Summary
여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.
Abstract
빛 현미경 수준에서 모든 기술의 진보에도 불구하고, 전자 현미경은 시냅스 연락처 등의 신경 세포의 미세 구조 및 형태 학적 세부 사항을 검토하고 특성화 신경 과학에서 유일한 도구 남아있다. 전자 현미경에 대한 뇌 조직의 잘 보존 엄격한 극저온 고정 방법에 의해 얻을 수 있지만, 이러한 기술은 오히려 비용이 많이 드는 및 확인 된 신경 시스템의 연결을 이해하는 것이 중요하다 immunolabeling의 사용을 제한 할 수 있습니다. 동결 교체 방법 immunolabeling 함께 극저온 고정 조합을 허용하도록 개발되었다. 그러나 이러한 방법 론적 접근 방법의 재현성은 일반적으로 비용이 많이 드는 냉동 장치에 의존합니다. 또한,이 기술로 신뢰할 수있는 결과를 달성하는 것은 매우 시간이 많이 걸리는과 기술 - 도전이다. 따라서, 특히 아크롤레인과 정착액 전통적인 화학적 고정 뇌, 전자를 결합하는 동시에 효율적인 저비용 방법 유지면역 조직 화학 염색과 현미경. 여기서는 영장류 뇌 조직의 보존을 초래하고 면역 및 투과 전자 현미경 검사를 미리 매립 호환 화학 아크롤레인을 고정하여 안정적인 실험 프로토콜을 제공한다.
Introduction
공 초점 및 두 광자 현미경을 포함한 광학 현미경은, 2, 다른 것들 한 가운데, 생체 신경 과정에서 공부를위한 효율적인 도구가 될 입증되었습니다. 빛 현미경 (LM) 레벨의 전형적인 공간 분해능은 극 자외선과 연 X 선 현미경 등의 다른 광원을 사용하여 약 200 nm의 최근의 기술적 진보하지만, 특히 거의 10 nm의 공간 해상도 (3)이 해상도를 증가 4, 5. 화상의 다른 기술적 진보는 조직 학적으로 자기 공명 영상을 조합하여 생체 내에서 수초 만 전자 현미경 (EM) 레벨 6, 7에서 전통적으로 측정 하였다 파라미터의 두께를 측정하는 신규 방법을 제공하는 것을 포함한다. AlthouGH LM 수준에서 이러한 진보는 시냅스 접촉 생계 프로세스, 구조 상세도 및 특성을 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공하며, 0.5 nm의 도달 할 수있는 해상도를 제공 EM으로 달성 될 수있다. 그러나, EM 수준에서 관찰은 cytoarchitecture을 유지하기 위해, 화학 고정 제 및 탈수 프로세스, 어떤 방법으로 죽은 변경 될 표본을 필요로한다. 따라서, 높은 해상도에서 생물학적 시료를 조사하기 때문에, 방사선, 전자선 손상 낮은 반면, 막 구조의 편차, 또는 8, 9, 10을 매립 다음 탈수 에폭시 발생 아티팩트에도 존재하기 어려울 수있다.
구조 분석을 위해 그 나라의 형태로 표본을 보존하는 것은 "유리화 섹션의 곳을 알아내는 EM"을 사용하거나 CEMOVIS하는 단면 처리 방법에 의해 달성 될 수급속 동결 유리체 얼음 샘플을 삽입하고, 저온 (11), (12)에서 EM 아래 부분을 검사하는 것을 포함한다. 그들은 여전히 견고하고 완벽하게 수화 동안이 절차는 따라서 탈수로 인한 아티팩트를 제거하는 것은 13을 처리, 샘플의 시험이 가능합니다. 그러나이 방법은 상당한 추가 비용을 발생 매우 낮은 온도에서 이러한 관찰을 허용하기 위해, 극저온 ultramicrotomy에 대한 추가 장치뿐만 아니라 표준 EM에 추가 장치를 포함한다. 또한 CEMOVIS 접근 항체는 일반적으로 RT에서 배양 할 필요가 있기 때문에, 기술 immunolabeling의 사용을 배제한다. 또는, 극저온 화학 보호 담궜다 및 일 동안 극저온 고정 시험편을 서서히 해동하는 동안 동결 대체 접근법을 사용하여 면역 절차 미세 분석을 조합 할 수있다엉 같은 Lowicryls 같은 전문 수지에 포함. 포스트가 임베딩 immunolabeling하는 그러한 물질 (12) 상에 수행 될 수있다. 그러나 동결 대체 및 극저온 고정 기술은 시간이 소요됩니다. 그들은 추가 장비의 설치를 필요로 여전히 낮은 온도 (14), (15)의 사용에도 불구하고, 유기 용매와 cytoarchitecture을 변경할 수 있습니다 화학 고정액에 노출 될 샘플을 필요로한다. 따라서, 특히 아크롤레인과 LM 및 EM 수준, 뇌 조직의 화학 고정, 모두에서 모든 기술의 진보에도 불구하고, EM (16) 면역 조직 화학을 결합하는 낮은 비용 및 시간 효율적인 방법 남아있다.
지난 수십 년 동안 많은 시도는 최고의 조직 보존을 제공 알데히드의 혼합물을 발견 하였다. 1960 년대 이전, EM을 위해 허용되는 결과를 제공하는 유일한 화학 고정액은 오스뮴 테트 록 사이드이었다. 그러나, 산화 오스뮴은 뇌 등의 장기를 해결하기 위해 혈관 시스템을 통해 사용을 배제, 매우 독성이 비싸다. 아크롤레인 셀룰러 구조 (17)의 EM 관찰에 적합한 동물 조직 보존에 대한 신뢰성있는 방법으로서, 1950 년대 후반에 도입 하였다. 이는 더 깊은 조직을 관통하여 고정 침지 사용하고 조직 (17)의 최소 수축와 세포질 성분의 양호한 보존을 허용 다른 알데히드보다 빠르게 반응한다. 효소 및 다른 단백질 18 고분자 화합물을 살아있는보다 정확한 위치 파악을 가능하게하여, 신선한 조직에 사용되는 경우 이러한 특징은 고정 아크롤레인을 다른 알데히드에 비해 명확한 이점을 제공한다. 사실, 그것은 효율적으로 열차 단으로, 양서류 및 설치류 등 많은 종의 EM 수준의 시각화를위한 고정의 쉽고, 효율적이고 저비용의 방법으로 세월을 통해 검증되었습니다ZES 펩티드 및 단백질, 항원 성을 유지하고 16, 18, 19, 20, 21 정착액 다른 알데히드 병용 비교적 그대로 미세 구조를 제공한다. 설치류에서 아크롤레인 고정을위한 프로토콜은 그 이후 표준화 및 EM (16), (22)에 대한 이중 immunolabeling을 구현하기 위해, 특히 피켈 그룹에 의해 광범위하게 사용하고 있습니다. 몇 그룹은 인간이 아닌 영장류의 뇌 조직 23 아크롤레인 고정을 사용했다. 그러나, 우리의 지식을 효율적으로 EM (24) immunolabeling와 호환되는 인간이 아닌 영장류에서 아크롤레인과 화학 고정을 설명하는 하나의 출판 프로토콜이있다.
이 글에서, 우리는 효율적으로 화학적으로 비 콧노래를 해결하는 쉽고 안정적인 방법을 제공immunolabeling 송신 EM 시험을 미리 매립 함께 잠재적 장기 보존을 가능하게 아크롤레인와 영장류 뇌.
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Protocol
윤리 문 : 동물과 관련된 모든 프로토콜은 Comité 드 보호 데스 Animaux 드 난 대학 라발에 의해 승인되었고, 실험 동물의 관리 및 사용 (에드 2.)에 동물 관리 안내서에 캐나다 의회에 따라 만들어졌다. 여기에 설명 된 프로토콜은 약 800g의 성인 동물에 최적화되었다. 고정액의 볼륨은 동물의 크기에 따라 조정되어야한다.
Transcardiac 관류를위한 솔루션 1. 준비
- 다음 단계에있어서, 50 mM의 나트륨, 인산 완충 용액 (PBS) 용액 1 L를 준비한다. 관류 전에 대부분 24 시간에서 솔루션을 준비하고 사용할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
- 1 L의 비커에, 증류수 800 mL로 측정한다. 무수 이염 기성 인산 나트륨 5.87 g을 추가 (NA 2 HPO 4) 수화물 염기성 인산 나트륨 1.20 g (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O), 9 g염화나트륨 (NaCl을). 용해 저어.
- 서서히 5 N NaOH를 첨가하여 7.4로 pH를 조정한다. 1 L.의 총 부피에 도달하기 위해 증류수를 추가
주의 : NaOH를가 부식성 화합물이다. 적절한 개인 보호 장비 착용 (PPE;. 실험복, 장갑, 보호 안경 등).
- 다음 단계에있어서, 4 % 파라 포름 알데히드의 2 L를 준비한다. 이 용액을 수술 전에 최대 24 시간을 제조하고 사용할 때까지 4 ℃에서 보관한다.
- 2 L의 비이커에 증류수 1.5 L을 측정한다. 무수 이염 기성 인산 나트륨 23.48 g (NA 2 HPO 4) 염기 수화물 인산 나트륨 4.80 g 추가 (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O). 용해 저어. 2 L.의 총 부피에 도달하기 위해 증류수를 추가
- 55 ° C - 온도가 약 45에 도달 할 때까지 통기 후드 아래의 용액을 가열한다. 60 ° C 이상으로 가열하지 마십시오.
- 점차적 PFA 용액 80 g을 넣고 완전히 용해 될 때까지 교반 하였다 (약 30 - 60 분)를. 60 ° C 이하를 유지하기 위해 온도를 모니터링하십시오.
주의 : PFA는 분말 형태로 매우 휘발성이다. 그것은 눈이나 피부에 접촉하면 매우 독성이며, 흡입 또는 섭취의 경우에는 위험합니다. PPE를 착용하고, 배기 후드 아래에주의하여 사용합니다. - 39 ° C 필터로 용액을 냉각. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 다음 단계에있어서, 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 3 % 아크롤레인 1 L를 준비한다. PB에 솔루션은 이전 관류에 최대 24 시간을 준비해야합니다.
주의 : 아크롤레인을 흡입하고 즉각적인 손상을 일으킬 수있는 경우에 매우 독성이있다. 피부를 통해 흡수하는 경우에도 부식성 및 독성이 높은 것입니다. 그것은 발암 물질과 돌연변이입니다. 적절한 개인 보호구를 착용하고, 배기 후드 사용합니다.- 증류수 800 mL로 측정한다. 무수 이염 기성 인산 나트륨 8.66 g을 추가 (NA 2 4) 염기 수화물 인산 나트륨 5.38 g (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O). 모든 염이 용해 될 때까지 저어. 4 ℃에서 용액을 유지 총 용적 1 ℓ에 도달 증류수를 추가한다.
- 수술하기 전에, 1 L의 유리 용기에 PB 용액 900 mL로 전송하고 배기 후드 아크롤레인 97 % 용액 30.94 mL를 첨가. 1 L과 혼란의 총 부피에 도달하기 위해 PB 솔루션을 추가합니다. 솔루션을 필터링하고 4 ℃에서 보관하십시오.
2. Transcardiac 관류 및 뇌 해부
- 전체 수술 절차를 수행하는 동안 얼음에 솔루션을 유지합니다. (50 mM의 PBS) 및 공기 호스에 남아 있지 않을 때까지 펌프의 회전에 사용되는 제 용액에 튜브를 배치하여 펌프를 준비한다. 짧은 꼬리 원숭이의 (rongeur)로 들어 21 G 바늘을 사용하여 유출 물을 약 80 ㎖ / 분으로 설정.
- 혼합의 근육 내 주사하여 동물을 마취케타민 (20 ㎎ / ㎏), 자일 라진 (4 ㎎ / ㎏) 및 아세 프로 마진 (/ kg, 0.5 mg)을 진짜야. 이소 플루 란 (3 %) 마취하에 동물을 유지한다.
- 통기 테이블에 동물의 사지를 연결합니다.
- 메스로, 겨드랑이에 피부를 제거합니다. 복부 근육을 잘라. 주의 깊게 중요한 장기를 피하고 옆으로 갈비뼈를 잘라 대형 수술 가위를 사용합니다.
- 수술 용 가위로 다이어프램을 절감하고 심장을 노출 흉곽을 올린다. 다이어프램이 차단되면 심장 분 이내에 박동 정지하기 때문에, 신속하게 진행합니다.
- 메스 블레이드와 심낭를 제거하고 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 메스로 조심스럽게 우심방에 작은 절개를합니다. 신속 72 ㎖ / 분으로 펌프를 시작 위치에 바늘을 잡아. 가능하면 심장보다 낮은 수준에 머리를하기 위해 동물을 기울입니다.
참고 : 바늘을 삽입 할 때 심실 중격을 관통하지 않도록주의하십시오.- RINS폐까지 PBS의 약 300 mL를 전자 혈액은 흰색이며, 어떤 피가 우심방에서 온다.
- 신속하게 펌프를 정지 3 % 아크롤레인 솔루션에 호스 / 튜브를 전송하고 다시 펌프를 시작합니다. 심장 박동이 중단되면 서서히 80 mL / 분으로 펌핑 속도를 증가시킨다. 아크롤레인 용액 약 500 ㎖을 관류.
- 신속하게 펌프를 정지 4 % PFA 솔루션에 호스를 전송하고 다시 펌프를 시작합니다. 이 단계는 PFA의 약 1 L가 필요하다.
참고 : 앞다리가 경직하고 목이 뻣뻣한 때 고정이 완료됩니다. - 머리를 잘라 조심스럽게 두개골의 두뇌를 해부하다. 수술 악기 뇌를 손상하지 않도록주의하십시오. 뇌는 담색 (혈액의 흔적) 및 강성 (도 1a) 없을 때 관류 최적이다.
- 4 ℃에서 1 시간 동안 4 % PFA에 그대로 머리를 담가.
- 직렬 냉각에 vibratome (39 °의 C)에 뇌를 잘라50 개 μm의 두께 단면에 원하는 평면 PBS (0.1 M) (도 1b)에서이를 수집한다.
참고 :이 단계는 원하는 프로토콜에 따라 여러 가지 방법으로 수행 할 수있다. 반구 절단하거나 유지 전체에 vibratome 전에 분리 될 수있다. 뇌가에 vibratome 플랫폼에 대한 너무 큰 경우에는 작은 블록으로 절단 할 수있다. 이 단계 후에, 부 40 %의 PB (50 mM)을 30 % 글리세롤, 30 % 에틸렌 글리콜로 이루어진 부동액에서 -30 ° C에서 장기간 저장 될 수있다.
3. 면역을 사전 내장 (그림 1C)
- 다음 TBS 버퍼의 4 L 원액 (TBS, 50 mm의 pH를 7.6)을 준비한다.
- , 4 L의 비커에, 증류수 2L 측정 트리 히드 록시 아미노 메탄에 24.23 g의 추가 (탐은, C 4 H 11 NO 3), 및 교반 용해한다.
- 1 N 염산 148 mL로 약 7.6 pH를 조정한다. 산은 CAUTI 첨가되어야에 7.6 이하의 pH가 소진되지 않도록. 총량이 있어야 4 L.
주의 : 염산은 부식성이 높은 것입니다. 적절한 개인 보호구를 착용 할 것.
- 관심있는 영역을 포함한다 (단계 2.11)에서 선택 섹션 EM의 면역 조직 화학을 위해 처리된다.
- 부동액 용액을 씻어 RT에서 5 분 동안 PBS에서 부동성 섹션 배 (0.1 M, pH를 7.4) 세척 하였다.
- PBS에 희석을 NaBH 4의 0.5 % 용액을 제조 하였다.
- 을 NaBH 4 0.05 g을 달아 PBS 10ml에 희석. 덮지 마시오. 사용 직전이 솔루션을 준비합니다.
- RT에서 30 분 동안 갓 제조에 NaBH 4 용액의 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록. 덮지 마시오.
- RT에서 10 분 동안 PBS에서 세척 (3X)는, 반응 가스 중에까지 격렬하게 요동하는 유지된다.
- 적절한 2 % 정상 혈청 PBS에 희석하고 0.5 % 냉 어류 젤라틴 EM에 대한 블로킹 용액을 제조 하였다.
참고 : 수량 말아야위하여 계산 d는 다음 세 단계를 위해 충분한다. 이차 항체를 수용하는 동물 종에서 만든 혈청을 사용합니다. 이러한 방법은 상당히 조직의 품질을 타협 항원 검색 방법 또는 트리톤 소량 첨가의 사용을 피하고 (항체의 침투를 증가시키기 위해). - RT에서 1 시간 동안 블로킹 용액 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록.
- 블로킹 용액으로 희석하여 차 항체 용액을 제조 하였다.
주 : 차 항체의 농도는 일반적 LM의 면역과 동일하지만, 일부 차 항체 아크롤레인 작동하지 않을 것처럼 미리 상이한 항체 농도 도통 검사를 고려한다. (- 2 %, 0.1) 및 (rongeur)로 4 % PFA에 대한 유사한 결과를 얻을 경우에 따라서, 이는 글루 타르 알데히드의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다. 배양 시간 및 온도뿐만 아니라 최적화. - 차 항체 용액 섹션을 인큐베이션하룻밤 부드러운 락과 RT에서. 이전에 테스트를 배양 시간과 온도를 사용합니다.
- 부드러운 락과 RT에서 5 분 동안 PBS에 섹션 배를 씻으십시오.
- 블로킹 용액으로 희석 한 비오틴 차 항체 용액 1,000 : 1을 준비한다.
주 : 차 항체는 일차 항체를 생성하는 데 사용되는 호스트 종에 대해 제기해야합니다. - RT에서 1.5 시간 동안 차 항체 용액 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록.
- 적어도 60 분 전에 차 항체 배양의 마지막에, 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 (ABC) 용액을 제조 하였다.
- 용액 A와 B의 8.80 μL / mL로 측정하고,이를 PBS에서 희석 보정 피펫을 사용한다.
- 아비딘 및 비오틴 분자 사이의 결합 전체 있도록 RT에서 최소 60 분 동안 온화하게 흔들.
- 이차 항체 용액에서 배양 한 후, RT에서 10 분 동안 PBS에서 3 회 세척 하였다.
- 그래서 ABC에 섹션을 품어RT에서 1 시간 동안 기술인 것. 부드럽게 록.
- 부드럽게 흔들 함께 RT에서 10 분 동안 TBS 한번 PBS에 두 번 세척 하였다.
- TBS로 희석 0.005 %의 H 2 O 2, 0.05 % 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB)의 새로운 용액을 제조 하였다.
- DAB 12.5 mg의 무게 차가운 TBS의 25 ㎖에 희석. 빛으로부터 보호합니다.
주의 : 흡입하면 DAB 분말은 매우 휘발성 유해하다. 그것은 발암 및 기형이다. 희석 할 때 따라서, 임신 또는 수유 여성은 심지어,이 제품을 조작 할 수 없습니다. 조작시 N95 마스크를 사용하여 PPE를 착용하십시오. - 용액을 여과하고, 사용 직전 30 % H 2 O 2 4.5 μL를 추가한다.
- DAB 12.5 mg의 무게 차가운 TBS의 25 ㎖에 희석. 빛으로부터 보호합니다.
- RT에서 3 분 내지 7에 대한 DAB 용액 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록.
주 : 갈색 침전물을 배경 염색의 높은 수준을 피하기 위해 너무 어둡게해서는 안됩니다. 배양 시간은 적절하게 최적화되어야한다. - 빠르게 두 번 세척하여 반응을 중지차가운 TBS에서, 다음 회 RT 추운 TBS에서 10 분 동안 온화 락 PB로 2 회 10 분으로 하였다.
참고 : PB (그리고 PBS)의 사용은 오스뮴 및 형태의 결정과 반응하는 것처럼, 염화나트륨의 흔적을 제거하기 위해 매우 중요합니다.
전자 현미경 관찰 4. Osmification 및 포함
- PB로 희석하고, 1 % 오스뮴 테트 록 사이드의 용액 (OSO 4)을 준비한다. 빛으로부터 보호합니다.
주의 : 오스뮴은 매우 독성이 있으며 피부, 눈, 입과 접촉하지 말아야하고 흡입하지 않아야합니다. 섭취 한 경우는 사망에이를 수 있습니다. 그것은 단지 배기 후드 및 적절한 PPE와 함께 사용되어야한다. - (교반)없이 배기 후드 RT에서 30 분 동안 용액에 OSO 4 섹션을 인큐베이션하고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버. 완전히 OSO 4 용액을 첨가하기 전에 부분을 평평하게.
참고 :이 부분은 매우 어둡고 리하게GID이 단계 다음주의 조작해야합니다. - osmification 중에 발수 에폭시 수지를 준비한다.
- 큰 플라스틱 컵에 에폭시 수지 혼합물 (에폭시 수지 20 g, 경화제 20 g, 0.6 g 촉진제 및 가소제 0.4 g)의 각 성분의 적절한 양을 추가한다. 균일 한 갈색 얻을 때까지 나무 막대기 또는 플라스틱 피펫으로 저어.
참고 : 각 구성 요소의 정확한 비율을 사용하는 것이 중요합니다. - 적절한 크기의 알루미늄 컵에 동량로 이동 구간의 수에 따라 처리한다. 이 휴식을 허용합니다.
- 큰 플라스틱 컵에 에폭시 수지 혼합물 (에폭시 수지 20 g, 경화제 20 g, 0.6 g 촉진제 및 가소제 0.4 g)의 각 성분의 적절한 양을 추가한다. 균일 한 갈색 얻을 때까지 나무 막대기 또는 플라스틱 피펫으로 저어.
- osmificated 섹션 저속 락과 RT에서 10 분 동안 PB에 3 배 씻으십시오.
- 2 분마다 등급의 에탄올을 다음과 같은 일련의 섹션 탈수 35 % 에탄올에서 2 회; 1 시간 (50)에서 각각 70, 80, 90, 및 95 % 에탄올; 100 % 에탄올에 3 배.
- dehydrati을 완료하는 데 유리 병에 섹션을 이동프로필렌 옥사이드 2 분간 섹션 3 회 배양함으로써 프로세스에.
주의 : 프로필렌 옥사이드는 높은 휘발성 및 독성 유기 용매이다. 그것은 접촉시 또는 흡입 또는 섭취하면 눈이나 피부에 심각한 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것은 2 급 발암 물질로 분류되고있다. 그것은 단지 배기 후드 및 PPE와 함께 사용되어야한다. 그것은 또한 매우 인화성이 멀리 열원에서 보관해야합니다.
주 : 프로필렌 산화물, 유기 용매 및 수지와 호환 때문에이 단계를 수행하기 전에, 섹션 신중 유리 바이알에 전달되어야한다. 이 시점에서, 섹션은 매우 약하기 때문에주의를 조작해야합니다. 섹션 4.5 대안 단계 전에 유리 바이알에 전달 될 수있다. - 주의 깊게 전송 섹션 알루미늄 컵에 하나씩, 그리고 가능한 한 많은 공기와 접촉을 피하십시오. 균일 포함 미리 혼합 발수 에폭시 수지의 부분을 상기 통기에서 밤새 배양 그들을RT에서 g 후드.
참고 :이 단계에서, 섹션은 완전히 탈수 매우 약하기 때문에주의를 조작해야합니다. - 미네랄 오일을 사용 기름칠 플라스틱 커버 슬립 함께 그리스 코팅 된 유리 슬라이드를 준비한다.
- 대부분에서 12-15 분 동안 60 ° C에서 알루미늄 컵을 배양하여 수지를 연화. 조심스럽게 유리 슬라이드의 기름을 바른 쪽의 부분을 평평하게. 기름칠 커버 슬립을 놓고 조심스럽게 남아있는 공기를 밀어 넣습니다.
- 48 시간 동안 60 ℃에서 인큐베이션 슬라이드.
참고 : 수지가 너무 열심히 될 것으로, 48 시간의 배양 시간을 초과하지하는 것이 중요합니다. - 플라스틱 커버 슬립을 제거합니다.
전송 전자 현미경을 사용하여 초박막 단면 및 관측 5. 샘플 준비
- 관심 영역을 찾기 위해 쌍안경을 사용하여 메스 약 1mm 2의 작은 사각형 조각을 잘라.
- 수지 블록의 끝 파일과 숨어 접착제adrangular 편 그 위에 (도 1C). 접착제는 적어도 1 시간 동안 또는 밤새 절편 종래 동안 건조 할 수있다.
- 을 Ultramicrotome를 사용하여, 두께 80㎛의 부분 (도 1D)에 사각형 조각을 잘라.
- 서서히 부드러운면을 가진 사다리꼴을 형성하는 수지 블록의 각각의 측면을 절단하는 날카로운 면도날을 이용하여 수직 위치에서 갑판을 Ultramicrotome의 수지 블록을 놓고.
- 수평 위치 갑판 넣고 사다리꼴의 긴 측이 하방으로 향하게 될 때까지 블록을 회전한다.
- 사각 조각의 표면을 트리밍 다이아몬드 트리밍 도구 나 유리 칼을 사용합니다. 을 Ultramicrotome은 / s 1mm에서 300 개 μm의 두께 부분을 잘라 설정한다. 수직 일 방형 부재 평행 약 1 °의 매우 작은 수평 각도를 표시하는 칼을 조정한다.
참고 :이 각도가 거의 B의 표면에 평행 한 사용자가 조직에 접근 할 수 있습니다immunolabeled 요소가 발견 될 가능성이있는 곳, 잠급니다. 다이아몬드 트리밍 도구를 사용하여 이러한 매개 변수를 사용하는 경우, 수지는 반짝이 흰색 색상을 표시합니다. 조직이 절단 될 때, 그것은 자주색 또는 녹색 색상으로 변경됩니다. - 크실렌 스쳐 용지를 흡수하는 부재로 인계 부분을 부드럽게, 80 개 μm의 두께 부분을 잘라 증류수로 채워진 보트를 구비 한 초 45 ° 다이아몬드 나이프를 사용하여 formvar 피복 니켈 슬롯 격자 또는 직렬 섹션을 수집 베어 150 메쉬 구리 그리드 (도 1E).
- 그리드 스토리지 상자에 격자를 놓습니다.
- 납 시트르산 그리드 얼룩.
- 여과 한 리드 시트 레이트 스톡 용액의 용액을 여과하고, 증류수 : 5 ml 주사기 및 1을 제조하기 위해 0.2 ㎛의 주사기 필터를 사용한다. 빛으로부터 보호.
참고 : 리드 구연산의 원액 고체 depos의 형성을 방지하기 위해 매월 신선한해야한다그. 주식 레시피의 재료 데이터 시트를 참조하십시오. 그리드 많은 계열 염색해야하는 경우가 유백색지면 또한, 희석 용액을 변경. - 상기 용액과 접촉하는 부분에, 희석 된 용액에 한 방울을 각 격자 놓는다. 3 분 동안 인큐베이션.
- 그리드를 개최 작은 핀셋을 사용하여 철저하게 증류수를 포함하는 두 개의 비커에 씻어.
- 부드럽게 흡수 종이를 사용하여 여분의 물을 제거합니다. 그리드 상자에 그리드를 저장합니다. (도 1 층 TEM) 투과 전자 현미경으로 섹션을 검사하기 전에 30 분을 기다립니다.
- 여과 한 리드 시트 레이트 스톡 용액의 용액을 여과하고, 증류수 : 5 ml 주사기 및 1을 제조하기 위해 0.2 ㎛의 주사기 필터를 사용한다. 빛으로부터 보호.
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Representative Results
이 섹션에서는 화학적으로 3 %의 아크롤레인의 혼합물을 4 % PFA로 고정 면역 염색 영장류 뇌 조직, 송신 EM 수준에서 관찰 다음 얻어진 대표적인 결과를 제시한다. 비교적 그대로 수초 이중 막 (도 2A)의 깔끔한 시각화로 나타낸 바와 같이 우리는 미세 구조의 양호한 보존을 달성했다. 미세 환경에서의 연결 요소와 더불어 시냅스 접촉이 용이하게 (도 2b)에 의해 식별 될 수있다. 디아 미노 벤지딘 (DAB)로 표지 면역 침전의 연결 요소들은 채워진 세포질 또는 axoplasm하여 EM 레벨로 인식된다. 세포막 및 세포 소기관의 외부 표면은 일반적으로 전자 밀도 침전물 (도 3)가 줄 지어있다.
이 특정 실험에서, 우리는 항체의 AGA를 사용외부 (Play 에디션) 또는 다람쥐 원숭이 글로 버스 창백 (도 3)의 내부 (GPI) 세그먼트 immunolabeled 신경 요소를 가시화하기 위해 세로토닌 운반체 (SERT) 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (하는 ChAT) 또는 티로신 하이드 록시 라 (TH)에의 inst. 이를 위해, 우리는 상세한 형태 학적 조사를 허용, 미세 구조뿐만 아니라 항원을 보존 정착 화학 물질의 조합을 사용했다. 많은 항체는 전술 한 (rongeur)로 프로토콜을 사용할 수 있지만, 우리는 약간의 차 항체 아크롤레인 고정 최적 immunolabeling 제공하지 공지되어 있기 때문에 사용자가 미리 최적 농도 시험을 실시 할 것을 추천한다. 항체 아크롤레인 고정 최적 immunolabeling을 제공하지 않는 경우 또는, 0.1 희석 - 4 %에서 2 % 글루 타르 알데히드는 PFA (rongeur)로 사용될 수있다. 그것은 많은에 대한 보존 항원과 아크롤레인 고정 뇌 조직에 상대적으로 해당 조직의 품질을 제공항체 (도 4).
마지막으로, 우리는 부적절 조작 다음 획득 EM의 현미경 사진의 전형적인 예를 제공합니다. 신뢰성있는 식별 및 표지 및 표지 된 신경 요소의 분석을 방지하는 신경 돌기의 이중 막 (도 5c, D)의 시각화에 불량한 정착 변경된 수초 결과 (도 5A, B)과 어려움. DAB 용액에 과량 배양 시간은 과도한 배경 잠재적 위양성 결과를 생성 할 수 비특이적 염색을 생성한다. 배경 또는 비특이적 염색은 때때로 (도 6A, B)의 연결 요소의 불완전 염색을 보이지만 종종 수많은 깊게 염색 신경 요소 (도 6C, D)를 위치. 차단 솔루션 세제의 사용은 크게 조직의 품질을 변경합니다. 그것은이 누락 될 수 있습니다어려운 미세 어떠한 급성 해석 렌더링 표시된 요소 (도 7a) 또는 수초 (도 7b) 및 세포막 (도 7C)의 열화에 소기관. 마지막으로 염화나트륨을 함유하는 린스 액을 사용하는 것과 osmification 프로세스 실족은 셀룰러 구조 (도 7D)를 구별하기 어려운 신뢰성이 결과를 생성한다.
그림 1 : 프로토콜의 필수 단계의 설계도. 원숭이 뇌 (A)가 냉각에 vibratome (B)와 직렬 섹션으로 절단된다. 그 다음 처리를 위해 미리 매립 관심 영역은 80 nm 두께의 섹션에 ì에 수지 블록 (C)의 선단에 배치하고 절단 한 후, 면역 및 전자 현미경,을 Ultramicrotome (D)와 기능. 초박 절편 후 리드 시트 레이트 및 투과형 전자 현미경 (F) 하에서 관찰 될 준비 염색 베어 150 메쉬 그리드 구리 또는 니켈 도금 formvar 그리드 (E)에 수집된다. 스케일 바 : 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 아크롤레인 PFA Transcardiac 관류 후 잘 보존 된 영장류 뇌 조직. 다람쥐 원숭이 (Saimiri의 sciureus)에 GPI (A) 및 Play 에디션 (B)를 보여주는 대표적인 뇌 조직의 전자 현미경 사진은 아크롤레인 PFA의 (rongeur)로하고 immunoperoxidase-미노 기법을 수행 한 후 재료를 잘 보존. 는 M축삭 (a)의 yelin 시스 (A에서 화살촉 참조) 비교적 그대로, 일반 미세 구조가 잘 및 B. 수지상 정보 (d)에 보존되어, 작은 수초 축삭 (a), 축삭 정맥류 (AV)를 쉽게 할 수있는 식별 할 수. 수지상 프로필 (d)와 (화살표 사이) 대칭 시냅스 접촉을 확립 축삭 정맥류의 예는 B에 도시된다. 스케일 바 : 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : Immunoperoxidase-미노 기술을 이용하여 다람쥐 원숭이 Play 에디션 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제에 대한 GPI Immunolabeled (하는 ChAT) 세로토닌 컨베이어 (SERT)과 티로신 하이드 록시 라 (TH)에서 섹션. 면역표시된 요소는 쉽게 전자 밀도 DAB 석출물 가득 세포질 또는 axoplasm 의해 식별 될 수있다. GPI를 채팅에 수지상 - 면역 염색은 비 표지 축삭 정맥류 (AV)로부터 (화살표 사이) 시냅스 접촉 수신 A, 표지 된 바와 같이 수지상 정보가 채워진 미세 섬유에 의해 인식된다. B의 전자 현미경 사진 axoplasm TH 대한 immunolabeled되는 비교적 그대로 수초와 GPE에있는 수초 축삭을 나타낸다. C의 예는 GPI의 축삭 정맥류가 SERT immunolabeled 대해 도시 및 덴 드라이트 (d)와 (화살표 사이) 대칭 시냅스 접촉을 설정하는 것으로한다. 이 예에서, DAB는 라인들 세포막 및 세포 소기관 (미토콘드리아와 시냅스 소포)의 외면을 침전. D에 도시 축삭 정맥류는 GPE에 관찰 및 TH 대한 immunolabeled 및 DAB의 일례를 나타내는 완전히 충전 axop 석출물시냅스 소포와 lasm는 볼 수 있지만, 묘사하기 어려운 것. 표지 정맥류 축삭을 둘러싸는 수초와 수초 축삭 (a) 및 임시 덴 드라이트 (d)에 의해 예시 된 바와 같이 미세 환경의 구성 요소를 쉽게 식별 할 수있다. 전자 현미경은 25, 26, 27에서 수정됩니다. 스케일 바 : 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 글루 타르 알데히드-PFA Transcardiac 관류 후 영장류 뇌 조직의 예. performi 후 짧은 꼬리 원숭이 원숭이 (Macaca의 fascicularis)을 Play 에디션 (A) 및 GPI (BD)의 뇌 조직의 대표 전자 현미경 사진0.2 % 글루 타르 알데히드와 NG transcardiac 관류 세로토닌 운반체 (SERT)에 대한 항체로 4 % PFA와 immunoperoxidase-미노 기술로 혼합 하였다. 도 2에서와 같이, 요소가 전자 밀도 DAB 석출물 가득 세포질 및 axoplasm 의해 식별 될 수 immunolabeled. 일반적인 미세 구조는 상대적으로 손상되고 표지 축삭 정맥류 주변 유수와 수초 축삭 (a) 및 임시 덴 드라이트 (d)와 축삭 정맥류 (AV)으로 나타내는 바와 같이도 2에 기재된 바와 같이 미세 요소가 쉽게 식별 될 수있다. 그러나, 잘 정의 원형질막 (화살촉)가 붙은 미세 구조의 불일치 품질, 비교적 손상 수초 (화살표) 참고. 스케일 바 : 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 실패 Transcardiac 관류를 다음 획득 영장류 뇌 조직의 예. 실패한 화학적 고정의 결과가 다람쥐 원숭이 GPI 여기에 도시되어 (A - B) 및 Play 에디션 (C - D)로 transcardially 0.9 % NaCl을 헹굼 액 빙냉 4 %의 혼합물로 관류 PFA와 15 % 피크르산 희석 0.1 M의 PB (PH 7.4). 뇌는 4 % PFA와 30 % 슈 크로스에서 39 ° C에서 1 시간 포스트 고정 냉각에 vibratome 60 개 μm의 두께 시상 부분으로 절단 하였다. 부적절하게 고정 뇌 조직 손상은 수초 (A와 B, 화살촉)에서뿐만 아니라, (예를위한 화살촉 표시, C 및 D) 흐린 불확정 원형질막에 의해 인식 될 수있다. 다른 신경 요소는 DIF된다ficult는 신뢰할 수없는 미세 구조의 해석을 렌더링, 식별합니다. 스케일 바 : 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 : 다람쥐 원숭이 Play 에디션 비 특정하는 ChAT Immunolabeling 예. B (화살촉) - (A)에 도시 된 바와 같이 배경 염색 또는 비특이적 immunolabeling 때때로 큰 셀룰러 요소 EM 같은 부분 염색 하에서 나타난다. 이러한 불특정 염색 면역 염색 부분의 표면에 더 자주 나타납니다. 비특이적 immunolabeling의 다른 예는 부분적으로 또는 완전히 충진 DAB 하나 매우 가까이 위치하고 작은 수초 축삭을 불러 일으키는 매우 작은 소자 자주 관측을 포함같아 같이 C와 D에 의해 입증 화살촉. 스케일 바 : 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 : 전자 현미경 용 시료 제조 후에 손상된 실족에 다람쥐 원숭이 Play 에디션 티슈. 예컨대 트리톤 X-100 세제의 사용도 0.02 %의 낮은 농도에서 차단 용액에, 실질적으로 (수지상의 세포질 (A) 또는 축삭 수초 손상에 의해 B를 미세 구조의 무결성을 바꾼다 ). 원형질막 손상 및 서술하기 어렵 기 때문에 다른 신경 요소들은 또한 서로 (C)와 구별하기 어렵다. osmification 과정은 루게릭 병이다샘플 제조에서 중요한 단계 O. 용액 (D)을 씻어 염화나트륨의 사용은 곤란 후속 분석을 렌더링 조직의 고정을 바꾼다. 스케일 바 : 800 nm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 문서에서는, 비 - 인간 영장류 및 EM 샘플 시험에 적합한 사전 매립의 면역 조직 화학 (rongeur)로하는 신뢰성 프로토콜을 제시한다. 같은 CEMOVIS 전형적인 냉동-EM은, 뇌의 미세 구조의 좋은 보존을 제공하지만, 그것은 또한 면역 조직 화학 (12)의 사용을 제한합니다. 극저온 대체 및 Tokuyaso 기술을 포함한 다른 기술, 면역 조직 화학을 매립 후 허용하지만, 이러한 기술로 인해 과정에서 필요한 추가 장치 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 12, 14, 15 스킬에 도전 할 수있다. 또한, 효율적 크라이 정 방법을 사용하기 위해, 시료 (29 기압에서 28 ~ 10㎛ 냉동 고압을 사용하는 경우, 두께 200 μm의 최대) 비교적 작아야한다. 이상적으로, 좋은 얻을 수영장류 뇌 조직의 극저온 고정과 결과, 샘플은 관심 영역의 정확한 위치를 찾는 문제를 일으키는, 조직 검사에서주의가 필요하다. 이 문제는 정위 좌표를 사용하여 우회해야합니다. 아크롤레인 이상 제안 사전 내장 기술로 화학 고정이 쉽고, 저렴한 비용, 시간, 효율적이고, 영장류 뇌 조직 샘플 준비를위한 신뢰할 수있는 방법 및 EM에 대한 immunolabeling을 제공합니다. 다음 단계에 따라, 하나는 대부분의 단백질의 immunolabeling 수 있도록 항원과 함께 잘 보존 된 미세 구조를 얻을 것이다. 그러나, EM 화학 고정은 또한 단점이 있습니다. 아크롤레인 등의 고정액 솔루션 뇌 조직의 형태 적 세부 사항을 유지하면서 먼저, 일부 형태 변화는 화학 정착 과정에서 발생 CEMOVIS 또는 극저온 대체 기술로 획득 될 수있는 것에 비해 결과를 변경하는 것이 가능하다. 둘째, 고정 과정과상당히 크기를 수정 및 극저온 고정 셀 (21), (30)에 비해 셰이프 조직의 수축을 일으키는 세포 외 유체의 대부분을 제거와 함께 세포 성분을 짜내 매립 수지에 필요한 후속 탈수. 이전에 우려 21, 30, 31, 32를 언급에도 불구하고, 그럼에도 불구하고, 알데히드 고정은 세계의 많은 실험실에서 성공적으로 사용되어 널리 신경 세포와 신경 교세포의 미세 구조 기능 연구를위한 신뢰할 수있는 방법으로 문헌에서 허용됩니다.
전술 한 방법과 비교하여, 메타 크릴 수지에 매립 극저온 고정 샘플 필요한 postembedding의 면역는 덜 민감하며, 중추 신경계 항원의 검출 한계가 14 33. 그러나, 알데히드 고정은 항원에 관해서는 한계가있다. 따라서, EM 준비를 시작하기 전에 LM 레벨에서 소정의 화학 고정 프로토콜에 대한 항체의 특이성을 시험하는 것이 중요하다. 아크롤레인 고정 뇌 조직에서 면역 조직 화학 염색의 품질은 이전에 화학 고정에 의해 생성 된 강력한 알데히드 결합을 깨는에 따라 달라집니다. 이 단계는 (- 3.5 3.3보기 단계), 수소화 붕소 나트륨 면역 전에 섹션 배양에 의해 달성 될 수있다. 이 단계를 생략하면 확실히 차선의 면역 염색 (34)을 초래할 것이다. 4 % PFA로 희석 - (2 0.1 %) 아크롤레인 항체가 고정 뇌 부분에 최적 염색을주지 않는다 사용되는 경우, 다르게는 글루 타르 알데히드를 사용하는 것이 가능하다. 이것은 충분히 많은 항체에 대한 항원 성을 유지하면서 뇌의 미세 구조를 잘 보존하고 뇌 조직을 제공하기 위해 입증되었습니다최소 변형 20, 21, 35, 36, 37과 장기 보존에 적합. 현저 용액의 pH가 상승하여 단독 PFA와 EM 적합한 비교적 양호한 정착 및 항원 성을 달성하는 것도 가능하지만, 재관류 동안 하나 개 이상의 고정 제의 조합이 더 나은 결과 (34)를 구비하고 있으며, 연구는 일반적으로 혼자 PFA 정착을 지원할 EM 검사 (38), (39)에 대한 제대로 보존 된 조직을 생산하고 있습니다. 그러나 일부 드문 경우에, 항원 성을 유지하기가 매우 어렵고, 혼자 PFA 고정은 EM 시험을위한 유일한 실행 가능한 옵션이 남아있다.
이 프로토콜의 많은 단계는 최적의 결과를 얻기 위해주의 깊게 따라야합니다. 예를 들어, 4 % PFA 용액의 제조PFA 분말을 용해 할 수 있도록하기 위해 45 ℃ 이상의 온도에서 수행하지만, 온도가 60 ℃ 미만으로 유지하는 것이 필수적이다되어야한다. 그렇지 않으면, PFA 용액을 포름 알데히드 및 다른 조직을 해결 크게 조직의 품질 (40), (41)를 변경할 수있는 산성 용액을 형성하고, 포름산으로 해중합. 또한, 다이어프램이 절단 된 후 저산소증과 탄산 혈증은 조직 (31)의 품질과 무결성을 변경할 수있는 뇌에 돌이킬 수없는 생리적 변화를 생산하기 때문에 관류 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. 결함이 고정은 뇌 조직의 보존에 유해하고 영구적으로 세포막, 미토콘드리아와 시냅스와 같은 조직의 미세 구조를 변경할 수 있습니다. 따라서, 솔루션 준비 및 관류 단계를주의하여 수행해야합니다. 성공적인 EM 샘플 혼합물 준비N은 높은 산화 오스뮴에서 좋은 후 고정에 따라 달라집니다. 실제로 산화 오스뮴 직접 관류 EM 관측 21, 39 합리적 그대로 티슈 제조 같이 설명되었다. 그러나, 세포 외 공간의 크기 및 오스뮴 관류 및 알데히드 관류 동물의 세포막의 모양면에서 많은 차이가 발견되었다. 또한, 오스뮴 재관류 후의 조직의 흑화 경화 더 조직을 보존하고 쉬운 조작 (21) 알데히드 관류 선호 두개골 후속 박리, 백색과 회색 물질의 분화 어려워로부터 뇌를 제거 렌더링. 알데히드 고정 혼자 이렇게 보여 실패, 조직의 무결성을 변경하고 세포 외 공간을 볼 수 있어야 꽉 접합의 느낌을주는 세포 외 공간을 줄이기 위해 나타납니다심지어 납 시트르산 42 염색 후 전자 현미경으로 허용. 주의 - 그러나, 산화 오스뮴의 postfixation 따라서 명확 osmification 단계를 수행의 중요성을 정당화 그들의 식별 (42)에 필요한 조직 요소 사이의 가장 확실한 분리를 허용함으로써 이러한 상황을 반전 (4.2 4.1 단계).
이러한 단계가 수행되는 조건과 농도는 특히 영장류 뇌 부에 침전물로서 DAB를 사용하여 면역 조직 화학 염색을 미리 매립 위해, 우리 실험실에서 시험되었다. 스킬 도전 이중 면역 통해 가능하지만 골드 면역 43 입자 후 매립. 그것이 나오는 플라즈마 세포막을 설명하기 때문에 전자 밀도 DAB, 여기에 제안 immunoperoxidase - 디아 미노의 기술은 EM 수준에서 파악하는 것은 매우 쉽습니다 후 침전물소기관의 ER 표면 아직도 시냅스 미토콘드리아 및 연락처와 같은 서브 세포 성분의 확인을 허용하면서. 본 기술은 단일 면역에 대한 마스터되면 또한, DAB는보다 쉽게 다양한 크기의 금 입자보다 서로로부터 식별되는 금 입자로 석출 결합하여 이중 면역을 수행 할 수있다. 우리는 EM에 대한 뇌의 부분을 처리하기 전에 항체 특이성, 오스뮴 농도 및 배양 시간 및 온도의 엄격한 테스트를하고 추천 할 것입니다. 미리 삽입 및 EM에 대한 이중 면역 조직 화학에 대한 프로토콜 이전에 출판되었으며, 영장류 뇌 조직 (16)에 대해 적용 할 수 있습니다.
결론적으로, 위에서 제시된 인간이 아닌 영장류에 대한 (rongeur)로 프로토콜이어서 EM에 미리 매립 면역 사용될 수 뇌 부분의 장기 저장을 허용한다. SECTIO수득 NS 또한 LM 레벨의 해부학 적 연구에 적합하다. 따라서, EM 및 LM 모두에 적합한 프로토콜을 사용함으로써, 사용하는 동물의 수, 비용 효율, 윤리적 고려 사항을 감소시킬 수있다. 또한, 동일 동물의 LM에서 얻어진 결과와 EM 수준 사이의 직접적인 비교를 허용하고 상호 광학 및 전자 현미경 (클레멘 타인) 연구의 사용을 허용한다. 클레멘 타인의 연구는 주로 후에 EM 레벨 44에서의 전자 밀도 침전물 표지 관찰 될 수있는 그러한 EGFP 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 마우스의 사용에 초점을 맞추고있다. 대안 적으로, 예를 들면 EM 레벨 46에서 시각화를 허용 양자점 45 전에 동결로로 전자 밀도 마커의 intraneuronal 주입과 결합 될 수 면역, 극저온 고정의 문제를 회피한다. 그러나 양자점은 생체 적합성이 아니며,이들의 사용으로 인해 후속 티슈 제조에 필요한 추가 냉동 장치에 비용과 시간이 걸린다. 이러한 기술은 여전히 극저온 고정 선호 및 방법 - 치환 동결 있지만, EM 분석 (47)와 관련 될 수있는 합성 형광체와 다른 세포 단백질 라벨을 세미 박막 (300 ㎚) 부분에 화학적 태그의 사용을위한 몇몇 개발이있다 . 예를 들어, 허용 기술은 하나의 형광을 사용하여 특정 축삭 제이션 및 EM을 이용하여 주어진 타겟 구조의 뉴런의 시냅스 관계 사이의 관계는, 특히 영장류, 신경계 조직의 이해 오히려 유망하다. 후자는 LM 레벨 뇌 구조의 적절한 시각화를 변경할 수있는 형광도를 생성한다이 경우, 아크롤레인 고정술, 글루 타르 통해 선호한다. 그러나, 이러한 유형의 거의 연구는 영장류에서 수행되었습니다 mostly 기술적 인 문제와 같은 실험이 부과 높은 비용으로 인해. 따라서, 새로운 개발은 이러한 고정 방법을 개선하거나 LM 및 EM 수준 모두에서 볼 화학 태그를 사용하여 같은 영장류에 성공 저렴한 클레멘 타인 연구 필요합니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
본 연구는 자연 과학 및 (MP에 NSERC, 401848-2011) 캐나다의 공학 연구위원회에 의해 지원되었다. MP는 퐁 드 공들인 퀘벡 - 상테 (FRQ-S)에서 경력 상을 받았다. LE는 FRQ-S (FRQ-S 29,441 14D) 박사로부터 수신자의 교제이었다. 우리는 기술 지원을 마리 Josée Wallman 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
| Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
| Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
| Acrolein (90%) | Sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
| Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
| Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
| Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18 G 11/2 |
| Needle | terumo | NN-2713R | 21 G 1/2 |
| Ketamine | 20 mg/kg | ||
| Xylazine | 4 mg/kg | ||
| Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
| Scalpel | |||
| Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
| Surgical scissors | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
| Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
| Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | S-9125 | |
| Normal horse serum (NHS) | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
| Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
| Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
| Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
| Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1,000 dilution |
| Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
| Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0.005% dilution |
| Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 |
Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
| Durcupan water-repellent epoxy resin | Sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) |
Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste. |
| Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
| Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
| Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
| Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
| Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
| Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
| Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
| Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
| Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
| grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
| Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
| Lead nitrate | Sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
| Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
| Syringe filter | Corning | 431222 | 0.2 µm |
| Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
| Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 |
References
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