikroskobubir ultramikrotom (D) ons. Ultra ince kesitler daha sonra kurşun sitrat ve transmisyon elektron mikroskobu (F) altında takip edilmesi için hazır ile boyanmış, çıplak 150 örgü bakır ızgaralar ya da formvar kaplı nikel ızgaraları (E) üzerinde toplanır. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2: Acrolein-PFA transkardiyak perfüzyon sonrasında İyi korunmuş Primat Beyin Dokusu. Sincap maymunu (Saimiri sciureus) GPI (A) ve GPe (B) gösteren temsilcisinin beyin dokusu elektron mikrografları, akrolein-PFA transkardiyak perfüzyon ve immunoperoksidaz-diaminobenzidin tekniği uygulandıktan sonra malzeme iyi korunmuş. makson (a) Yelin kılıf (A ok ucu bakınız) nispeten sağlam, ve genel ultra yapısı, A ve B Dendritik profillere (d) 'de korunur, küçük myelinsiz aksonlar, (a) ve akson varisler (av) kolayca can tanımlanabilir. Bir dendritik profil (d) (oklar arasında) bir simetrik sinaptik temas kurarak bir akson varisler bir örneği B gösterilmiştir. Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3: mmunoperoksidaz-diaminobenzidin Tekniği kullanılarak sincap maymunu GPe ve Kolin asetiltransferaz GPi imüno-asetiltransferazı (ChAT), serotonin (SERT) ve tirosin hidroksilaz (TH) gelen Bölümler. Immunoetiketli elemanlar kolaylıkla elektron-yoğun bir DAB çökelti ile doldurulacaktır sitoplazma veya axoplasm tarafından tespit edilebilir. GPI bir ChAT immüno dendrit etiketlenmemiş bir akson varisler (av) den (oklar arasında) bir sinaptik temasa alır A 'da görüldüğü gibi etiketlenmiş dendritik profiller, dolu mikrofilamanlardan tarafından kabul edilmektedir. B elektron mikrografıdır axoplasm TH için immunolabeled bir nispeten sağlam miyelin kılıfı ile GPe bir miyelinli akson gösterir. C Örnek GPI'nm bir akson varis SERT için immunolabeled gösterir ve dendrit (d) (oklar arasında) bir simetrik sinaptik iletişim kurmak için görülmektedir. Bu örnekte, DAB çizgileri membranı ve organel (mitokondri ve sinaptik veziküllerin) dış yüzeyini hızlandırabilir. D'de gösterilen akson varis GPe gözlenmiştir ve TH için immunolabeled ve DAB bir örneğini temsil eder, tamamen axop doldurma çökelti oldusinaptik kesecikler ile lasm görülebilir fakat tanımlamak için daha zor olan. etiketli akson varicosity çevreleyen miyelinli ve myelinasyona akson (a) ve zaman zaman dendritler (d) ile gösterildiği üzere mikro elemanları kolayca tespit edilebilir. Elektron mikroskobu 25, 26, 27 ila değiştirilir. Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4: glutaraldehit-PFA transkardiyak perfüzyon sonrasında Primat Beyin Dokusunun örnekler. Performi sonra da makak maymunu (Maçaca fascicularis) GPe (A) ve gpl (BD) ve beyin dokusu temsili elektron mikrografları% 0.2 glutaraldehid ile Ng transkardiyak perfüzyon serotonin transporteri (SERT) karşı bir antikor ile% 4 PFA ve immunperoksidaz-diaminobenzidin tekniği ile karıştırılır. Şekil 2'de olduğu gibi, elemanlar elektron yoğun DAB çökelti ile dolu sitoplazmalarının ve axoplasm ile tespit edilebilir imüno. Genel ince yapısı nispeten sağlam ve etiketli akson varikoziteler çevreleyen miyelinli ve myelinasyona akson (a) ve zaman zaman dendritler (d) ve akson varikozitelerle (av) ile gösterildiği gibi, Şekil 2'de tarif edildiği gibi mikro-unsurları kolayca tespit edilebilir. Bununla birlikte, iyi tanımlanmış plazma membranları (ok başları) ile gösterilen ince yapısı kalitesinin tutarsızlık, ama nispeten zarar miyelin kılıfını (ok). Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.


Şekil 5: Bir başarısız transkardiyak perfüzyon aşağıdaki elde edildi Primat Beyin Dokusunun örnekler. Başarısız bir kimyasal sabitleme sonuçları sincap maymunu GPi burada gösterilir (A - B) ve GPe (Cı - D), transkardiyal% 0.9 NaCl yıkama çözeltisi ve buz soğukluğunda% 4 karışımı ile perfüze PFA ve% 15 pikrik asit seyreltildi 0,1 M PB (pH 7.4). Brain% 4 PFA ve% 30 sukroz içinde 4 ° C'de 1 saat sonrası sabit ve bir soğutma vibratome 60 um kalınlığında sagital bölümler halinde kesilmiştir. Uygun olmayan tespit edilmiş olan beyin doku hasarlı bir miyelin kılıfının (A ve B, ok başları) tarafından, hem de (örnekler için ok uçları bakınız, C ve D) bulanık veya tanımlanmamış plazma membranları tarafından kabul edilebilir. Farklı nöronal elemanlar dif edilirficult güvenilmez ultrastrüktürün herhangi yorumunu render tespit etmek. Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6: sincap maymunu GPe olarak spesifik olmayan ChAT immuno örnekler. B (ok uçları) - A 'de gösterildiği gibi arka plan boyaması veya spesifik olmayan immuno bazen büyük hücre elemanlarının EM kısmi boyama altında görünür. Bu tür spesifik olmayan boyama immunohistokimyasal bölümlerin yüzeyinde daha sık görülmektedir. spesifik olmayan immunolabeling diğer örnekleri, kısmen veya tamamen DAB ile doldurulur ve bir a çok yakın bulunan küçük, myelinsiz aksonlar çağrıştıran çok küçük elemanların sık gözlem içerirnother olarak C ve D'de ok uçlarıyla gösterdi. Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 7,
Şekil 7: Elektron Mikroskopi Örnek Hazırlama yanlış bir adım sonrasında Hasarlı Sincap Maymun GPe Doku. Triton X-100 gibi bir deterjan kullanımı, daha da% 0.02 gibi düşük bir konsantrasyonda bloke çözeltisi içinde, esas olarak (dendritler sitoplazmasına (A) ya da akson miyelin kılıfını zarar vererek B yapısı ile ilgili bütünlüğünü değiştirir ). Plazma membranları hasar ve tanımlamak için zor olduğundan farklı nöronal elemanları, aynı zamanda bir başka (C) ayırt etmek zordur. osmification işlemi alsNumune hazırlanması o önemli bir adım. Çözeltiler (D), yıkama içinde sodyum klorür kullanılması zordur, müteakip analiz işleme, doku fiksasyon değiştirir. Ölçek çubuğu: 800 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, insan-olmayan primatlar ve EM örnek incelenmesi için uygun ön gömme immünohistokimya ile transkardiyak perfüzyon için güvenilir bir protokol mevcut. Örneğin CEMOVIS gibi tipik cryo-EM, beyin yapısı ile ilgili iyi bir koruma sağlar, ancak, aynı zamanda, immünohistokimya 12 kullanımını sınırlar. Kriyo-değiştirme ve Tokuyaso tekniği de dahil olmak üzere başka teknikler, immünohistokimya gömme sonrası sağlar, ancak bu teknikler, işlem sırasında gerekli olan ek cihazlara pahalıdır ve zaman alıcıdır ve 12, 14, 15 beceri zor olabilir. Ayrıca, etkili bir şekilde kriyo-sabitleme yöntemi kullanmak için, numune (atmosferik basınçta 29 ile 28 ve 10 um donma, yüksek basınç kullanıldığında kalınlıkta 200 um kadar) nispeten küçük olması gerekir. İdeal olarak, iyi olsunprimat beyin dokusu kriyo-tespitle sonuçlar, numune ilgili bölgenin tam yerini bulma sorunlara yol biyopsi alınması gerekir. Bu sorun stereotaksik koordinatlar kullanılarak engellenebilecektir gerekir. akrolein ve yukarıda önerilen ön gömme yöntemi ile kimyasal sabitleme kolay, düşük maliyetli, zaman tasarruflu ve primat beyin dokusu numunesi hazırlanması için güvenilir bir yöntem ve EM için immuno içerir. aşağıdaki adımları göre, bir çok proteinin immunolabeling imkan vermek için antijenisite ile birlikte iyi korunmuş bir ultra yapısını elde edecektir. Ancak, EM için kimyasal sabitleme dezavantajları da bulunmaktadır. akrolein gibi sabitleyici çözeltiler beyin dokusu morfolojik bilgilerini korumak İlk olarak,, bazı morfolojik değişiklikler kimyasal sabitleme işlemi sırasında ortaya çıkan ve CEMOVIS veya kriyo-ikame teknikleri ile elde edilebilir ki kıyasla sonuçları değiştirmek mümkündür. İkincisi, sabitleme süreci veönemli ölçüde boyutu değiştirilebilir ve kriyo-sabit hücre 21, 30 ile kıyasla biçimden doku çökmesine neden olur, hücre dışı akışkanlar çoğunu ayırın ve birlikte hücresel bileşenleri sıkmak gömme reçine için ihtiyaç duyulan daha sonraki dehidratasyon. Daha önce endişelerini 21, 30, 31, 32 söz rağmen Yine de, aldehit sabitleme dünyada birçok laboratuvarlarda başarıyla kullanılmaktadır ve yaygın olarak nöronlarda ve glial hücrelerin ultrastrüktürel özelliklerini incelemek için güvenilir bir yöntem olarak literatürde kabul edilmektedir.

Yukarıda tarif edilen yöntem ile karşılaştırıldığında, metakrilat reçine içine gömülü cryo sabit örnekleri için gerekli olan postembedding immünohistokimya, daha az hassas olan ve merkezi sinir sistemi antijenlerin tespiti sınırlıdır 14 33. Bununla birlikte, aldehid sabitleme da antijenisite ile ilgili kendi sınırlamaları vardır. Nedenle, EM hazırlık başlamadan önce LM seviyesinde belirli bir kimyasal sabitleme protokolü için antikorların spesifitesini test edilmesi önemlidir. akrolein tespit edilmiş olan beyin dokusu üzerinde imünohistokimya kalitesi, daha önce kimyasal sabitleme tarafından oluşturulan güçlü bir Aldehit bağı kırma bağlıdır. Bu aşama (- 3.5 bakınız 3.3 adım) sodyum borohidrit ile imünohistokimya önce bölümleri inkübe edilmesi ile elde edilebilir. Bu adımı belirtilmemesi kesinlikle Suboptimal boyanmalarının 34 sonuçlanacaktır. % 4 PFA içinde seyreltilmiş - (2% 0,1), antikorlar, akrolein ile tespit edilmiş olan beyin kesitleri üzerinde uygun lekeleme vermeyin kullanılacak ise, alternatif olarak glutaraldehit kullanmak mümkündür. Bu yeterli sayıda antikorlar için antijenikliği korurken beyin ultrastrüktür iyi korumak ve beyin dokusu sağlamak için kanıtlanmıştıren az değişikler 20, 21, 35, 36, 37, uzun süreli depolama için uygundurlar. Önemli ölçüde çözeltinin pH'ının yükseltilmesi tek başına PFA EM için uygun nispeten iyi bir tespit verimine ve antijenikliği elde edilmesi de mümkündür, ancak perfüzyon sırasında birden fazla sabitleyici bir kombinasyonu daha iyi sonuçlar 34 sağlamıştır, ve çalışma, genel olarak tek başına PFA tespit destek EM muayene 38, 39 için kötü korunmuş doku üretirler. Ancak, bazı nadir durumlarda Antijenikliğin sürdürmek çok zordur ve yalnız PFA fiksasyon EM muayene için tek uygun seçenek kalır.

