Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Udarbejdelse af ikke-menneskelig primat Brain Tissue til Pre-indlejring Immunohistokemi og Electron Microscopy

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55397
Automatic Translation
1,2, 1
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Summary

Her, giver vi en let, billig og tidsbesparende protokol til kemisk fix primat hjernevæv med acrolein fiksativ, giver mulighed for langsigtet opbevaring, der er kompatibel med præ-embedding immunhistokemi transmissionselektronmikroskopi.

Abstract

På trods af alle de teknologiske fremskridt på lysmikroskopi niveau, elektronmikroskopi er den eneste redskab i neurovidenskab til at undersøge og karakterisere ultrastrukturelle og morfologiske detaljer af neuroner, såsom synaptiske kontakter. God bevarelse af hjernevævet til elektronmikroskopi kan opnås ved strenge cryo-fikseringsmetoder, men disse teknikker er temmelig dyrt og begrænse brugen af ​​immunmærkning, som er afgørende at forstå forbinde identificerede neuronale systemer. Der er blevet udviklet fryse-substitutionsmetoder at tillade kombination af kryo-fiksering med immunmærkning. Imidlertid reproducerbarheden af ​​disse metodiske fremgangsmåder sædvanligvis afhængig af kostbare frysning enheder. Desuden at opnå pålidelige resultater med denne teknik er meget tidskrævende og færdighed-udfordrende. Derfor er den traditionelle kemisk fast hjerne, især med acrolein fiksativ, forbliver en tidsbesparende og billig metode til at kombinere elektronmikroskopi med immunhistokemi. Her, giver vi en pålidelig forsøgsprotokol under anvendelse af kemisk acrolein fiksering, der fører til bevarelsen af ​​primat hjernevæv og er kompatibel med præ-indlejring immunohistokemi og transmissionselektronmikroskopi mikroskopisk undersøgelse.

Introduction

Lysmikroskopi, herunder konfokal og to-foton mikroskopi, har vist sig at være et effektivt værktøj til at undersøge in vivo neuronale processer, bl.a. 1, 2. Selvom den typiske rumlige opløsning på Light Mikroorganismer (LM) er ca 200 nm, nylige teknologiske fremskridt ved hjælp af forskellige lyskilder, såsom ekstrem ultraviolette og blødt røntgenbillede mikroskopi, navnlig har øget denne beslutning til en næsten 10 nm rumlig opløsning 3 , 4, 5. Andre teknologiske fremskridt i billeddannelse omfatte kombineret magnetisk resonans billeddannelse med histologi og tilvejebringe en hidtil ukendt fremgangsmåde til måling af tykkelsen af myelinskeden in vivo, en parameter, der var traditionelt måles kun på elektronmikroskopisk (EM) niveau 6, 7. although disse fremskridt på LM niveau giver et udmærket redskab til at studere levende processer, en detaljeret afbildning og karakterisering af strukturer, såsom synaptiske kontakter, kan kun opnås med EM, hvilket giver en opløsning, der kan nå 0,5 nm. Dog bemærkning ved EM plan kræver prøverne at være død og ændret på nogle måder, med kemiske fikseringsmidler og dehydrering processer, for at bevare den cytoarchitecture. Således kan behandlingen af biologiske prøver med høj opløsning være udfordrende på grund af stråling skader fra elektronstrålen, lav kontrast, strukturelle afvigelser af membraner, eller endda tilstedeværelsen af artefakter, der kan opstå efter dehydrering og epoxy indlejring 8, 9, 10.

Bevarelse prøver i deres native form for strukturel analyse kan opnås ved anvendelse af "Cryo EM forglassede sektioner" eller CEMOVIS, en skæring tilgang,involverer hastigt frysning og indlejring prøven i glaslegemet is og undersøge sektionerne under EM ved en kryogen temperatur 11, 12. Denne procedure giver mulighed for undersøgelse af prøver, mens de stadig solidt og fuldt hydreret, og dermed fjerne artefakter forårsaget af dehydrering processer 13. Men denne metode involverer anordninger til cryo-ultramicrotomy, samt yderligere enheder på standard EM, således at denne observation ved meget lave temperaturer, som genererer betydelige ekstraomkostninger. Derudover CEMOVIS fremgangsmåde udelukker anvendelse af immunolabeling teknikker, eftersom antistoffer normalt skal inkuberes ved stuetemperatur. Alternativt er det muligt at kombinere ultrastrukturelle analyse med immunhistokemiske procedurer ved anvendelse af en fryse-substitution tilgang, hvor kryo-fikserede prøver er langsomt optøs, medens immerged i kryo-beskyttende kemikalier og er thda indlejret i specialiserede harpiks, såsom Lowicryls. Post-embedding immunmærkning kan derefter udføres på et sådant materiale 12. Dog fryse-substitutions- og cryo-fixation teknikker er tidskrævende. De kræver installering af yderligere udstyr og kræver stadig prøver at blive udsat for organisk opløsningsmiddel og kemisk fiksativ, der kan ændre cytoarchitecture til trods for anvendelsen af en lav temperatur 14, 15. Derfor, på trods af alle de teknologiske fremskridt både på LM og EM niveau, kemisk fiksering af hjernevæv, især med acrolein, forbliver en billig og tidsbesparende metode til at kombinere immunhistokemi med EM 16.

I de sidste årtier, blev mange gjort forsøg på at finde en blanding af aldehyder, der giver den bedste vævskonservering. Før 1960'erne, er den eneste kemiske fiksativ der gav acceptable resultater for EM var osmiumtetroxid. Men osmiumtetroxid er meget giftigt og dyrt, hvilket udelukker dens anvendelse gennem karsystemet til at fastsætte organer, såsom hjernen. Acrolein blev introduceret i slutningen af 1950'erne som en pålidelig metode til dyr vævskonservering egnet til EM observation af cellulære strukturer 17. Den gennemtrænger vævet dybere og reagerer hurtigere end andre aldehyder, når de anvendes til fiksering ved neddypning og giver god bevarelse af cytoplasmatiske komponenter, med minimal krympning af vævet 17. Et sådant træk giver acrolein fiksering en klar fordel frem for andre aldehyder, når de anvendes i frisk væv, ved at tillade en mere nøjagtig lokalisering af levende molekylære forbindelser, såsom enzymer og andre proteiner 18. Faktisk er det blevet valideret gennem årene som en nem, effektiv og billig metode til fiksering til visualisering på EM-niveau i mange arter, herunder padder og gnavere, som den effektivt stabilisatorZES peptider og proteiner, bibeholder antigenicitet og tilvejebringer relativt intakt ultrastruktur når de anvendes i kombination med et andet aldehyd fiksativ 16, 18, 19, 20, 21. Protokoller for acrolein fiksering i gnavere er siden blevet standardiseret og anvendes i udstrakt grad, navnlig ved Pickel gruppe, for at implementere dual immunmærkning for EM 16, 22. Enkelte grupper har brugt acrolein fiksering i ikke-human primat hjernevæv 23. Men så vidt vi ved, er der kun én offentliggjort protokol effektivt beskriver kemisk fiksering med acrolein i ikke-menneskelige primater, der er kompatibel med EM immunolabeling 24.

I denne artikel giver vi en nem og pålidelig metode til effektivt kemisk fix ikke-humen primat hjerner med acrolein, der giver mulighed for en potentielt langsigtet bevaring foruden den indlejring immunmærkning og transmission EM undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Statement: Alle protokoller, der involverer dyr blev godkendt af Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval og blev foretaget i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care Guide til Pleje og anvendelsen af ​​forsøgsdyr (Ed 2.). Den her beskrevne protokol blev optimeret til voksne dyr på ca. 800 g. Mængden af ​​fiksativ bør justeres i henhold til dyrets størrelse.

1. Fremstilling af Løsninger til transkardial Perfusion

  1. Forberede 1 I af en 50 mM natriumphosphat-pufret saltvand (PBS) opløsning ifølge de følgende trin. Opløsningen tilberedes mest 24 timer før perfusion og holde ved 4 ° C indtil anvendelse.
    1. Måle 800 ml destilleret vand i en 1 liters bægerglas. Tilføje 5,87 g dibasisk vandfrit natriumphosphat (Na2HPO 4), 1,20 g monobasisk monohydrat natriumphosphat (NaH 2 PO4 · H2O), og 9 gaf natriumchlorid (NaCl). Omrør for at opløse.
    2. Justere pH til 7,4 ved gradvis tilsætning af 5 N NaOH. Tilsæt destilleret vand op til et samlet volumen på 1 L.
      ADVARSEL: NaOH er et ætsende kemisk forbindelse. Bær egnet personligt beskyttelsesudstyr (PPE;. Laboratoriekittel, handsker, beskyttelsesbriller, osv).
  2. Forberede 2 I 4% paraformaldehyd (PFA) ifølge de følgende trin. Denne opløsning skal fremstilles højst 24 timer før kirurgi og holdt ved 4 ° C indtil anvendelse.
    1. Måle 1,5 l destilleret vand i en 2-liters bægerglas. Tilføje 23.48 g dibasisk vandfrit natriumphosphat (Na2HPO 4) og 4,80 g monobasisk monohydrat natriumphosphat (NaH 2 PO4 · H2O). Omrør for at opløse. Tilsæt destilleret vand op til et samlet volumen på 2 L.
    2. Opvarme opløsningen under en udluftning hætte, indtil temperaturen når ca. 45 - 55 ° C. Må ikke opvarmes til over 60 ° C.
    3. Gradvist tilsættes 80 g PFA til opløsningen, og der omrøres indtil fuldstændig opløsning (ca. 30 - 60 min). Fortsat at overvåge temperaturen for at holde det under 60 ° C.
      ADVARSEL: PFA er meget svingende i sin pulverform. Det er meget giftigt ved kontakt med huden eller øjnene og er farlig i tilfælde af inhalation eller indtagelse. Wear PPE og bruge med forsigtighed under en udluftning hætte.
    4. Afkøl opløsningen ned til 4 ° C og filtreres. Opbevares ved 4 ° C.
  3. Forberede 1 liter 3% acrolein i 0,1 M phosphatbuffer (PB) ifølge de følgende trin. PB opløsning bør fremstilles højst 24 timer før perfusion.
    ADVARSEL: Acrolein er meget giftigt ved indånding og kan producere øjeblikkelig skade. Det er også ætsende og meget giftig ved optagelse gennem huden. Det er kræftfremkaldende og mutagent. Bære den relevante PPE og brug under en udluftning hætte.
    1. Måle 800 ml destilleret vand. Tilføje 8,66 g dibasisk vandfrit natriumphosphat (Na 2 4) og 5,38 g monobasisk monohydrat natriumphosphat (NaH 2 PO4 · H2O). Der omrøres, indtil alle saltene opløses. Tilsæt destilleret vand op til et samlet volumen på 1 L. Opløsningen opbevares ved 4 ° C.
    2. Før indgrebet, overføres 900 ml PB opløsningen til en 1 L glasbeholder og tilføje 30.94 ml 97% acrolein opløsning under et udluftning hætte. Tilføj PB løsning til at nå et samlet volumen på 1 liter og rør. Opløsningen filtreres og opbevares ved 4 ° C.

2. transcardial Perfusion og Brain Dissection

  1. Hold løsninger på is under hele kirurgiske procedure. Forbered pumpen ved at anbringe røret i den første opløsning, der skal anvendes (PBS; 50 mM) og dreje pumpen indtil der ikke luft tilbage i slangen. For transkardial perfusion af en makakabe, anvende et 21 G nål og indstille udstrømningen ved ca. 80 ml / min.
  2. Bedøver dyret med en intramuskulær injektion af en blandingstilling af ketamin (20 mg / kg), xylazin (4 mg / kg), og acepromazin (0,5 mg / kg). Opretholde dyret under isofluran (3%) sedation.
  3. Fastgør dyrets lemmer til en udluftning bord.
  4. Med en skalpel, fjerne huden op til armhulerne. Skær mavemusklerne. Brug tunge kirurgiske saks til at klippe ribbenene sideværts ved omhyggeligt at undgå de vitale organer.
  5. Skær membranen med kirurgisk saks og hæve brystkassen at blotlægge hjertet. Når membranen er skåret, hurtigt videre, da hjertet stopper slå inden for få minutter.
  6. Fjern hjertesækken med en skalpel og stik nålen ind i den venstre ventrikel. Med en skalpel, omhyggeligt lave en lille excision til højre atrium. Hurtigt at starte pumpen ved 72 ml / minut og holde nålen på plads. Hvis det er muligt, vippe dyret for at have sit hoved på et lavere niveau end hjertet.
    BEMÆRK: Pas på ikke at gennembore interventrikulære skillevæg, når du sætter nålen.
    1. Rinse blodet med ca. 300 ml PBS indtil lungerne er hvide og ingen blod kommer ud af det højre atrium.
  7. Stoppe pumpen, hurtigt at overføre slangen / røret til 3% acrolein opløsning, og start pumpen igen. Gradvist øge pumpehastigheden til 80 ml / min, når hjertet er stoppet slå. Perfundere ca. 500 ml af acrolein opløsning.
  8. Stop pumpen, hurtigt at overføre slangen til 4% PFA løsning, og start pumpen igen. Dette trin kræver ca. 1 liter PFA.
    BEMÆRK: fiksering er afsluttet, når forbenene er stive og halsen er stiv.
  9. Skær hovedet og dissekerer forsigtigt hjernen ud af kraniet. Vær omhyggelig med at ikke skade hjernen med de kirurgiske instrumenter. Perfusionen er optimal, når hjernen er svagt (ingen spor af blod) og stive (figur 1A).
  10. Nedsænke den intakte hjerne i 4% PFA i 1 time ved 4 ° C.
  11. Serielt skåret hjernen med en afkøling vibratom (4 ° C)i den ønskede plan i 50 um tykke snit og samle dem i PBS (0,1 M) (figur 1B).
    BEMÆRK: Dette trin kan udføres på mange måder i overensstemmelse med den ønskede protokol. Halvkugler kan adskilles før vibratome skæring, eller holdes hele. Hvis hjernen er for stort til vibratome platform, kan det skæres i mindre blokke. Efter dette trin kan sektioner opbevares i længere tidsrum ved -30 ° C i en frostvæske opløsning fremstillet af 40% PB (50 mM), 30% glycerol og 30% ethylenglycol.

3. Pre-embedding Immunhistokemi (figur 1C)

  1. Forberede en 4 I stamopløsning af Tris-bufret saltvand (TBS, 50 mM, pH 7,6) som følger.
    1. Måle 2L destilleret vand i et 4 I bægerglas, tilsæt 24,23 g trihydroxymethyl- aminomethan (THAM; C 4H 11 NO3) og omrør til opløsning.
    2. PH justeres til 7,6 med ca. 148 ml 1 N HCI. Syren bør tilsættes cautipå at undgå at nå en pH under 7,6. Det samlede volumen bør være 4 L.
      ADVARSEL: HCl er stærkt ætsende. Bær passende personlige værnemidler.
  2. Vælg sektioner (fra trin 2.11) indeholdende regionen af ​​interesse, der skal behandles for EM immunohistokemi.
  3. Vask de fritflydende sektioner 3x i PBS (0,1 M, pH 7,4) i 5 minutter ved stuetemperatur for at skylle frostvæske.
  4. Fremstilling af en 0,5% opløsning af NaBH4 fortyndet i PBS.
    1. Afvej 0,05 g NaBH4 og fortynde det i 10 ml PBS. Dæk ikke til. Forbered denne løsning lige før brug.
  5. Inkubere sektionerne i den nylavede NaBH4 opløsningen i 30 minutter ved stuetemperatur. Vip forsigtigt. Dæk ikke til.
  6. Wash 3x i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur, rokkende kraftigt, indtil ingen af ​​reaktionsgassen tilbage.
  7. Forberede en blokeringsopløsning til EM med 2% passende normalt serum og 0,5% kold fiskegelatine fortyndet i PBS.
    BEMÆRK: Mængden should beregnes for at få nok for de følgende tre trin. Bruge et serum fremstillet fra den samme dyreart hosting det sekundære antistof. Undgå brugen af ​​antigen hentning metoder eller tilsætning af små mængder af Triton (for at øge indtrængning af antistoffer), som disse metoder signifikant kompromittere kvaliteten af ​​vævet.
  8. Inkubere sektionerne i blokeringsopløsningen i 1 time ved stuetemperatur. Vip forsigtigt.
  9. Forberede primær antistofopløsning fortyndet i blokeringsopløsningen.
    BEMÆRK: Koncentrationen af ​​det primære antistof er normalt det samme som for LM immunhistokemi, men overveje at udføre forsøg med forskellige antistofkoncentrationer på forhånd, da nogle primære antistoffer ikke med acrolein kan. Hvis ja, er det muligt at anvende en blanding af glutaraldehyd (0,1 - med 2%) og 4% PFA for transkardial perfusion og opnå lignende resultater. Optimere inkubationstid og temperatur samt.
  10. Inkubere de afsnit på primær antistofopløsningnatten over ved stuetemperatur med forsigtig omrystning. Anvende en tidligere testet inkubationstid og temperatur.
  11. Vask sektionerne 3x i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
  12. Forbered en 1: 1.000 opløsning af biotinyleret sekundært antistof fortyndet i blokeringsopløsningen.
    BEMÆRK: Det sekundære antistof skal dannet mod værtsarten anvendes til at frembringe det primære antistof.
  13. Inkubere sektionerne i sekundær antistofopløsning i 1,5 timer ved stuetemperatur. Vip forsigtigt.
  14. Forberede et avidin-biotin-peroxidase (ABC) opløsning i mindst 60 min før afslutningen af ​​det sekundære antistof inkubation.
    1. Bruge en kalibreret pipette til at måle 8,80 pl / ml opløsninger A og B og fortynde dem i PBS.
    2. Rock mildt i mindst 60 minutter ved stuetemperatur for at tillade fuldstændig binding mellem avidin og biotin-molekyler.
  15. Efter inkubering i sekundært antistof opløsning, vask 3x i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
  16. Inkubere sektionerne i ABC sålution i 1 time ved stuetemperatur. Vip forsigtigt.
  17. Vask en gang i PBS og to gange i TBS i 10 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
  18. Forberede en frisk opløsning af 0,05% 3,3'-diaminobenzidin (DAB) med 0,005% H2O 2 fortyndet i TBS.
    1. Afvej 12,5 mg DAB og fortynde det i 25 ml kold TBS. Beskyttes mod lys.
      ADVARSEL: DAB-pulver er meget svingende og skadelig ved indånding. Det er kræftfremkaldende og teratogent. Således bør gravide eller ammende kvinder ikke manipulere dette produkt, selv når fortyndet. Brug en N95 maske, når manipulere og slid værnemidler.
    2. Opløsningen filtreres og tilsættes 4,5 pi af 30% H2O 2 lige før brug.
  19. Inkuber sektioner i DAB opløsningen i 3 til 7 minutter ved stuetemperatur. Vip forsigtigt.
    BEMÆRK: Den brune bundfald bør ikke være for mørkt for at undgå et højt niveau af baggrundsfarvning. Inkubationstiden bør optimeres i overensstemmelse hermed.
  20. Stoppe reaktionen ved hurtigt to gange vaski koldt TBS, derefter to gange i 10 minutter i kold TBS ved stuetemperatur, efterfulgt af to gange i 10 minutter i PB, med mild rocking.
    BEMÆRK: Brugen af ​​PB (og ikke PBS) er afgørende for at fjerne eventuelle spor af NaCl, da det ville reagere med osmium og form-krystaller.

4. Osmification og Indlejring for elektronmikroskopisk Observation

  1. Fremstille en opløsning af 1% osmiumtetroxid (OsO4) fortyndet i PB. Beskyttes mod lys.
    ADVARSEL: Osmium er meget giftigt og bør ikke komme i kontakt med huden, øjne eller mund og bør ikke indåndes. Det kan medføre døden, hvis de indtages. Det bør kun anvendes under en udluftning hætte og med passende PV.
  2. Inkubere sektionerne i OsO4-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur under udluftning hætte (uden omrøring) og dække dem med aluminiumfolie for at beskytte dem mod lys. Helt flade sektionerne før tilsætning af OsO4 opløsning.
    BEMÆRK: Afsnittene bliver meget mørk og rigid og skal manipuleres med omhu efter dette trin.
  3. Forberede vandafvisende epoxyharpiks under osmification.
    1. Tilføje passende mængder af hver komponent af epoxyharpiksen mix (20 g epoxyharpiks, 20 g hærder, 0,6 g accelerator og 0,4 g blødgøringsmiddel) til et stort plastbæger. Rør med en træpind eller plastpipette indtil en homogen brun farve er opnået.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge den nøjagtige andel af hver komponent.
    2. Overfør lige mængder til aluminium kopper passende størrelser, afhængigt af antallet af sektioner, der skal behandles. Lad det hvile.
  4. Vask de osmificated sektioner 3x ind PB i 10 minutter ved stuetemperatur med lav hastighed rocking.
  5. Dehydrere sektioner i den følgende række graduerede ethanol i 2 minutter hver: 2 gange i 35% ethanol; 1 gang hver i 50, 70, 80, 90, og 95% ethanol; og 3x i 100% ethanol.
  6. Overfør sektionerne til hætteglas at fuldføre dehydratipå processen ved at inkubere sektionerne 3 gange i 2 minutter i propylenoxid.
    ADVARSEL: Propylenoxid er et meget flygtigt og toksisk organisk opløsningsmiddel. Det kan forårsage alvorlige skader på øjne og hud i tilfælde af kontakt eller indånding eller indtagelse. Det er blevet klassificeret som en klasse 2 kræftfremkaldende stof. Det bør kun anvendes under en udluftning hætte og med PV. Det er også meget brandfarligt og bør holdes væk fra enhver varmekilde.
    BEMÆRK: Før dette trin, bør sektioner omhyggeligt overført i hætteglas, idet propylenoxid er et organisk opløsningsmiddel og er uforenelig med plast. På dette tidspunkt, sektioner er meget skrøbelige og skal manipuleres med omhu. Sektioner kan alternativt overføres til hætteglas forud for trin 4.5.
  7. Overfør sektioner omhyggeligt, én efter én, i aluminium kopper og undgå kontakt med luft så meget som muligt. Flad indkapsle de afsnit på tidligere blandet vandafvisende epoxyharpiks og inkuber dem natten over under Venting hætte ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: I dette trin sektionerne er helt dehydreret og meget skrøbelige og skal manipuleres med omhu.
  8. Anvendelse mineralolie, forberede fedt-coatede objektglas sammen med smurte plastdækglas.
  9. Blødgøre harpiksen ved inkubation aluminiumkopper ved 60 ° C i 12-15 minutter ved de fleste. flade forsigtigt afsnittene på smurt side af objektglasset. Placer smurt dækglas og skub forsigtigt eventuelt resterende luft.
  10. Glassene inkuberes ved 60 ° C i 48 timer.
    NB: Det er kritisk for ikke overstige 48 h inkubationstid, som harpiksen bliver for hårdt.
  11. Fjern plastik dækglas.

5. Prøvefremstilling til Ultratynde Sektionsinddeling og Observation Ved hjælp af en transmissionselektronmikroskop

  1. Brug kikkert for at finde det område af interesse og skære en lille firkantet stykke på ca. 1 mm 2 med en skalpel.
  2. File spidsen af ​​en harpiks blok og lim quadrangular stykke på det (figur 1C). Lad limen tørre i mindst 1 time eller natten over før sektionering.
  3. Ved anvendelse af en ultramikrotom, sender det firkantede stykke til 80 um tykke snit (figur 1D).
    1. Placer harpiks blokeret en ultramikrotom dæk i lodret stilling og ved hjælp af en skarp barberblad, gradvist skære hver side af harpiksen blok til dannelse af et trapez med glatte sider.
    2. Sæt dæk i sin horisontale position og drej blok, indtil den længste side af trapez vender nedad.
    3. Bruge en diamant trimning værktøj eller et glas kniv til at trimme overfladen af ​​det firkantede stykke. Indstil ultramikrotom at skære 300 um tykke snit på 1 mm / s. Juster kniv til at være vertikalt parallelt med det firkantede stykke og til at vise en meget lille vandret vinkel på ca. 1 °.
      BEMÆRK: Denne vinkel vil tillade brugeren at nærme vævet næsten parallelt med overfladen af ​​blås, hvor immunmærket elementer er mere sandsynligt at finde. Ved brug af disse parametre med diamant trimning værktøj, harpiksen viser en skinnende hvid farve. Når vævet skæres, ændres den til en lilla eller grønlig farve.
    4. Anvende en ultra 45 ° diamantkniv udstyret med en båd fyldt med destilleret vand til at skære 80 um tykke snit, udglatning af sektioner ved at passere over dem med et stykke absorberende papir tippet i xylen, og indsamle serielle snit på Formvar-coatede nikkel slot gitre eller nøgne 150 mesh kobbergitre (figur 1E).
  4. Placer gitre i et gitter opbevaringskasse.
  5. Plette net med blycitrat.
    1. Brug en 5 ml sprøjte og en 0,2 um sprøjtefilter til fremstilling af en 1: 1 opløsning af filtreret blycitrat stamopløsning og filtreret destilleret vand. Beskyt mod lys.
      BEMÆRK: stamopløsning af bly citrat bør gøres frisk hver måned for at undgå dannelsen af ​​faste pengsin. Se det materiale datablad for bestanden opskrift. Desuden, hvis mange serier af tavler skal farves, ændre den fortyndede opløsning når den bliver mælkeagtig.
    2. Placer hver tavle på en dråbe af den fortyndede opløsning, med det afsnit i kontakt med opløsningen. Der inkuberes i 3 min.
    3. Bruge små pincet til at holde gitteret, og skyl det i to bægre indeholdende destilleret vand.
    4. Fjern overskydende vand ved forsigtigt med absorberende papir. Opbevar gitre i en gitter kasse. Vente 30 minutter, før den behandlede sektioner ved transmissionselektronmikroskopi (TEM, figur 1F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette afsnit præsenterer vi repræsentative resultater, der blev opnået efter den observation, ved transmission EM plan af immunfarvet primat hjernevæv kemisk fikseret med en blanding af 3% acrolein og 4% PFA. Vi opnåede god bevarelse af ultrastruktur, som angivet ved den relativt intakt myelinskeden og den pæne visualisering af dobbelte membraner (figur 2A). Synaptiske kontakter, sammen med neuronale elementer fra mikromiljøet, let kan identificeres (figur 2B). Neuronale elementer mærket med diaminobenzidin (DAB) immunopræcipitat indregnes ved EM niveau ved deres fyldte cytoplasma eller axoplasm. Plasmamembranen og den ydre overflade af organeller også typisk foret med elektron-tætte bundfald (figur 3).

I dette særlige eksperiment anvendte vi antistoffer against serotonin transporter (SERT), cholinacetyltransferase (ChAT), eller tyrosinhydroxylase (TH) for at visualisere immunmærket neuronale elementer i eksterne (GPe) eller intern (GPI) segment af dødningehovedabe globus pallidus (figur 3). For at gøre det, brugte vi en kombination af fastgørelse kemikalier, der bevarer antigenicitet samt ultrastruktur, så en detaljeret morfologisk undersøgelse. Selv om mange antistoffer kan anvendes med den ovenfor beskrevne transcardial perfusionsprotokollen anbefaler vi, at brugerne udfører optimering koncentration tests på forhånd, da nogle primære antistoffer er kendt for ikke giver optimal immunmærkning med acrolein fiksering. Alternativt, når antistoffer ikke giver optimal immunmærkning med acrolein fiksering, en fortynding på 0,1 - med 2% glutaraldehyd i 4% PFA kan anvendes til transkardial perfusion. Det giver væv kvalitet forholdsvis svarer til acrolein-fikseret hjernevæv med bevaret antigenicitet for mangeantistoffer (figur 4).

Endelig giver vi typiske eksempler på EM fotomikrografier opnået efter uhensigtsmæssige manipulationer. En dårlig fikseringen resulterer i ændrede myelinskeder (figur 5A, B) og vanskeligheder med visualisering af de dobbelte membraner af neuritter (fig 5C, D), hvilket forhindrer en pålidelig identifikation og analyse af mærkede og umærkede neuronale elementer. En overdreven inkubationstid i DAB opløsning skaber overdreven baggrund og ikke-specifik farvning, der potentielt kan generere falske positive resultater. Baggrund eller uspecifik farvning tider synes som ufuldstændig farvning af neuronale elementer (figur 6A, B), men oftere så talrige og tæt placeret farvede neuronale elementer (figur 6C, D). Anvendelsen af ​​detergent i blokeringsopløsningen væsentlig grad ændrer kvaliteten af ​​vævet. Det kan føre til manglendeorganeller i mærkede elementer (Figur 7A) eller nedbrydning af myelinskederne (figur 7B) og cellulære membraner (figur 7C), hvilket gør enhver akut fortolkning af mikromiljøet vanskelig. Endelig en fejltrin i osmification proces, såsom anvendelse skylleopløsning indeholdende natriumchlorid, producerer upålidelige resultater, hvor de cellulære strukturer er svære at skelne (figur 7D).

figur 1
Figur 1: Skema af væsentlige skridt i protokollen. Aben hjerne (A) skåret i serielle sektioner med en kølende vibratom (B). Det bearbejdes derefter for pre-embedding immunohistokemi og elektronmikroskopi, hvorefter området af interesse er placeret på spidsen af en harpiks blok (C) og skåret i 80 nm tyk sections med en ultramikrotom (D). Ultratynde snit opsamles derefter på bare 150 mesh kobber gitre eller Formvar-coatede nikkelgitre (E), farvet med blycitrat og klar til at blive observeret under transmissionselektronmikroskop (F). Målestok: 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Velbevaret Primate Brain Tissue efter Acrolein-PFA transcardial Perfusion. Elektronmikrografier af egern abe (Saimiri sciureus) hjernevæv af GPi (A) og GPe (B) viser repræsentative velbevaret materiale efter udførelse af acrolein-PFA transcardial perfusion og immunoperoxidase-diaminobenzidin teknik. mYelin kappe af axoner (a) er relativt intakt (se pilespids i A), og den generelle ultrastruktur er velbevaret i A og B. Dendritiske profiler (d), (a), og Axon varicosities (AV) kan små myelinerede axoner nemt identificeres. Et eksempel på en axon åreknudesyndromet om en symmetrisk synaptisk kontakt (mellem pile) med en dendritisk profil (d) er vist i B. Skalasøjle: 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: Snit fra egern Monkey GPe og GPi immunomærket for cholinacetyltransferase (ChAT), Serotonin Transporter (SERT), og tyrosinhydroxylase (TH) ved at bruge Immunoperoxidase-diaminobenzidin Teknik. Immunomærkede elementer kan let identificeres ved deres cytoplasma eller axoplasm fyldt med elektron-tætte DAB præcipitat. Mærkede dendritiske profiler genkendes af udfyldte mikrofilamenter, som det ses i A, hvor en ChAT-immunfarvet dendritceller i GPi modtager et synaptisk kontakt (mellem pile) fra en umærket Axon varikositet (av). Den elektronmikrografi i B viser en myelinerede Axon i GPe med en relativt intakt myelin sheath hvis axoplasm er immunomærket for TH. Eksemplet i C viser en axon varikositet i GPi immunomærket for SERT og ses at etablere en symmetrisk synaptisk kontakt (mellem pile) med en dendrit (d). I dette eksempel DAB udfælde linjer plasmamembranen og den ydre overflade af organeller (mitochondriet og synaptiske vesikler). Axon varikositet vist i D blev observeret i GPe og immunmærket for TH og repræsenterer et eksempel på DAB bundfald helt fylder axoplasm, med synaptiske vesikler er synlig, men vanskeligere at afgrænse. Elementer af mikromiljøet kan let identificeres som eksemplificeret ved myelinerede og myelinerede axoner (a) og lejlighedsvis dendritter (d) omgiver det mærkede axon åreknudesyndromet. Elektronmikrografer er ændret fra 25, 26, 27. Skalasøjle: 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: Eksempler på Primate hjernevæv efter Glutaraldehyd-PFA transcardial perfusion. Repræsentative elektronmikrofotografier af makakabe (Macaca fascicularis) hjernevæv af GPe (A) og GPi (BD) efter performing transkardial perfusion med 0,2% glutaraldehyd blandet med 4% PFA og immunoperoxidase-diaminobenzidin teknik med et antistof mod serotonin transporter (SERT). Som i figur 2, immunmærket elementer kan identificeres ved deres cytoplasma og axoplasm fyldt med elektron-tætte DAB præcipitat. Generel ultrastruktur er relativt intakt og kan let identificeres elementer af mikromiljøet, som vist ved myelinerede og myelinerede axoner (a) og lejlighedsvis dendritter (d) og Axon varicosities (AV) omgiver de mærkede axon varicosities, som beskrevet i figur 2. Men bemærk uoverensstemmelse i kvaliteten af ​​ultrastruktur, betegnet med veldefinerede plasmamembraner (pilespidser), men relativt beskadiget myelinskeden (pil). Skalasøjle: 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 5: Eksempler på Primate Brain Tissue Opnået efter forgæves transcardial perfusion. Resultater fra et mislykket kemisk fiksering er vist her i dødningehovedabe GPi (A - B) og GPe (C - D) transcardialt perfunderet med 0,9% NaCl skylleopløsning og en blanding af iskold 4% PFA og 15% pikrinsyre fortyndet i 0,1 M PB (pH 7,4). Hjernerne blev postfikseret 1 time ved 4 ° C i 4% PFA og 30% saccharose og skæres i 60 um tykke sagittale snit med en køling vibratom. Uhensigtsmæssigt fast hjernevæv kan genkendes af en beskadiget myelinskeden (A og B, pilehoveder), såvel som ved slørede eller udefinerede plasmamembraner (C og D, se pilespidser for eksempler). Forskellige neuronale elementer difskelige at identificere, hvilket gør enhver fortolkning af ultrastruktur upålidelige. Skalasøjle: 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 6
Figur 6: Eksempler på Uspecifik ChAT immunmærkning i egern Monkey GPe. Baggrundsfarvning eller uspecifikt immunmærkning vises undertiden under EM som delvis farvning af store cellulære elementer, som vist i A - B (pilespidser). En sådan uspecifik farvning forekommer oftere på overfladen af ​​immunofarvede sektioner. Andre eksempler på ikke-specifik immunmærkning omfatter den hyppige observation af meget små elementer fremkalde små, ikke-myelinerede axoner delvist eller fuldstændigt fyldt med DAB og ligger meget tæt på den ene ennother, som demonstreret ved pilespidser i C og D. Skalasøjle: 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 7
Figur 7: Beskadigede egern Monkey GPe Tissue efter fejltrin i Prøvefremstilling for Electron Microscopy. Anvendelsen af detergent, såsom Triton X-100, i blokeringsopløsningen, selv ved en lav koncentration på 0,02%, ændrer det væsentlige integriteten af ultrastrukturen ved at beskadige cytoplasma dendritter (A) eller myelinskeden af axoner (B ). De forskellige neuronale elementer er også vanskelige at skelne fra hinanden (C), da plasmamembraner beskadiges og vanskelige at afgrænse. Den osmification processen er also et vigtigt skridt i forberedelsen. Anvendelsen af natriumchlorid i skylleopløsninger (D) ændrer fiksering af vævet, hvilket gør efterfølgende analyse vanskelig. Skalalinjen: 800 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel præsenterer vi en pålidelig protokol for transkardial perfusion af ikke-menneskelige primater og præ-embedding immunhistokemi egnet til EM prøve eksamen. Skønt typiske cryo-EM, såsom CEMOVIS, giver en god konservering af hjernens ultrastruktur, det begrænser også anvendelsen af immunhistokemi 12. Andre teknikker, herunder cryo-substitution og Tokuyaso teknik, tillader post-embedding immunhistokemi, men disse teknikker er dyre på grund af yderligere anordninger er nødvendige under processen og kan være tidskrævende og dygtighed udfordrende 12, 14, 15. Desuden for effektivt bruge kryo-fiksering metode, prøven skal være relativt lille (op til 200 um i tykkelse ved brug højtryks-frysning 28 og 10 um ved atmosfærisk tryk 29). Ideelt, at få godresultater med kryo-fiksering af primat hjernevæv, prøven skal tages fra en biopsi, der forårsager problemer med at finde den nøjagtige placering af området af interesse. Dette problem skal omgås ved hjælp af stereotaksiske koordinater. Den kemiske fiksering med acrolein og pre-embedding teknik foreslået ovenfor giver en let, billig, tidsbesparende og pålidelig fremgangsmåde til prøveforberedelse af primat hjernevæv og immunolabeling til EM. Ved at følge disse trin, vil man opnå et velbevaret ultrastruktur sammen med antigenicitet at tillade immunmærkning af de fleste proteiner. Imidlertid er kemisk fiksering i EM har også sine ulemper. Først, mens fastgørelse opløsninger, såsom acrolein bevare de morfologiske detaljer i hjernevævet, er det muligt, at nogle morfologiske ændringer forekomme i kemisk fiksering processen og ændre resultaterne i forhold til dem, der ville blive opnået med CEMOVIS eller kryo-substitutionsteknikker. Sekund, fikseringsprocessen ogefterfølgende dehydrering nødvendige for harpiks indlejring fjerne de fleste af de ekstracellulære væsker og klem cellulære komponenter sammen, hvilket forårsager krympning af væv, der i væsentlig grad ændrer deres størrelse og form i forhold til kryo-fikserede celler 21, 30. Ikke desto mindre har aldehydfiksering blevet brugt med succes i mange laboratorier rundt om i verden og er bredt accepteret i litteraturen som en pålidelig metode til at studere de ultrastrukturelle træk af neuroner og gliaceller, trods tidligere nævnt bekymringer 21, 30, 31, 32.

Ved sammenligning med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, den postembedding immunohistokemi der er nødvendig for kryo-fikserede prøver indlejret i methacrylat harpiks, er mindre følsom og påvisning af centralnervesystemet antigener er begrænset 14 >, 33. Men aldehydfiksering har også sine begrænsninger i forhold til antigenicitet. Derfor er det vigtigt at teste specificiteten af ​​antistofferne for en given kemisk fiksering protokol på LM niveau før start EM præparat. Kvaliteten af ​​immunhistokemi på acrolein-fikseret hjernevæv afhænger også af tidligere bryde de stærke aldehyd bindinger skabt af kemisk fiksering. Dette trin kan opnås ved at inkubere sektionerne før immunhistokemi med natriumborhydrid (se trin 3.3 - 3.5). Udelade dette trin vil helt sikkert føre til suboptimal immunfarvning 34. Hvis antistoffer, der skal anvendes, ikke giver optimal farvning på hjernesnit fikseret med acrolein, er det muligt at alternativt anvende glutaraldehyd (0,1 - med 2%) fortyndet i 4% PFA. Dette har vist sig at godt bevare hjerne ultrastruktur mens tilstrækkeligt bevare antigeniciteten for mange antistoffer og tilvejebringe hjernevævegnet til langtidsopbevaring med minimal ændringer 20, 21, 35, 36, 37. Det er også muligt at opnå relativt god fiksering og antigenicitet egnet til EM med PFA alene ved signifikant at hæve opløsningens pH, men en kombination af mere end ét fiksativ under perfusion har givet bedre resultater 34, og undersøgelser understøtter, at PFA fiksering alene generelt producere dårligt bevaret væv til EM undersøgelse 38, 39. Men i nogle sjældne tilfælde, antigenicitet er meget svært at opretholde, og PFA fiksering alene er den eneste holdbare løsning for EM undersøgelse.

Mange skridt i denne protokol bør følges nøje med henblik på at opnå de optimale resultater. For eksempel fremstillingen af ​​4% PFA opløsningskal udføres ved temperaturer over 45 ° C for at tillade PFA pulver til opløsning, men det er vigtigt, at temperaturen forbliver under 60 ° C. Ellers PFA opløsning depolymeriserer til formaldehyd og myresyre, som fikserer vævet forskelligt og danner en sur opløsning, der i væsentlig grad kan ændre væv kvalitet 40, 41. Derudover er det kritisk, at perfusions arbejdstrin udføres hurtigt, når membranen er blevet skåret, idet hypoxi og hyperkapni vil frembringe irreversible fysiologiske ændringer i hjernen, der kunne ændre kvaliteten og integriteten af vævet 31. Defekt fiksering kunne være skadelig for bevarelsen af ​​hjernevæv og permanent ændre ultrastrukturen af ​​vævet, såsom plasmamembraner, mitokondrier og synapser. Således opløsning forberedelse og perfusion skridt skal udføres med omhu. Vellykket EM prøve FORBEREDELSEn også stærkt afhænger af en god post-fiksering i osmiumtetroxid. Faktisk har direkte perfusion med osmiumtetroxid blevet beskrevet som producerer rimeligt intakt væv til EM observation 21, 39. Men mange forskelle med hensyn til størrelsen af ​​det ekstracellulære rum og fremkomsten af ​​plasmamembranen mellem osmium-perfunderes og aldehyd-perfunderede dyr er blevet bemærket,. Endvidere sværtningen og hærdning af væv efter osmium perfusion gjort fjernelse af hjernen fra kraniet, den efterfølgende dissektion, og differentieringen mellem hvide og grå stof vanskeligere at begunstige aldehyd perfusion for bedre vævskonservering og lettere manipulation 21. Aldehyd fiksering alene synes at reducere det ekstracellulære rum, som ændrer integriteten af ​​vævet og giver indtryk af tætte forbindelser hvor ekstracellulære rum skal ses, og dermed undlade at viseacceptable elektronmikrografier selv efter blycitrat farvning 42. Imidlertid postfiksering i osmiumtetroxid vendt denne situation ved at tillade en mest konkret adskillelse mellem vævselementer, som er nødvendige for identifikationen 42, således klart begrunder betydningen af at gennemføre de osmification trin (trin 4.1 - 4.2) med forsigtighed.

Betingelserne og koncentrationerne hvorunder der udføres disse trin er blevet testet i vores laboratorium, specielt til præ-embedding immunhistokemi under anvendelse DAB som bundfaldet på primat hjernesnit. Selvom dygtighed udfordrende, dobbelt-immunhistokemi er muligt gennem post-embedding immunhistokemi med guldpartikler 43. Den elektron-tætte DAB bundfald opnået efter immunoperoxidaseteknik-diaminobenzidin teknik foreslås her, er meget let at identificere på EM-niveau, da det skitserer plasma membraner og udare overflader af organeller samtidig tillader identifikation af sub-cellulær komponenter, såsom mitokondrier og synaptiske kontakter. Derudover, når denne teknik beherskes for enkelt immunhistokemi, er det muligt at udføre dobbelt immunhistokemi ved at kombinere DAB udfælde til guldpartikler, som lettere skelnes fra hinanden end guldpartikler af forskellige størrelser. Vi vil anbefale gør grundig afprøvning af antistofspecificitet, osmium koncentrationer og inkubationstid og temperatur før behandling hjernesnit til EM. Protokoller for præ-embedding og dobbelt immunhistokemi for EM er tidligere blevet publiceret og kan tilpasses til primat hjernevæv 16.

Som konklusion transcardial perfusion protokol for primater præsenteret ovenfor muliggør langtidsopbevaring af hjernesnit, der efterfølgende kan anvendes til EM pre-embedding immunohistokemi. AFSns opnået er også egnede til neuroanatomiske studier på LM niveau. Dermed ved anvendelse af en protokol, der er velegnet til både EM og LM, er det muligt at reducere antallet af dyr, der anvendes, en omkostningseffektiv og etiske overvejelser. Det giver også en direkte sammenligning mellem resultaterne opnået ved LM og EM-niveauer på det samme dyr og tillader anvendelse af Sammenlignende lys- og elektronmikroskopiske (CLEM) undersøgelser. Clem undersøgelser har hovedsagelig fokuseret på anvendelsen af genetisk manipulerede mus, der udtrykker fluorescerende proteiner, såsom EGFP, som senere vil kunne mærkes med elektron-tætte bundfald og observeret ved EM niveau 44. Alternativt at omgå problemet med immunhistokemi, cryo-fiksering kan kombineres med en intraneuronal injektion af elektron-tætte markører, såsom quantum dots 45, inden frysning, hvilket muliggør visualisering ved EM niveau 46. Men kvantepunkter er ikke biokompatible, ogderes anvendelse er dyrt og tidskrævende på grund af den ekstra fryseapparatet nødvendig til efterfølgende fremstilling væv. Selv om disse teknikker stadig begunstige cryo-fiksering og fryse-substitutionsmetoder, er der nogle udviklinger for anvendelsen af kemiske tags på semi-tynd (300 nm) sektioner til at mærke forskellige cellulære proteiner med syntetiske fluoroforer, som kan korreleres med EM analyse 47 . Teknikker tillader for eksempel korrelationen mellem en specifik axon lokalisering anvendelse af fluorescens og dets synaptiske forbindelser med neuroner i et givet mål struktur ved at bruge EM, er ganske lovende for forståelsen af ​​organisationen af ​​nervesystemet, specielt i primater. I dette tilfælde bør acrolein fiksering foretrække fremfor glutaraldehyd, som sidstnævnte vil frembringe autofluorescens, der kunne ændre den korrekte visualisering af hjernens strukturer på LM niveau. Imidlertid har meget få undersøgelser af denne type er blevet gennemført i primater, mostly grund af tekniske udfordringer og de høje omkostninger, at sådanne eksperimenter pålægge. Således er der behov nye udviklinger for vellykkede og billig Clem studier i primater, såsom forbedring fikseringsmetoder eller anvendelse af kemiske tags synlige på både LM og EM-niveauer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC, 401.848-2011 til MP). MP modtog en karriere pris fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE var modtager af en ph.d. fællesskab fra FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Vi takker Marie-Josée Wallman til teknisk bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
NaOH EMD SX0590-1 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) Sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18 G 11/2
Needle terumo  NN-2713R 21 G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma S-9125
Normal horse serum (NHS) Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1,000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3,3'-diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0.005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152
4% 19150
 Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin Sigma A: M epoxy resin (44611)
B: hardener 964 (44612)
C: accelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plasticizer (44614) 		 Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate Sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter Corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Tags

Neuroscience transmissionselektronmikroskopi abe neuroanatomi immunhistokemi antistoffer acrolein transcardial perfusion indlejring ultramikrotom
Udarbejdelse af ikke-menneskelig primat Brain Tissue til Pre-indlejring Immunohistokemi og Electron Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Parent, M. Preparation of… More

Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter