Summary
Hier geven we een eenvoudige, goedkope en tijdbesparende protocol chemisch fixeren primaten hersenweefsel met acroleïne fixatief, waardoor langdurig bewaren die compatibel zijn met pre-inbedding immunohistochemie voor transmissie elektronenmicroscopie is.
Abstract
Ondanks alle technologische vooruitgang in het licht microscopie niveau, elektronenmicroscopie blijft het enige instrument in de neurowetenschappen te onderzoeken en te karakteriseren ultrastructurele en morfologische gegevens van neuronen, zoals synaptische contacten. Goede conservering van hersenweefsel voor elektronenmicroscopie kan worden verkregen door rigoureuze cryo-fixatie methoden, maar deze technieken zijn vrij duur en beperken het gebruik van immunokleuring, wat cruciaal is voor de verbinding van geïdentificeerde neuronale systemen begrijpen. Vries-substitutie werkwijzen ontwikkeld om de combinatie van cryo-fixatie met immunokleuring mogelijk. Echter, de reproduceerbaarheid van deze methodologische benaderingen meestal gebaseerd op dure bevriezing apparaten. Bovendien, het bereiken van betrouwbare resultaten met deze techniek is zeer tijdrovend en skill-uitdagend. Vandaar dat de traditionele chemisch vaste hersenen, met name acroleïne fixatief, blijft een tijd-efficiënte en goedkope methode om elektronen combinerenmicroscopie met immunohistochemie. Hier verschaffen wij een betrouwbare experimentele protocol gebruik van chemische fixatie acroleïne die leidt tot het behoud van primaten hersenweefsel en is compatibel met pre-inbedding immunohistochemie en transmissie elektronen microscopisch onderzoek.
Introduction
Licht microscopie, inclusief confocale en twee-foton microscopie, heeft zich bewezen als een efficiënt instrument voor het bestuderen van in vivo neuronale processen, onder andere 1, 2 zijn. Hoewel de typische ruimtelijke resolutie in het lichtmicroscopische (LM) niveau ongeveer 200 nm, recente technologische ontwikkelingen met verschillende lichtbronnen, zoals extreme ultraviolet en zachte röntgenstraling microscopie, zijn aanzienlijk gestegen het verkrijgen van een nagenoeg 10 nm ruimtelijke resolutie 3 , 4, 5. Andere technologische vooruitgang in de beeldvorming omvatten gecombineerde magnetische resonantie met histologie en een nieuwe werkwijze voor het meten van de dikte van de myelineschede in vivo, een parameter die traditioneel meetbare pas ter Elektronenmicroscopie (EM) niveau 6, 7. although deze voorschotten op de LM niveau bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van het leven processen, een gedetailleerde weergave en karakterisering van structuren, zoals synaptische contacten, kan alleen worden bereikt met EM, dat een resolutie die 0,5 nm kan bereiken biedt. Echter, observatie op de EM niveau vraagt de monsters doden en veranderd te zijn in sommige opzichten, met chemische fixatieven en uitdroging processen, met het oog op de cytoarchitecture behouden. Aldus onderzoeken biologische monsters met hoge resolutie kan een uitdaging zijn door schade straling van de elektronenstraal laag contrast, structurele afwijkingen van membranen, of zelfs de aanwezigheid van artefacten die na dehydratatie en inbedden epoxy 8, 9, 10 kan optreden.
Behoud specimens in hun natieve vorm structurele analyse kan worden bereikt door "Cryo EM verglaasd afdelingen" of CEMOVIS, een snijden benaderinggaat snel invriezen en verankeren het monster in glasachtige ijs en onderzoeken van de gedeelten onder de EM bij een cryogene temperatuur 11, 12. Deze procedure maakt het mogelijk voor het onderzoek van monsters, terwijl ze nog steeds solide en volledig gehydrateerd, zodat het niet langer artefacten veroorzaakt door uitdroging verwerkt 13. Deze werkwijze brengt extra inrichtingen voor cryo-ultramicrotomie, evenals extra apparatuur op de standaard EM, teneinde deze waarneming bij zeer lage temperaturen, hetgeen aanzienlijke meerkosten genereren mogelijk. Bovendien, de CEMOVIS benadering sluit het gebruik van immunokleuring technieken, omdat antilichamen gewoonlijk worden geïncubeerd bij KT. Als alternatief is het mogelijk ultrastructurele analyse immunohistochemische procedures te combineren door een vries-substitutiebenadering, waarbij cryo-vaste preparaten langzaam ontdooid terwijl ondergedompeld in cryo-beschermende chemicaliën en zijn Then ingebed in gespecialiseerde harsen, zoals Lowicryls. Post-inbedding immuunlabeling kan vervolgens worden uitgevoerd op dergelijk materiaal 12. Echter, vries-substitutie en cryo-fixatie technieken zijn tijdrovend. Ze vereisen de installatie van extra apparatuur en moeten nog monsters worden blootgesteld aan organische oplosmiddelen en chemische fixatief dat cytoarchitecture kan veranderen, ondanks het gebruik van een lage temperatuur 14, 15. Vandaar dat ondanks alle technologische vooruitgang zowel op LM en EM niveau chemische fixatie van hersenweefsel, met name acroleïne, blijft een goedkope en tijdbesparende werkwijze voor immunohistochemie combineren met EM 16.
In de afgelopen decennia zijn veel pogingen gedaan om een mengsel van aldehyden die de beste weefsel behoud te bieden te vinden. Voor de jaren 1960, de enige chemische fixeermiddel dat aanvaardbare resultaten voor EM gaf was osmiumtetroxide. Echter, osmiumtetroxide is zeer giftig en duur, zich verzet tegen het gebruik door het vaatstelsel naar organen zoals de hersenen vast. Acroleïne werd geïntroduceerd in de late jaren 1950 als betrouwbare methode voor dierlijk weefsel behoud geschikt voor EM waarneming van cellulaire structuren 17. Penetreert het weefsel dieper en sneller reageert dan andere aldehyden gebruikt worden voor fixatie door onderdompeling en zorgt voor een goede conservering van cytoplasmatische componenten met minimale krimp van het weefsel 17. Een dergelijk kenmerk geeft acroleïne fixatie een duidelijk voordeel boven andere aldehyden bij gebruik in vers weefsel, doordat een nauwkeurigere lokalisatie van levende moleculaire verbindingen, zoals enzymen en andere eiwitten 18. Inderdaad, het is gevalideerd door de jaren als een eenvoudige, efficiënte en goedkope werkwijze voor fixatie voor visualisatie op EM niveau in vele soorten, waaronder amfibieën en knaagdieren, zoals het efficiënt StabiliZes peptiden en eiwitten, antigeniciteit behouden en verschaft relatief intact ultrastructuur bij gebruik in combinatie met een ander aldehyde fixeermiddel 16, 18, 19, 20, 21. Protocollen voor acroleïne fixatie in knaagdieren zijn sindsdien gestandaardiseerd en veel gebruikt, met name door Pickel groep dual immunokleuring inrichting voor EM 16, 22. Enkele groepen acroleïne fixatie gebruikt in hersenen van primaten niet-humaan weefsel 23. Echter, voor zover wij weten, is er slechts één gepubliceerde protocol efficiënter beschrijven chemische fixatie met acroleïne bij niet-menselijke primaten die compatibel is met EM immunokleuring 24 is.
In dit artikel geven we een gemakkelijke en betrouwbare methode om efficiënt chemisch fixeren non-humeen primaat hersenen met acroleïne, waardoor een potentieel langdurige conservering met pre-inbedding immunokleuring en transmissie EM onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle protocollen waarbij dieren werden door het Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval goedgekeurd en werden gemaakt in overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care's Guide to de zorg en het gebruik van proefdieren (Ed. 2). De hier beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor volwassen dieren van ongeveer 800 g. De volumina fixeermiddel moet worden aangepast aan de grootte van het dier.
1. Bereiding van oplossingen voor transcardiale perfusie
- Bereid 1 liter 50 mM natriumfosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met de volgende stappen. Bereid de oplossing ten hoogste 24 uur voor perfusie en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
- Meet 800 ml gedestilleerd water in een bekerglas van 1 liter. Voeg 5,87 g watervrij dibasisch natriumfosfaat (Na2 HPO 4), 1,20 g monobasisch monohydraat natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 · H2O) en 9 gnatriumchloride (NaCl). Roer om op te lossen.
- Breng de pH op 7,4 door geleidelijke toevoeging van 5 N NaOH. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 1 L. bereiken
WAARSCHUWING: NaOH is een corrosieve chemische verbinding. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's;. Labjas, handschoenen, veiligheidsbril, etc).
- Bereid 2 l 4% paraformaldehyde (PFA) volgens de volgende stappen. Deze oplossing moet worden bereid maximaal 24 uur voor de operatie en bewaard bij 4 ° C tot gebruik.
- Meet 1,5 liter gedestilleerd water in een 2 liter bekerglas. Voeg 23,48 g watervrij dibasisch natriumfosfaat (Na2 HPO 4) en 4,80 g monobasisch monohydraat natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 · H2O). Roer om op te lossen. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 2 L. bereiken
- Verwarm de oplossing onder een ontluchting kap totdat de temperatuur ongeveer 45 bereikt - 55 ° C. Niet verwarmen tot meer dan 60 ° C.
- Voeg geleidelijk 80 g PFA aan de oplossing en geroerd tot volledig opgelost (ongeveer 30-60 min). Houd bewaken van de temperatuur om het onder 60 ° C te houden.
LET OP: PFA is zeer volatiel in zijn poedervorm. Het is zeer giftig bij contact met de ogen en huid en is gevaarlijk in geval van inademen of inslikken. Slijtage PPE en voorzichtig gebruiken onder een ontluchting kap. - Koel de oplossing af tot 4 ° C en filtreer. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid 1 liter 3% acroleïne in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) volgens de volgende stappen. De PB oplossing moet worden bereid maximaal 24 uur voor perfusie.
LET OP: Acroleine is zeer giftig bij inademing en kan direct schade veroorzaken. Het is ook corrosief en zeer giftig bij opname door de huid. Het is kankerverwekkend en mutageen. Draag geschikte PBM en gebruik ontluchting onder een kap.- Meet 800 ml gedestilleerd water. Voeg 8,66 g watervrij dibasisch natriumfosfaat (Na2 4) en 5,38 g monobasisch monohydraat natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 · H2O). Roer tot alle zouten op te lossen. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 1 L. bereiken Bewaar de oplossing bij 4 ° C.
- Voor de operatie, overdracht 900 ml van de oplossing PB een 1 liter glazen kolf en voeg 30,94 ml 97% acroleïne-oplossing onder een ontluchting kap. Voeg PB oplossing tot een totaal volume van 1 liter en roer te bereiken. Filtreer de oplossing en houdt deze bij 4 ° C.
2. transcardiale perfusie en Brain Dissection
- Houd oplossingen op ijs gedurende de gehele chirurgische procedure. Bereid de pomp door het plaatsen van de buis in de eerste oplossing te gebruiken (PBS, 50 mM) en draaien van de pomp totdat er geen lucht in de slang. Voor het transcardiale perfusie van een makaak, gebruikt een 21 G naald en stel de uitstroom bij ongeveer 80 ml / min.
- Verdoven van het dier met een intramusculaire injectie van een mengseltuur van ketamine (20 mg / kg), xylazine (4 mg / kg) en acepromazine (0,5 mg / kg). Handhaaf het dier onder isofluraan (3%) sedatie.
- Bevestig poten van het dier naar een ontluchting tafel.
- Met een scalpel, verwijder de huid tot aan de oksels. Snijd de buikspieren. Gebruik zware chirurgische schaar aan de ribben lateraal gesneden door zorgvuldig het vermijden van de vitale organen.
- Snijd de membraan met chirurgische schaar en verhogen de ribbenkast naar het hart bloot te leggen. Zodra het membraan wordt gesneden, ga dan snel, omdat het hart stopt met kloppen binnen enkele minuten.
- Verwijder het pericardium met een scalpel en de naald in het linker ventrikel. Met een scalpel voorzichtig een kleine uitsnijding naar rechts atrium. Snel start de pomp bij 72 mL / min en houdt de naald op zijn plaats. Indien mogelijk, kantelt het dier teneinde de kop hebben op een lager niveau dan het hart.
LET OP: Wees voorzichtig de interventriculaire septum niet te doorboren bij het inbrengen van de naald.- rinse het bloed met ongeveer 300 ml PBS totdat de longen wit en geen bloed komt uit het rechter atrium.
- Stop de pomp snel overdracht van de slang / de buis 3% acroleïne-oplossing en start de pomp opnieuw. Verhoog geleidelijk de pompsnelheid 80 ml / min als de hartslag is gestopt. Perfuseren ongeveer 500 ml van acroleïne-oplossing.
- Stop de pomp snel overdracht van de slang op de 4% PFA-oplossing en start de pomp opnieuw. Deze stap vereist ongeveer 1 L PFA.
OPMERKING: De bevestiging is voltooid wanneer de voorpoten rigide en de nek stijf. - Snijd de kop en zorgvuldig ontleden de hersenen uit de schedel. Zorg ervoor dat de hersenen niet beschadigt met de chirurgische instrumenten. De perfusie is optimaal wanneer de hersenen bleek (geen spoor van bloed) en rigide (figuur 1A).
- Dompel de intacte hersenen in 4% PFA gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Serieel stuurde de hersenen met een vibratome koeling (4 ° C)in het gewenste vlak in 50 urn dikke secties en verzamelen in PBS (0,1 M) (Figuur 1B).
Opmerking: Deze stap kan op verschillende wijze, afhankelijk van het gewenste protocol worden uitgevoerd. Halve bollen kunnen worden gescheiden vóór het uitsnijden of bewaard gehele Vibratome. Als de hersenen is te groot voor de vibratome platform, kan het worden gesneden in kleinere blokken. Na deze stap kunnen gedeelten worden opgeslagen gedurende een lange tijdsperiode bij -30 ° C in een antivries oplossing van 40% PB (50 mmol), 30% glycerol en 30% ethyleenglycol.
3. Pre-inbedding immunohistochemie (Figuur 1C)
- Bereid een 4 liter voorraadoplossing van Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, 50 mM, pH 7,6) als volgt.
- Meet 2L gedestilleerd water in een 4 liter beker, voeg 24,23 g trihydroxymethyl aminomethaan (THAM; C4-H 11 NO 3) en roer om op te lossen.
- Breng de pH op 7,6 met ongeveer 148 ml 1 N HCl. Het zuur moet worden toegevoegd CautiOp vermijden bereiken onder pH 7,6. Het totale volume moet 4 L.
WAARSCHUWING: HCl zeer corrosief. Draag de juiste PBM.
- Selecteer secties (uit stap 2.11) met het van belang zijnde te worden verwerkt voor immunohistochemie EM.
- Was de vrij zwevende gedeelten 3x in PBS (0,1 M, pH 7,4) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur aan de antivriesoplossing spoelen.
- Bereid een 0,5% oplossing van NaBH4 in PBS verdund.
- Weeg 0,05 g NaBH4 en verdund in 10 ml PBS. Niet bedekken. Bereid deze oplossing vlak voor gebruik.
- Incubeer de secties in de vers bereide NaBH4 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Wiegen. Niet bedekken.
- Was 3x in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, schommelen krachtig tot geen van het reactiegas blijft.
- Bereid een blokkeeroplossing EM met 2% geschikte normaal serum en 0,5% visgelatine koud verdund in PBS.
OPMERKING: De hoeveelheid should worden berekend om verzadigd worden de volgende drie stappen. Gebruik een serum uit dezelfde diersoort gastheer het secundaire antilichaam. Vermijd het gebruik van antigen retrieval methoden of toevoeging van kleine hoeveelheden van Triton (de penetratie van antilichamen te verhogen), omdat deze methoden aanzienlijk de kwaliteit van het weefsel in gevaar brengen. - Incubeer de secties in de blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wiegen.
- Bereid primaire antilichaam verdund in blokkeeroplossing.
Opmerking: De concentratie van het primaire antilichaam doorgaans gelijk LM immunohistochemie, maar overwegen om proeven met verschillende antilichaamconcentraties voren, zoals sommige primaire antilichamen niet werken met acroleïne. Zo is het mogelijk om een combinatie van glutaaraldehyde gebruikt (0,1-2%) en 4% PFA transcardiale perfusie en vergelijkbare resultaten te verkrijgen. Optimaliseren van de incubatietijd en temperatuur ook. - Incubeer de secties primaire antilichaamoplossingnacht bij kamertemperatuur onder rustig schommelen. Een eerder geteste incubatietijd en temperatuur.
- Was de secties 3x in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder rustig schommelen.
- Maak een 1: 1000 oplossing van gebiotinyleerd secundair antilichaam verdund in blokkeeroplossing.
Opmerking: Het secundaire antilichaam moet worden opgewekt tegen de gastheersoort gebruikt om het primaire antilichaam te vormen. - Incubeer de secties secundaire antilichaamoplossing gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Wiegen.
- Bereid een oplossing van avidine-biotine-peroxidase (ABC) ten minste 60 minuten voor het einde van de tweede antilichaam incubatie.
- Gebruik een gekalibreerde pipet 8,80 ul / ml oplossingen A en B te meten en te verdunnen in PBS.
- Rots licht gedurende ten minste 60 minuten bij kamertemperatuur met een totale binding tussen avidine en biotine moleculen mogelijk.
- Na de incubatie in secundaire antilichaamoplossing was 3x in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de secties in het ABC zodatOplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Wiegen.
- Was eenmaal in PBS en tweemaal in TBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder rustig schommelen.
- Bereid een verse oplossing van 0,05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) met 0,005% H2 O2 verdund in TBS.
- Weeg 12,5 mg DAB en verdund in 25 ml koude TBS. Beschermen tegen licht.
LET OP: De DAB poeder is zeer vluchtig en schadelijk bij inademing. Het is kankerverwekkend en teratogeen. Zo moeten zwangere of zogende vrouwen niet dit product te manipuleren, zelfs indien verdund. Gebruik een N95 masker bij het manipuleren en slijtage PPE. - Filtreer de oplossing en voeg 4,5 pl 30% H 2O 2 vlak voor gebruik.
- Weeg 12,5 mg DAB en verdund in 25 ml koude TBS. Beschermen tegen licht.
- Incubeer secties in DAB oplossing 3-7 minuten bij kamertemperatuur. Wiegen.
OPMERKING: De bruine neerslag mag niet te donker zijn om een hoog niveau kleuring van de ondergrond te voorkomen. De incubatietijd moet dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. - Stop de reactie door snel tweemaal wassenin koude TBS, daarna tweemaal gedurende 10 minuten in koude TBS bij kamertemperatuur, gevolgd door tweemaal gedurende 10 min in PB, met een lichte schommelen.
Opmerking: Het gebruik van PB (en niet PBS) is kritisch om alle sporen van NaCl te verwijderen, aangezien het zou reageren met osmium en vormen kristallen.
4. Osmification and Embedding voor Electron Microscopic Observation
- Bereid een oplossing van 1% osmiumtetroxide (OsO4) verdund in PB. Beschermen tegen licht.
LET OP: Osmium is zeer giftig en mag niet in contact komen met de huid, ogen of mond en mag niet worden ingeademd. Het kan leiden tot de dood als ze worden ingeslikt. Het mag alleen worden gebruikt onder een ontluchting kap en met geschikte PBM. - Incubeer de secties OsO4 oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder de motorkap ontluchting (zonder roeren) en bedek ze met aluminiumfolie om ze te beschermen tegen licht. Volledig plat de secties voorafgaand aan het toevoegen van de OsO4 oplossing.
LET OP: De secties worden erg donker en rigid en moet worden gemanipuleerd met zorg na deze stap. - Bereid waterafstotende epoxyhars tijdens de osmification.
- Voeg geschikte hoeveelheden van elke component van het epoxyharsmengsel (20 g epoxyhars, 20 g hardingsmiddel, 0,6 g versneller en 0,4 g weekmaker) tot een grote plastic beker. Roer met een houten stok of plastic pipet tot een homogene bruine kleur wordt verkregen.
LET OP: Het is cruciaal om de juiste verhouding van elke component te gebruiken. - Transfer gelijke hoeveelheden aluminium cups van geschikte afmetingen, afhankelijk van het aantal delen te verwerken. Laat het rusten.
- Voeg geschikte hoeveelheden van elke component van het epoxyharsmengsel (20 g epoxyhars, 20 g hardingsmiddel, 0,6 g versneller en 0,4 g weekmaker) tot een grote plastic beker. Roer met een houten stok of plastic pipet tot een homogene bruine kleur wordt verkregen.
- Was de osmificated secties 3x in PB 10 min bij kamertemperatuur onder lage snelheid schommelen.
- Uitdrogen de secties in de volgende reeks van gegradeerde ethanol gedurende 2 minuten elk 2 maal in 35% ethanol; 1 maal elk in 50, 70, 80, 90, en 95% ethanol; en 3x in 100% ethanol.
- Breng de secties om glazen flesjes aan de dehydrati voltooienbetreffende proces incuberen van de secties 3 keer gedurende 2 minuten in propyleenoxide.
VOORZICHTIG: Propyleenoxide is een zeer vluchtig en toxische organische oplosmiddelen. Het kan ernstige schade aan de ogen en huid veroorzaken in geval van contact of indien ingeademd of ingeslikt. Het is geclassificeerd als een graad 2 kankerverwekkende stof. Het mag alleen worden gebruikt onder een ontluchting kap en PPE. Het is ook zeer brandbaar en moet uit de buurt van een warmtebron worden gehouden.
OPMERKING: Voorafgaand aan deze stap moet delen zorgvuldig overgebracht in glazen flesjes, aangezien propyleenoxide een organisch oplosmiddel en onverenigbaar met kunststof. Op dit punt, secties zijn erg kwetsbaar en moeten worden gemanipuleerd met zorg. Secties kan ook worden overgebracht in glazen flesjes voorafgaand aan stap 4.5. - Overdracht secties zorgvuldig, een voor een, in aluminium bekers en contact met lucht zoveel mogelijk te vermijden. Vlak insluiten de secties vooraf gemengde waterafstotend epoxyhars en incubeer ze een nacht onder Venting kap bij kamertemperatuur.
LET OP: Bij deze stap, de secties zijn volledig uitgedroogd en zeer fragiel en moeten worden gemanipuleerd met zorg. - Gebruik van minerale olie, bereid glasplaatjes met vet bekleed met ingevet plastic dekglaasjes.
- Zachter het hars door incubatie aluminium cups bij 60 ° C gedurende 12-15 minuten bij de meeste. plat zorgvuldig de secties in de ingevette kant van het glaasje. Plaats de ingevette dekglaasje en voorzichtig duwen de resterende lucht.
- Incubeer de objectglaasjes bij 60 ° C gedurende 48 uur.
Opmerking: Het is cruciaal om ten hoogste 48 uur incubatietijd, de hars te hard wordt. - Verwijder het plastic dekglaasje.
5. Monstervoorbereiding voor Ultradunne Sectioning en observatie met behulp van een Transmission Electron Microscope
- Gebruik een verrekijker naar de regio van belang te vinden en snijd een klein vierkant stukje van ongeveer 1 mm 2 met een scalpel.
- Vijl het uiteinde van een blok hars en lijm de Quadrangular piece op (afbeelding 1C). Laat de lijm te drogen gedurende ten minste 1 uur of gedurende een nacht voorafgaand aan het snijden.
- Met behulp van een ultramicrotoom, snijd het vierkante stuk in 80 urn dikke secties (figuur 1D).
- Plaats de hars blok in een ultramicrotoom dek in de verticale positie, met een scherp scheermes, geleidelijke afbouw weerszijden van de hars blok een trapezium met gladde wanden vormen.
- Zet het dek in zijn horizontale stand en draai het blok tot de langste zijde van het trapezium naar beneden wijst.
- Gebruik een diamant ontbramingsgereedschap of een glas mes op het oppervlak van de vierhoekige stuk trimmen. Stel de ultramicrotoom tot 300 urn dikke secties gesneden in 1 mm / s. Pas het mes verticaal evenwijdig aan het vierhoekige deel en een zeer kleine horizontale hoek van ongeveer 1 ° weergegeven.
OPMERKING: Deze hoek kan de gebruiker het weefsel benaderen nagenoeg evenwijdig aan het oppervlak van de bvergrendelen wanneer immunologisch elementen eerder zullen vinden. Bij gebruik van deze parameters met de diamant ontbramingsgereedschap, de hars wordt een glanzende witte kleur. Wanneer het weefsel wordt gesneden, verandert of paars groenachtige kleur. - Met een dun 45 ° diamantmes voorzien van een boot gevuld met gedestilleerd water tot 80 urn dikke secties gesneden, glad secties door het over hen met een stuk absorberend papier gestort in xyleen en verzamel seriële secties in formvar beklede nikkel slot roosters of naakte 150 mesh koper roosters (figuur 1E).
- Plaats de roosters in een raster opbergdoos.
- Vlekken op de netten loodcitraat.
- Met een 5 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter met 1 bereid: 1 oplossing van gefiltreerd loodcitraat voorraadoplossing gefiltreerd en gedestilleerd water. Beschermen tegen licht.
LET OP: De voorraad oplossing van lood citraat moet elke maand vers worden gedaan om de vorming van vaste DEPOS voorkomenhaar. Zie het materiaal blad voor de voorraad recept. Bovendien, als vele series van roosters moeten worden gekleurd, wijzigt de verdunde oplossing als het melkachtig wordt. - Plaats elk rooster op een daling van de verdunde oplossing, waarbij het deel in contact met de oplossing. Incubeer gedurende 3 min.
- Met kleine pincet om het net te houden, en spoel in twee bekers met gedestilleerd water.
- Verwijder overtollig water door zachtjes met absorberend papier. Bewaar de roosters in een raster doos. Wacht 30 minuten alvorens de secties van transmissie elektronenmicroscopie (TEM Figuur 1F).
- Met een 5 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter met 1 bereid: 1 oplossing van gefiltreerd loodcitraat voorraadoplossing gefiltreerd en gedestilleerd water. Beschermen tegen licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze paragraaf presenteren we representatieve resultaten die werden verkregen na de opmerkingen bij de transmissie EM niveau van immunogekleurd primaten hersenweefsel chemisch gefixeerd met een mengsel van 3% acroleïne en 4% PFA. We bereikten goede conservering van de ultrastructuur, zoals aangegeven door de betrekkelijk intacte myelineschede en nette visualisatie van dubbelmembranen (figuur 2A). Synaptische contacten met neuronale elementen van de micro-omgeving, kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd (Figuur 2B). Neuronale elementen gelabeld met diaminobenzidine (DAB) immunologisch worden opgenomen op het niveau EM hun gevulde cytoplasma of axoplasm. Het plasmamembraan en het buitenoppervlak van organellen ook typisch bekleed met de elektron-dichte neerslag (figuur 3).
In dit experiment gebruikten we antilichamen against de serotonine transporter (SERT), choline acetyltransferase (ChAT), of tyrosine hydroxylase (TH) om immunologisch neuronale elementen in de externe (GPe) of intern (GPi) segment van de globus pallidus eekhoornaap (figuur 3) te visualiseren. Om dit te doen, hebben we gebruik gemaakt van een combinatie van fixerende chemicaliën die antigeniteit behouden evenals ultrastructuur, waardoor een gedetailleerd morfologisch onderzoek. Hoewel veel antilichamen kunnen worden gebruikt met de transcardiale perfusie hierboven beschreven protocol, raadzaam gebruikers voeren optimalisatie concentratietest, en beschouwt een aantal primaire antilichamen zijn aan geen optimaal immunokleuring met acroleïne fixatie. Als alternatief, wanneer antilichamen niet optimaal immunokleuring voorzien acroleïne fixatie, een verdunning van 0,1-2% glutaaraldehyde in 4% PFA kan worden gebruikt voor transcardiale perfusie. Het biedt tissuekwaliteit relatief gelijk aan acroleïne-gefixeerd hersenweefsel met behouden antigeniciteit veleantilichamen (Figuur 4).
Tenslotte bieden wij typische voorbeelden van EM microfoto's verkregen na ongepaste manipulaties. Een slechte fixatie tot veranderde myelineschede (Figuur 5A, B) en problemen bij de visualisatie van dubbelmembranen neurieten (figuur 5C, D), waardoor een betrouwbare identificatie en analyse van gelabelde en ongelabelde neuronale elementen. Een overmatige incubatietijd in de DAB oplossing creëert excessieve achtergrond en niet-specifieke kleuring die vals-positieve resultaten die zouden kunnen genereren. Background of niet-specifieke kleuring wordt soms onvolledige kleuring van neuronale elementen (Figuur 6A, B), maar vaker talrijke en dicht in de buurt gekleurd neuronale elementen (figuur 6C, D). Het gebruik van wasmiddel in de blokkerende oplossing verandert aanzienlijk de kwaliteit van het weefsel. Het kan leiden tot het missenorganellen in gelabelde elementen (figuur 7A) of afbraak van myeline (figuur 7B) en cellulaire membranen (figuur 7C), waardoor alle acute interpretatie van de micro moeilijk. Tenslotte een misstep in het osmification werkwijze, zoals het gebruik van spoeloplossing die natriumchloride bevat, produceert onbetrouwbare resultaten waarbij de celstructuren moeilijk te onderscheiden (figuur 7D).
Figuur 1: Schema van de essentiële stappen van het protocol. De aap hersenen (A) wordt gesneden in seriecoupes met een koeling vibratome (B). Vervolgens verwerkt voor inbedding pre-immunohistochemie en elektronenmicroscopie, waarna het interessegebied op het uiteinde van een kunststof blok (C) wordt gebracht en gesneden tot 80 nm dikke sections met een ultramicrotoom (D). Ultradunne secties worden dan verzameld op naakte 150 mesh koper roosters of formvar nikkel beklede roosters (E), gekleurd met loodcitraat en aanpassen onder transmissie-elektronenmicroscoop (F) wordt waargenomen. Schaal bars: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Goed bewaard gebleven Primate hersenweefsel na Acroleine-PFA transcardiale perfusie. Elektronenmicrofoto's van eekhoornaap (Saimiri sciureus) hersenweefsel van de GPi (A) en GPe (B) toont representatieve goed bewaarde materiaal na het uitvoeren van acroleïne-PFA transcardiale perfusie en immunoperoxidase-diaminobenzidine techniek. de mYelin mantel van axonen (a) relatief intact (zie pijlpunt in A) en de algemene ultrastructuur is goed geconserveerd in A en B. dendritische profielen (d), (a) en axon varicosities (av) kleine gemyeliniseerde axonen gemakkelijk kan worden geïdentificeerd. Een voorbeeld van een axon varicosity vaststelling van een symmetrische synaptisch contact (tussen pijlen) met een dendritische profiel (d) is getoond in B. Schaal bar: 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Profielen van Doodshoofdaapje GPe en GPi immunologisch als choline-acetyltransferase (ChAT), serotonine transporter (SERT) en tyrosine hydroxylase (TH) via de immunoperoxidase-diaminobenzidine techniek. immunogelabelde elementen kunnen eenvoudig worden geïdentificeerd door hun cytoplasma of axoplasm vol elektronendichte DAB neerslag. Gelabelde dendritische profielen worden herkend door gevulde microfilamenten, zoals in A, waarbij een ChAT-immunostained dendriet in GPi ontvangt een synaptisch contact (tussen pijlen) van een ongemerkt axon varicosity (av). De elektronenmicrofoto in B toont een gemyeliniseerde axonen in het GPe met een betrekkelijk intacte myelineschede waarvan axoplasm is immunologisch TH. De voorbeeld C toont een axon varicosity in GPi immunologisch voor SERT en wordt gezien als een symmetrische synaptisch contact (tussen pijlen) met een dendriet (d) vaststellen. In dit voorbeeld is de DAB precipiteren lijnen het plasmamembraan en het buitenoppervlak van organellen (mitochondriën en synaptische vesikels). Het axon varicosity in D werd waargenomen in de GPe en immunologisch TH en is een voorbeeld van de DAB neerslag axop volledig vullenLASM, met synaptische blaasjes zichtbaar maar moeilijker te bakenen. Elementen van het micromilieu kan gemakkelijk worden geïdentificeerd, zoals bijvoorbeeld gemyeliniseerde axonen en ongemyelineerde (a) en incidentele dendrieten (d) die de gemerkte axon varicosity. Elektronmicrografen gewijzigd ten opzichte van 25, 26, 27. Schaal bar: 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van Primate hersenweefsel na glutaaraldehyde-PFA transcardiale perfusie. Representatieve elektronenmicrofoto's van macaque apen (Macaca fascicularis) hersenweefsel van de GPe (A) en GPi (BD) na Performing transcardiale perfusie met 0,2% glutaaraldehyde gemengd met 4% PFA en immunoperoxidase-diaminobenzidine techniek met een antilichaam tegen de serotonine transporter (SERT). Zoals in Figuur 2, immunologisch elementen kunnen worden geïdentificeerd door hun cytoplasma en axoplasm vol elektronendichte DAB neerslag. Algemene ultrastructuur relatief intact en elementen van het micromilieu kan gemakkelijk worden geïdentificeerd, zoals blijkt uit gemyeliniseerde axonen en ongemyelineerde (a) en incidentele dendrieten (d) en axon varicosities (av) die de gemerkte axon varicosities, zoals beschreven in figuur 2. Merk echter op de inconsistentie in de kwaliteit van de ultrastructuur, aangeduid met welbepaalde plasmamembranen (pijlpunten), maar relatief beschadigde myelineschede (pijl). Schaal bar: 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van Primate hersenweefsel verkregen na een mislukte transcardiale perfusie. Resultaten van een mislukte chemische fixatie wordt hier de eekhoornaap GPi getoond (A - B) en GPe (C - D) transcardiaal geperfuseerd met 0,9% NaCl spoeloplossing en een mengsel van ijskoude 4% PFA en 15% picrinezuur verdund in 0,1 M PB (pH 7,4). De hersenen werden nagefixeerd 1 uur bij 4 ° C in 4% PFA en 30% sucrose en in 60 urn dikke sagittale secties gesneden met een koeling vibratoom. Ongepaste gefixeerd hersenweefsel kan door een beschadigde myelineschede (A en B, pijlpunten) worden herkend, alsmede door wazig of ongedefinieerde plasmamembranen (C en D, zie pijlpunten voor voorbeelden). Verschillende neuronale elementen difficult te identificeren, waardoor de interpretatie van de ultrastructuur onbetrouwbaar. Schaal bar: 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Voorbeelden van niet-specifieke ChAT Immunologisch merken in de Doodshoofdaapje GPe. Achtergrondkleuring of niet-specifieke immunokleuring verschijnt soms onder de EM als gedeeltelijke kleuring van grote cellulaire elementen, zoals in A - B (pijlpunten). Dergelijke niet-specifieke kleuring dan vaker aan het oppervlak van immunostained secties. Andere voorbeelden van niet-specifieke immunokleuring omvatten de frequente waarneming van zeer kleine elementen roepen kleine, gemyeliniseerde axonen gedeeltelijk of geheel gevuld met DAB en ligt zeer dicht bij eennother, zoals aangetoond door pijlpunten in C en D. Schaal bar: 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Beschadigde Doodshoofdaapje GPe weefsel na Misstappen in Monsterbereiding voor elektronenmicroscopie. Het gebruik van detergens, zoals Triton X-100, in de blokkeeroplossing, zelfs bij een lage concentratie van 0,02%, verandert hoofdzaak de integriteit van de ultrastructuur van beschadiging van het cytoplasma van dendrieten (A) of de myelineschede van axonen (B ). De verschillende neuronale elementen zijn ook moeilijk te onderscheiden van elkaar (C), omdat de plasmamembranen beschadigd en moeilijk af te bakenen. De werkwijze is als osmificationo een belangrijke stap in monsterbereiding. Het gebruik van natriumchloride in spoelwater (D) verandert de fixatie van het weefsel, waardoor daaropvolgende analyse moeilijk. Schaal bar: 800 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we een betrouwbaar protocol voor transcardiale perfusie van niet-humane primaten en pre-inbedding immunohistochemie geschikt voor EM modelexamen. Hoewel typische cryo-EM, zoals CEMOVIS, een goede conservering van de hersenen ultrastructuur, maar beperkt ook het gebruik van immunohistochemie 12. Andere technieken, zoals cryo-substitutie en Tokuyaso techniek laat na inbedding immunohistochemie, maar deze technieken zijn duur als gevolg van extra apparatuur nodig tijdens het proces kan tijdrovend en vaardigheden uitdagende 12, 14, 15 zijn. Bovendien, om de cryo-fixatie methode efficiënt gebruik van het monster relatief klein zijn (tot 200 urn dik bij gebruik van hoge druk invriezen 28 en 10 urn bij atmosferische druk 29). In het ideale geval om een goede krijgenresultaten met cryo-fixatie van primaat hersenweefsel, het monster moet worden genomen van een biopsie, veroorzaakt problemen bij het vinden van de exacte locatie van het gebied van belang. Dit probleem moet worden omzeild door het gebruik van stereotactische coördinaten. De chemische fixatie acroleïne en boven voorgestelde pre-embedding techniek biedt een eenvoudige, goedkope tijdbesparende en betrouwbare werkwijze voor monsterbereiding primaten hersenweefsel en immunokleuring EM. Als volgt, zal men een goed geconserveerd ultrastructuur verkrijgen met antigeniciteit te houden met de immunokleuring van de meeste eiwitten. Echter, chemische bevestiging voor EM heeft ook zijn nadelen. Ten eerste, terwijl fixeermiddel oplossingen zoals acroleïne behoud van de morfologische gegevens van het hersenweefsel, is het mogelijk dat sommige morfologische veranderingen optreden tijdens de chemische fixatie proces en de resultaten vergeleken met die welke zou worden verkregen CEMOVIS of cryo-substitutie technieken veranderen. Ten tweede, het fixatieproces endaaropvolgende dehydratatie nodig voor het inbedden van hars meeste extracellulaire vloeistoffen verwijderen en druk cellulaire componenten samen, waardoor krimp van weefsel dat aanzienlijk wijzigt hun grootte en vorm ten opzichte van cryo-gefixeerde cellen 21, 30. Toch is aldehyde fixatie met succes gebruikt in veel laboratoria over de hele wereld en wordt algemeen aanvaard in de literatuur als een betrouwbare methode voor het bestuderen van de ultrastructurele kenmerken van neuronen en gliacellen, ondanks de eerder genoemde problemen 21, 30, 31, 32.
Vergeleken met de hierboven beschreven werkwijze, de postembedding immunohistochemie die nodig is voor cryo-gefixeerde monsters ingebed in methacrylaat hars, minder gevoelig en de detectie van het centrale zenuwstelsel antigenen beperkt 14 >, 33. Echter, aldehyde fixatie heeft ook beperkingen met betrekking tot antigeniciteit. Daarom is het belangrijk om de specificiteit van de antilichamen voor een bepaald chemisch fixatieprotocol op LM te testen voordat de EM preparaat. De kwaliteit van immunohistochemie op acroleïne gefixeerd hersenweefsel ook afhankelijk eerder breekt de sterke aldehyde bindingen door chemische fixatie. Deze stap kan worden verkregen door incuberen van de secties voor immunohistochemie met natriumboorhydride (zie stap 3,3-3,5). Het weglaten van deze stap zou zeker leiden tot een suboptimale immunokleuring 34. Indien de antilichamen worden gebruikt do optimale kleuring van hersenen met acroleïne vaste delen te geven, kan men ook gebruik glutaraldehyde (0,1-2%) verdund in 4% PFA. Dit werd bewezen goed behouden brain ultrastructuur terwijl voldoende behoud van antigeniteit vele antilichamen en hersenweefsel biedengeschikt voor lange termijn opslag met minimale wijzigingen 20, 21, 35, 36, 37. Het is ook mogelijk om relatief goede fixatie en antigeniciteit geschikt spiraal met PFA alleen bereiken door aanzienlijk verhogen van de pH van de oplossing, maar een combinatie van meer dan één fixeermiddel tijdens perfusie heeft betere resultaten 34 ontvangen en studies ondersteunen dat PFA fixatie alleen algemeen produceren slecht bewaard gebleven weefsel voor EM onderzoek 38, 39. Echter, in sommige zeldzame gevallen, antigeniciteit is zeer moeilijk te onderhouden, en PFA fixatie alleen blijft de enige haalbare optie is voor EM onderzoek.
Vele stappen in dit protocol moet zorgvuldig worden gevolgd om optimale resultaten te verkrijgen. Bijvoorbeeld het bereiden van de 4% PFA-oplossingmoeten worden uitgevoerd bij temperaturen boven 45 ° C zodat de PFA-poeder op te lossen, maar het is noodzakelijk dat de temperatuur onder 60 ° C blijft. Anders PFA oplossing depolymeriseert in formaldehyde en mierenzuur, waarbij het weefsel verschillend fixeert en vormt een zure oplossing die tissuekwaliteit 40, 41 aanzienlijk kunnen veranderen. Bovendien is het kritisch dat de perfusie stappen snel worden uitgevoerd nadat het membraan is gesneden, aangezien hypoxie en hypercapnie onomkeerbare fysiologische veranderingen in de hersenen die de kwaliteit en integriteit van het weefsel 31 kunnen veranderen zal produceren. Gebrekkige fixatie kan schadelijk zijn voor het behoud van hersenweefsel en permanent veranderen de ultrastructuur van het weefsel, zoals plasmamembranen, mitochondria en synapsen. Zo oplossing voorbereiding en perfusie stappen moeten met zorg worden uitgevoerd. Succesvolle EM monster preparaten ook zeer afhankelijk is van een goede post-fixatie in osmiumtetroxide. Inderdaad, directe perfusie met osmiumtetroxide beschreven het produceren redelijk intact weefsel EM observatie 21, 39. Maar veel verschillen in termen van de hoeveelheid van de extracellulaire ruimte en de verschijning van het plasmamembraan tussen osmium geperfundeerd en aldehyd geperfundeerde dieren opgemerkt. Bovendien, het zwart en verharding van de weefsels na osmium perfusie maakte de verwijdering van de hersenen uit de schedel, de daaropvolgende dissectie, en het onderscheid tussen witte en grijze stof moeilijker, ten gunste van aldehyde perfusie voor een betere weefsel behoud en gemakkelijker manipulatie 21. Aldehyd fixatie alleen lijkt de extracellulaire ruimte, waarbij de integriteit van het weefsel verandert en geeft de indruk van nauwe overgangen waar de extracellulaire ruimte moeten worden beschouwd verminderen en aldus niet aan te tonenaanvaardbare elektronenmicrofoto's ook na loodcitraat 42 kleuring. Echter, postfixatie in osmiumtetroxide omgekeerde situatie doordat een zeer duidelijke scheiding tussen tissue elementen, die noodzakelijk zijn voor de identificatie 42 is dus duidelijk rechtvaardigt het belang van het uitvoeren van de osmification stappen (stappen 4,1-4,2) voorzichtig.
De omstandigheden en concentraties waaronder deze stappen uitgevoerd zijn getest in ons laboratorium, speciaal voor pre-inbedding immunohistochemie met behulp DAB als neerslag op primatenbrein secties. Hoewel skill uitdagende, double-immunohistochemie kan door post-inbedding immunohistochemie met gouddeeltjes 43. De elektron-dichte DAB-precipitaat verkregen na de hier voorgestelde immunoperoxidase-diaminobenzidine techniek is zeer gemakkelijk te identificeren op EM niveau, aangezien schetst plasmamembranen en uiter oppervlakken van organellen, terwijl nog steeds het identificeren van sub-cellulaire componenten, zoals mitochondriën en synaptische contacten. Bovendien, zodra deze techniek beheerst voor eenmalig immunohistochemie, is het mogelijk dubbele immunohistochemie voeren combineert DAB precipiteren gouddeeltjes, die gemakkelijker onderscheiden worden van elkaar dan goud deeltjes van verschillende grootte. We zouden aanraden om strenge testen van het antilichaam specificiteit, osmium concentraties en incubatietijd en temperatuur vóór de verwerking van de hersenen secties voor EM. Protocollen voor pre-inbedding en dubbele immunohistochemie EM werden eerder gepubliceerd en kan worden aangepast voor primaten hersenweefsel 16.
Concluderend, de transcardiale perfusieprotocol niet-menselijke primaten hierboven gepresenteerde maakt de langdurige opslag van hersensecties die vervolgens kunnen worden gebruikt voor EM-pre inbedding immunohistochemie. sections verkregen zijn ook geschikt voor neuroanatomische studies op LM niveau. Dus met behulp van een protocol dat geschikt is voor zowel EM en LM, is het mogelijk om het aantal gebruikte dieren, kostenefficiënt en ethische overweging te verminderen. Het maakt het ook een directe vergelijking tussen de resultaten verkregen bij de LM en EM verdiepingen op hetzelfde dier en maakt het gebruik van Correlatieve Licht en Elektronenmicroscopie (CLEM) studies. CLEM studies zijn vooral gericht op het gebruik van genetisch gemanipuleerde muizen die fluorescerende eiwitten, zoals EGFP, waardoor later elektronendichte neerslag op het niveau EM 44 worden gemerkt en geobserveerd. Als alternatief om het probleem van immunohistochemie, cryo-fixatie kan worden gecombineerd met een intraneuronale injectie van elektronen-dichte markers, omzeilen zoals quantum dots 45, vóór het invriezen, waardoor visualisatie op het niveau EM 46. Echter, quantum dots zijn niet biocompatibel enhet gebruik is duur en tijdrovend vanwege de extra invriesapparaat nodig voor verdere weefselpreparaat. Alhoewel deze technieken nog steeds cryo-fixatie bevorderen en vries-substitutie methoden, zijn er enkele ontwikkelingen voor het gebruik van chemische tags op semi-dunne (300 nm) secties verschillende cellulaire eiwitten te labelen met synthetische fluoroforen, die kan worden gecorreleerd met EM-analyse 47 . Technieken waarmee bijvoorbeeld de correlatie tussen een specifieke lokalisatie axon via fluorescentie en zijn relatie met synaptische neuronen van een bepaalde doelstructuur behulp EM, tamelijk veelbelovend voor het begrijpen van de organisatie van het zenuwstelsel, in het bijzonder bij primaten. In dit geval moet acroleïne fixatie de voorkeur boven glutaaraldehyde, daar deze zal autofluorescentie dat de juiste visualisatie van hersenstructuren op LM niveau kunnen veranderen produceren. Er zijn echter maar weinig studies van dit type ondernomen bij primaten, mostly als gevolg van technische uitdagingen en de hoge kosten die dergelijke experimenten op te leggen. Derhalve zijn nieuwe ontwikkelingen nodig voor succesvolle en goedkope CLEM studies bij primaten, zoals het verbeteren van fixatie of met gebruikmaking van chemische markeringen zichtbaar op zowel niveaus LM en EM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC, 401.848-2.011 naar MP). MP kreeg een carrière onderscheiding van het Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE was de ontvanger van een doctoraatsbeurs van FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Wij danken Marie-Josée Wallman voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
| Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
| Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
| Acrolein (90%) | Sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
| Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
| Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
| Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18 G 11/2 |
| Needle | terumo | NN-2713R | 21 G 1/2 |
| Ketamine | 20 mg/kg | ||
| Xylazine | 4 mg/kg | ||
| Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
| Scalpel | |||
| Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
| Surgical scissors | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
| Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
| Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | S-9125 | |
| Normal horse serum (NHS) | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
| Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
| Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
| Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
| Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1,000 dilution |
| Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
| Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0.005% dilution |
| Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 |
Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
| Durcupan water-repellent epoxy resin | Sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) |
Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste. |
| Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
| Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
| Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
| Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
| Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
| Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
| Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
| Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
| Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
| grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
| Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
| Lead nitrate | Sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
| Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
| Syringe filter | Corning | 431222 | 0.2 µm |
| Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
| Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 |
References
- Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
- Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
- Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
- Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
- Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
- Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
- Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
- Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
- Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
- Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
- Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
- Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
- Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
- Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
- Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
- Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
- Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
- King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
- Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
- Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
- Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
- Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
- Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
- Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
- Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
- Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
- Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
- Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
- Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
- Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
- Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
- Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
- Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
- Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
- Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
- Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
- van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
- Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
- Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
- Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
- Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
- Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).