Bu protokolde Birçok adımlar en iyi sonuçları elde etmek için dikkatle takip edilmelidir. Örneğin,% 4 PFA çözeltisinin hazırlanmasıPFA tozu eritmek için izin vermek üzere, 45 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda gerçekleştirilen, ancak sıcaklık 60 ° C'nin altında kalır zorunludur gerekir. Aksi takdirde, bir PFA çözeltisi formaldehid ve farklı doku giderir ve önemli ölçüde doku kalitesini 40, 41 değiştirebilir bir asidik çözelti oluşturur formik asit içine depolimerize eder. Buna ek olarak, diyafram kesildiğinde hipoksi ve hiperkapni doku 31 ve kalitesini bütünlüğünü değiştirebildiği beyne geri dönüşü olmayan fizyolojik değişiklikler meydana çünkü perfüzyon aşamaları, hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir kritiktir. Arızalı sabitleme beyin dokusunun korunması için zararlı olabilir ve sürekli olarak, plazma zarları, mitokondri ve sinaps doku, ultra yapısını değiştirebilir. Bu nedenle, çözelti hazırlanması ve perfüzyon aşamaları dikkatle yürütülen gerekir. Başarılı EM örnek ilaçlan zamanda son derece osmiyum tetroksit iyi bir post-fiksasyonu bağlıdır. Gerçekten de, osmiyum tetroksitle doğrudan perfüzyon EM gözlem 21, 39 için uygun olduğu gibi üreten doku olarak tarif edilmiştir. Ancak, hücre dışı alan miktarı ve osmiyum perfüze ve aldehit ile perfüze hayvanlar arasında, plazma membranının görünüm açısından bir çok farklılık fark edilmiştir. Bundan başka, osmiyum perfüzyon sonra dokuların karalama ve sertleşme daha iyi doku koruması ve daha kolay manipülasyon 21 aldehid perfüzyon lehine, kafatası, daha sonra diseksiyon ve beyaz ve gri madde arasındaki farklılaşma daha zor beynin kaldırılmasını hale getirilir. Aldehit sabitleme yalnız dolayısıyla göstermek için başarısız, doku bütünlüğünü değiştirir ve hücre dışı uzay görülmelidir sıkı kavşaklar izlenimi verir hücre dışı alanı, azaltmak için görünürHatta kurşun sitrat boyama 42 sonra kabul edilebilir bir elektron mikrografları. Dikkatle - Bununla birlikte, osmiyum tetroksitle postfiksasyon şekilde açıkça osmification adımlarının gerçekleştirilmesi adımlarını önemini haklı, tanımlanabilmeleri 42 için gerekli olan doku elemanları arasında en kesin ayrılmasına izin vererek bu durum tersine (4.2 4.1 adım).

Bu adımlar gerçekleştirilir koşullar ve konsantrasyonlar özellikle primat beyin kesitleri üzerinde tortu olarak DAB kullanılarak immünohistokimya ön gömme için, laboratuarda test edilmiştir. Beceri zorlu çift immünohistokimya yoluyla mümkün olsa da altın immünohistokimya 43 partikülleri sonrası gömme. dışarı plazma membranları ve ana hatlarıyla çünkü elektron-yoğun bir DAB, burada önerilen immünoperoksidaz-diaminobenzidin tekniği EM seviyesinde tespit etmek çok kolaydır sonra elde edilen çökeltiorganel er yüzeyleri, hala bu tür mitokondri ve sinaptik kontaklar olarak alt hücre bileşenlerinin tespitine izin verirken. Mevcut teknik, tek immünohistokimya için hakim bir kez başka, DAB daha kolay bir şekilde farklı boyutlarda altın partikülleri daha birbirinden ayırt edilir altın partikülleri için çökelmeye birleştirerek çift immünohistokimya gerçekleştirmek mümkündür. Biz EM için beyin bölümleri işleme önce antikor spesifikliği, osmiyum konsantrasyonları ve inkübasyon süresi ve sıcaklığın sıkı test yaparak öneriyoruz. Ön yerleştirme ve EM için çift immünohistokimya için protokoller, daha önce yayınlanmış olan ve primat beyin dokusu 16 için adapte edilebilir.

Sonuç olarak, yukarıda sunulan insan olmayan primatlar için transcardiac perfüzyon protokolü daha sonra EM ön gömme immünohistokimya için kullanılabilecek beyin bölümlerinin uzun vadeli depolama için izin verir. sectioElde edilen ns da LM düzeyinde nöroanatomikal çalışmalar için uygundur. Bu nedenle, EM ve LM her ikisi için uygun olan bir protokol kullanılarak, kullanılan hayvanların sayısı, maliyet etkin ve etik dikkate azaltmak mümkündür. Ayrıca aynı hayvan üzerinde LM de elde edilen sonuçlara ve EM düzeyleri arasında doğrudan bir karşılaştırma verir ve Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobik (CLEM) çalışmalarında kullanımına izin verir. CLEM çalışmalar daha çok, daha sonra EM seviyesinde 44 elektron-yoğun bir çökelti ile etiketlenmiş ve gözlenebilir, EGFP gibi floresan proteinleri, ifade genetik olarak farelerin kullanımı üzerinde odaklanmıştır. Alternatif olarak, EM DÜZEYİ 46'da canlandırılmasına olanak tanıyan bir kuantum noktaları 45, dondurulmadan önce, elektron-yoğun belirteçleri, bir intranöronal enjeksiyonu ile kombine edilebilir immünohistokimya, kriyo-tespitin sorunu aşmak için. Ancak, kuantum noktalar biyouyumlu değildir vebunların kullanımı, takip eden doku hazırlanması için gerekli ek dondurma cihazının için pahalı ve zaman alıcıdır. Bu teknikler yine kriyo-fiksasyon tercih ve yöntemler-ikame dondurma rağmen, EM analizi 47 ile korele edilebilir sentetik fluorophores farklı hücresel proteinleri etiketlemek için yarı ince (300 nm) bölümleri üzerinde kimyasal etiketlerin kullanımı, bazı gelişmeler bulunmaktadır . Örneğin, izin teknikleri, tek bir floresan kullanılarak spesifik akson lokalizasyonu ve EM kullanarak belirli bir hedef yapısının nöronlarla olan sinaptik arasındaki karşılıklı ilişki, özellikle primatlarda, sinir sisteminin organizasyon anlaşılması için oldukça umut vericidir. ikinci LM düzeyinde beyin yapılarının uygun görselleştirme değiştirebilir otoflüoresan üretecek şekilde, bu durumda, akrolein tespiti, glutaraldehit fazla tercih edilmelidir. Ancak, bu tip çok az sayıda çalışma primatlarda taahhüt edilmiştir, mostly teknik zorluklar ve bu tür deneyler empoze yüksek maliyeti nedeniyle. Bu nedenle, yeni gelişmeler, bu tür sabitleme yöntemleri geliştirmek ya da LM ve EM düzeylerinde görünür kimyasal etiketleri kullanılarak primatlarda başarılı ve düşük maliyetli CLEM çalışmaları için ihtiyaç vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Doğa Bilimleri ve (MP NSERC, 401848-2011) Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. MP Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) bir kariyer ödülünü aldı. LE FRQ-S (FRQ-S 14D 29441) bir doktora burs alıcı oldu. Biz teknik yardım için Marie-Josée Wallman teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
NaOH EMD SX0590-1 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) Sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18 G 11/2
Needle terumo  NN-2713R 21 G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma S-9125
Normal horse serum (NHS) Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1,000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3,3'-diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0.005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152
4% 19150
Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin Sigma A: M epoxy resin (44611)
B: hardener 964 (44612)
C: accelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plasticizer (44614) 
Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate Sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter Corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Tags

Neuroscience Sayı 122 transmisyon elektron mikroskopisi maymun nöroanatomi immünohistokimya antikorlar akrolein transkardiyak perfüzyon gömme ultramikrotom
İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Parent, M. Preparation ofMore

Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter