Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Utarbeidelse av ikke-menneskelige primater hjernevev for Pre-embedding Immunohistokjemi og elektronmikroskopi

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55397
Automatic Translation
1,2, 1
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Summary

Her gir vi en enkel, billig, og tidsbesparende protokoll for kjemisk å feste primat hjernevev med acrolein fiksativ, slik at for langtidskonservering som er kompatibel med forhånds innleiring immunhistokjemi for transmisjonselektronmikroskopi.

Abstract

Til tross for alle de teknologiske fremskritt ved lysmikroskopi nivå, forblir elektronmikroskopi den eneste verktøy i nevro for å undersøke og karakterisere ultra og morfologiske detaljer av nerveceller, slik som synaptiske kontakter. God bevaring av hjernevev for elektronmikroskopi kan oppnås ved rigorøse kryo-fikseringsmetoder, men disse teknikkene er ganske kostbare og begrenser bruken av immunmerking, som er avgjørende for å forstå tilkobling av identifiserte neuronale systemer. Fryse-substitusjonsmetoder er blitt utviklet for å tillate kombinasjonen av cryo-fiksering med immunmerking. Men reproduserbarhet av disse metodiske tilnærminger avhengig vanligvis på kostbare frysing enheter. Videre oppnå pålitelige resultater med denne teknikken er svært tidkrevende og dyktighet-utfordrende. Derfor er den tradisjonelle kjemisk faste hjernen, spesielt med akrolein fikseringsmiddel, forblir en tidsbesparende og rimelig metode for å kombinere elektronmikroskopi med immunhistokjemi. Her gir vi en pålitelig eksperimentelle protokoll ved anvendelse av kjemisk akrolein fiksering som fører til bevaring av primat vev i hjernen og er kompatibel med pre-innstøping immunhistokjemi og transmisjonselektronmikroskopisk undersøkelse.

Introduction

Lysmikroskopering inklusive konfokal og to-foton mikroskopi, har vist seg å være et effektivt verktøy for å studere in vivo nerveprosesser, blant annet 1, 2. Selv om typiske romlig oppløsning ved lysmikroskopi (LM) nivå er tilnærmet 200 nm, de siste teknologiske fremskritt ved hjelp av ulike lyskilder, for eksempel ekstrem ultrafiolett og bløtt røntgenmikroskopi, har spesielt økt denne oppløsning til en nesten 10 nm romlig oppløsning 3 , 4, 5. Andre teknologiske fremskritt innen avbildning innbefatter felles magnetisk resonans imaging med histologi og tilveiebringe en ny fremgangsmåte for å måle tykkelsen på myelinlaget in vivo, en parameter som tradisjonelt var målbar bare ved elektronmikros (EM) nivå 6, 7. although disse fremskrittene på LM-nivå gir et utmerket verktøy for å studere levende prosesser, et detaljriss og karakterisering av strukturer, slik som synaptiske kontakter, kan bare oppnås med EM, som gir en oppløsning som kan nå 0,5 nm. Imidlertid observasjon ved EM nivå krever prøvene å være død og endres på mange måter, med fiksativer kjemiske og dehydrering prosesser, for å bevare den cytoarchitecture. Således undersøke biologiske prøver med høy oppløsning som kan være vanskelig på grunn av stråleskader fra elektronstrålen, lav kontrast, strukturelle avvik av membraner, eller til og med tilstedeværelse av gjenstander som kan forekomme etter dehydrering og epoksy innstøping 8, 9, 10.

Bevaring prøver i sin native form for strukturell analyse kan oppnås ved å bruke "Cryo EM av forglasset §§" eller CEMOVIS, en snitte tilnærming sominnebærer hurtig nedfrysing og innstøping av prøven i glasslegemet is og undersøkelse av seksjonene under EM ved en kryogen temperatur 11, 12. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for undersøkelse av prøver, mens de fremdeles er fast og fullstendig hydrert, og dermed eliminere artifakter forårsaket av dehydrering prosesser 13. Imidlertid innebærer denne metoden flere enheter for kryo-ultramicrotomy, samt tilleggsenheter på standard EM, for å tillate denne observasjon ved meget lave temperaturer, noe som skaper betydelige tilleggskostnader. I tillegg utelukker CEMOVIS tilnærming ved bruk av immunmerking teknikker, ettersom antistoffer må vanligvis inkubert ved RT. Alternativt er det mulig å kombinere ultra analyse med immunohistokjemiske prosedyrer ved anvendelse av en fryse-substitusjon tilnærming, der Cryo-fikserte prøver blir langsomt opptint mens immerged i cryo-beskyttende kjemikalier og er then innebygd i spesialiserte harpikser, såsom Lowicryls. Post-embedding immunmerking kan da utføres på slikt materiale 12. Imidlertid fryse-substitusjon og kryo-fikseringsteknikker er arbeidskrevende. De krever installasjon av tilleggsutstyr og krever fortsatt prøver som skal eksponeres for organisk løsningsmiddel og kjemisk fikseringsmiddel som kan endre den cytoarchitecture, til tross for bruk av en lav temperatur 14, 15. Derfor, til tross for alle de teknologiske fremskritt både på LM og EM nivå, kjemisk fiksering av hjernevev, spesielt med akrolein, forblir en lav kostnad og tidsbesparende metode for å kombinere immunohistokjemi med EM-16.

I de siste tiårene, ble mange forsøk gjort for å finne en blanding av aldehyder som gir best vev bevaring. Før 1960-tallet, den eneste kjemiske fiksativ som ga akseptable resultater for EM var osmiumtetroksidet. Imidlertid er osmiumtetroksyd svært giftig og kostbart, hvilket utelukker bruken gjennom det vaskulære system til å feste organer som hjernen. Akrolein ble introdusert i 1950 som en pålitelig metode for animalsk vev konservering egnet for EM observasjon av cellestrukturer 17. Den trenger inn i vevet dypere og reagerer raskere enn andre aldehyder når det brukes for fiksering ved nedsenkning og tillater god bevaring av cytoplasmiske bestanddeler, med minimal krymping av vevet 17. Et slikt trekk gir akrolein fiksering en klar fordel sammenlignet med andre aldehyder når det brukes i frisk vev, ved å tillate en mer nøyaktig lokalisering av levende molekylære forbindelser, slik som enzymer og andre proteiner 18. Faktisk har det blitt bekreftet gjennom årene som en enkel, effektiv og rimelig metode for fiksering for visualisering ved EM nivå i mange arter, inkludert amfibier og gnagere, som det effektivt stabiliseringzes peptider og proteiner, bibeholder antigenisitet og gir forholdsvis intakt ultrastruktur når de anvendes i kombinasjon med et annet aldehyd fikseringsmiddel 16, 18, 19, 20, 21. Protokoller for akrolein fiksering i gnagere har siden da blitt standardisert og brukt i stor utstrekning, spesielt ved Pickel gruppe, for å implementere dobbeltimmunmerking for EM-16, 22. Noen grupper har anvendt acrolein fiksering i ikke-menneskelige primater hjernevev 23. Men til vår kunnskap, er det bare én publisert protokoll effektivt beskriver kjemisk fiksering med acrolein i ikke-menneskelige primater som er kompatibel med EM immunmerking 24.

I denne artikkelen gir vi en enkel og pålitelig metode for å effektivt kjemisk fikse non-humen primat-hjerne med akrolein, slik at for en potensielt langvarig konservering sammen med pre-immunmerking innebygging og overføring EM-undersøkelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle protokoller som involverer dyr ble godkjent av Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval og ble gjort i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care Guide til omsorg og bruk av forsøksdyr (Ed 2.). Protokollen er beskrevet her ble optimalisert for voksne dyr på ca 800 g. Volumene av fikseringsmiddel bør justeres i forhold til dyrets størrelse.

1. Fremstilling av oppløsninger for transkardiakperfusjon

  1. Fremstill en l av en 50 mM natriumfosfat-bufret saltoppløsning (PBS) løsning i henhold til de følgende trinn. Fremstill løsningen høyst 24 timer før perfusjon og holde ved 4 ° C inntil bruk.
    1. Mål 800 ml destillert vann i en 1-liters begerglass. Legg 5,87 g dibasisk vannfritt natriumfosfat (Na 2HPO 4), 1,20 g monobasisk natriumfosfat-monohydrat (NaH 2PO 4-H 2O), og 9 gav natriumklorid (NaCl). Rør for å oppløse.
    2. Juster pH til 7,4 ved gradvis tilsetning av 5 N NaOH. Destillert vann for å oppnå et totalt volum på 1 L.
      ADVARSEL: NaOH er en etsende kjemisk forbindelse. Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE;. Laboratorium frakk, hansker, vernebriller, etc).
  2. Fremstille 2 l av 4% paraformaldehyd (PFA) i henhold til følgende trinn. Denne løsningen bør være forberedt på høyst 24 timer før kirurgi og holdt ved 4 ° C inntil bruk.
    1. Mål 1,5 liter destillert vann i et 2-liters begerglass. Legg 23,48 g dibasisk vannfritt natriumfosfat (Na 2HPO 4) og 4,80 g av monobasisk natriumfosfat-monohydrat (NaH 2PO 4-H 2O). Rør for å oppløse. Destillert vann for å oppnå et samlet volum på 2 L.
    2. Oppvarm løsningen under luftehette inntil temperaturen når ca. 45 - 55 ° C. Ikke varm til over 60 ° C.
    3. Tilsett 80 g av PFA til oppløsningen og omrørt inntil fullstendig oppløsning (ca. 30 - 60 min). Hold å overvåke temperaturen for å holde den under 60 ° C.
      ADVARSEL: PFA er svært ustabilt i sin pulverform. Det er meget giftig ved kontakt med øyne eller hud, og er farlig ved inhalering eller inntak. Bruk PPE og bruke med forsiktighet under lufting hette.
    4. Avkjøl oppløsningen ned til 4 ° C og filtrer. Oppbevar ved 4 ° C.
  3. Fremstill en L av 3% akrolein i 0,1 M fosfatbuffer (PB) i henhold til følgende trinn. PB Løsningen bør være forberedt på høyst 24 timer før perfusjon.
    ADVARSEL: Acrolein er meget giftig ved innånding og kan produsere umiddelbar skade. Det er også korrosive og meget giftig ved absorberes gjennom huden. Det er kreftfremkallende og mutagene. Bruke egnet verneutstyr og bruk under lufting hette.
    1. Mål 800 ml destillert vann. Legg 8,66 g dibasisk vannfritt natriumfosfat (Na 2 4) og 5,38 g av monobasisk natriumfosfat-monohydrat (NaH 2PO 4-H 2O). Rør inntil alle saltene oppløses. Destillert vann for å oppnå et totalt volum på 1 L. La løsningen stå ved 4 ° C.
    2. Før kirurgi, overfører 900 ml av den PB-løsning til en 1 liters glassbeholder og tilsett 30,94 ml av 97% akrolein løsning under lufting hette. Legg PB løsning for å nå et totalt volum på 1 L og rør. Filtrer løsningen og oppbevares ved 4 ° C.

2. transkardiakperfusjon og Brain Dissection

  1. Hold løsninger på is under hele kirurgiske prosedyren. Forbered pumpen ved å plassere røret i den første løsning som skal brukes (PBS; 50 mM) og slå pumpen på inntil ingen luft igjen i slangen. For transkardiakperfusjon av en makakerape, bruke en 21 G nål og sette strøm på ca 80 ml / min.
  2. Bedøve dyret med en intramuskulær injeksjon av en blandingture av ketamin (20 mg / kg), xylazin (4 mg / kg) og acepromazin (0,5 mg / kg). Oppretthold henhold isofluran (3%) sedasjon.
  3. Fest dyrets lemmer til lufting bord.
  4. Med en skalpell, fjerne hud opp til armhulene. Skjær magemusklene. Bruk heavy-duty kirurgiske saks for å klippe ribbene lateralt ved forsiktig å unngå de vitale organene.
  5. Skjær membranen med kirurgiske sakser og løfte brystkassen for å blottlegge hjertet. Når membranen er kuttet, gå raskt, siden hjerte vil slutte å slå i løpet av minutter.
  6. Fjern pericardium med et skalpellblad, og sette nålen inn i den venstre ventrikkel. Med en skalpell, nøye lage en liten beskjæring til høyre atrium. Raskt å starte pumpen ved 72 ml / min og holde nålen på plass. Hvis det er mulig å vippe dyret for å få sitt hode på et lavere nivå enn hjertet.
    MERK: Vær forsiktig med å pierce interventricular septum når du setter nålen.
    1. Rinse blodet med ca 300 ml PBS inntil lungene er hvite og ingen blod kommer ut av høyre atrium.
  7. Stoppe pumpen, raskt overføre slangen / røret til 3% akrolein løsning, og starte pumpen igjen. Gradvis øke pumpehastigheten til 80 ml / min når hjertet har sluttet å slå. Perfuse omtrent 500 ml av akrolein løsning.
  8. Stoppe pumpen, raskt overføre slangen til 4% PFA løsning, og start pumpen på nytt. Dette trinn krever omtrent 1 liter av PFA.
    MERK: fiksering er fullført når forlemmene er stive og halsen er stiv.
  9. Kutt hodet og nøye dissekere hjernen ut av skallen. Vær nøye med å ikke skade hjernen med kirurgiske instrumenter. Perfusjonen er optimalt når hjernen er blek (ingen spor av blod) og stiv (figur 1A).
  10. Dyppe den intakte hjerne i 4% PFA i 1 time ved 4 ° C.
  11. Serielt kuttet hjernen med et kjøle vibratome (4 ° C)i det ønskede plan i 50 um tykke snitt og samle dem i PBS (0,1 M) (figur 1B).
    MERK: Dette trinnet kan utføres på mange måter i henhold til ønsket protokoll. Halvkuler kan separeres før vibratome skjæring, eller oppbevares hel. Hvis hjernen er for stor for vibratome plattform, kan det kuttes i mindre blokker. Etter dette trinnet, kan seksjoner lagres i en lang periode ved -30 ° C i en frostvæske løsning laget av 40% PB (50 mM), 30% glycerol, og 30% etylenglykol.

3. Pre-innstøping Immunhistokjemi (figur 1C)

  1. Fremstill en 4 liter stamløsning av Tris-bufret saltoppløsning (TBS, 50 mM, pH 7,6) som følger.
    1. Mål 2 l destillert vann i et 4-liters begerglass, tilsett 24,23 g trihydroxymethyl aminometan (THAM-C 4 H 11 NO 3), og rør for å oppløse.
    2. Juster pH til 7,6 med ca. 148 ml 1 N HCl. Syren bør tilsettes med cautividere for å unngå å nå en pH-verdi under 7,6. Totalvolumet bør være 4 L.
      ADVARSEL: HCl er sterkt korrosiv. Bruke egnet verneutstyr.
  2. Velg deler (fra trinn 2.11) som inneholdt regionen av interesse å bli behandlet for EM immunhistokjemi.
  3. Vask de frittflytende seksjoner 3 x i PBS (0,1 M, pH 7,4) i 5 minutter ved RT for å skylle frostvæsken.
  4. Fremstill en 0,5% løsning av NaBH4 fortynnet i PBS.
    1. Veie 0,05 g av NaBH4 og fortynne den i 10 ml PBS. Ikke tildekk. Forbered denne løsningen like før bruk.
  5. Inkuber delene i nyfremstilt NaBH4-løsning i 30 minutter ved RT. Rock forsiktig. Ikke tildekk.
  6. Vask 3 x i PBS i 10 min ved RT, gynge kraftig inntil ingen av reaksjonsgassen forblir.
  7. Fremstill en blokkerende oppløsning for EM med 2% passende normalt serum og 0,5% kald fiskegelatin fortynnet i PBS.
    MERK: Mengden should beregnes for å få nok for de følgende tre trinn. Bruke et serum fremstilt fra samme dyreart verts det sekundære antistoff. Unngå bruk av antigen-gjenfinningsmetoder eller tilsetning av små mengder av triton (for å øke penetreringen av antistoffer), da disse fremgangsmåter vesentlig redusere kvaliteten av vevet.
  8. Inkuber seksjonene i den blokkerende oppløsning i 1 time ved RT. Rock forsiktig.
  9. Fremstill primær antistoffoppløsning fortynnet i blokkeringsoppløsningen.
    MERK: Konsentrasjonen av det primære antistoff er vanligvis den samme som for LM immunhistokjemi, men anser å gjennomføre tester med forskjellige antistoffkonsentrasjoner på forhånd, som noen primære antistoffer ikke kan fungere med akrolein. I så fall er det mulig å bruke en blanding av glutaraldehyd (0,1 til 2%) og 4% PFA for transkardiakperfusjon og oppnå lignende resultater. Optimaliser inkubasjonstid og temperatur, så vel.
  10. Inkuber delene i primær antistoffoppløsningnatten ved RT med milde rocking. Bruke et tidligere prøvet inkubasjonstid og temperatur.
  11. Vask seksjonene 3 x i PBS i 5 minutter ved romtemperatur med forsiktig vugging.
  12. Fremstill en 1: 1000 løsning av biotinylert sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsoppløsningen.
    MERK: Det sekundære antistoffet må heves mot vertsarten som benyttes for å danne den primære antistoff.
  13. Inkuber delene i sekundært antistoff oppløsning i 1,5 timer ved RT. Rock forsiktig.
  14. Fremstill et avidin-biotin-peroksidase (ABC) oppløsning i minst 60 minutter før slutten av det sekundære antistoff inkubasjon.
    1. Bruke en kalibrert pipette for å måle 8,80 ul / ml av oppløsningene A og B og fortynne dem i PBS.
    2. Rock mildt i minst 60 minutter ved romtemperatur for å gi den komplette bindingen mellom avidin og biotin-molekylene.
  15. Etter inkubering i sekundære antistoff-løsning, vaskes 3 ganger i PBS i 10 min ved RT.
  16. Inkuber seksjonene i ABC såfortynningssonen i 1 time ved RT. Rock forsiktig.
  17. Vask en gang i PBS og to ganger i TBS i 10 minutter ved romtemperatur med forsiktig vugging.
  18. Fremstill en frisk oppløsning av 0,05% 3,3'-diaminobenzidin (DAB) med 0,005% H 2 O 2 fortynnet i TBS.
    1. Veie 12,5 mg DAB og fortynne den i 25 ml kald TBS. Beskytt mot lys.
      FORSIKTIG: DAB pulver er svært flyktig og skadelig ved innånding. Det er kreftfremkallende og teratogen. Derfor bør gravide eller ammende kvinner ikke manipulere dette produktet, selv når utvannet. Bruk en N95 maske når manipulere og slitasje PPE.
    2. Filtrer løsningen og tilsett 4,5 mL av 30% H 2O 2 like før bruk.
  19. Inkuber seksjoner i DAB-løsning for 3 til 7 minutter ved RT. Rock forsiktig.
    MERK: Den brune bunnfallet bør ikke være for mørkt for å unngå et høyt nivå av bakgrunnsfarging. Inkubasjonstiden bør optimaliseres tilsvarende.
  20. Stopp reaksjonen ved raskt å vaske to gangeri kaldt TBS, og deretter to ganger i 10 minutter i kaldt TBS ved romtemperatur, etterfulgt av to ganger i 10 minutter i PB, med svak vugging.
    MERK: Bruken av PB (og ikke PBS) er kritisk for å eliminere eventuelle spor av NaCl, som det vil reagere med osmium og formkrystaller.

4. Osmification og Inkludering for Electron Mikroskopisk observasjon

  1. Fremstill en løsning av 1% osmium tetroksyd (OSO4) fortynnet i PB. Beskytt mot lys.
    FORSIKTIG: Osmium er svært giftig, og bør ikke komme i kontakt med hud, øyne eller munn og ikke bør innåndes. Det kan føre til døden ved svelging. Det bør kun brukes under en lufting hette og med riktig PPE.
  2. Inkuber delene i OSO4 løsningen i 30 minutter ved RT under ventileringshetten (uten omrøring) og dekke dem med aluminiumsfolie for å beskytte dem mot lys. Fullstendig flate delene før tilsetning av OSO4 løsning.
    MERK: Seksjonene blir veldig mørkt og rigid og bør være manipulert med forsiktighet etter dette trinnet.
  3. Forbered vannavstøtende epoksyharpiks under osmification.
    1. Legg passende mengder av hver komponent i epoxy-harpiks-blanding (20 g epoksyharpiks, 20 g av herdemiddel, 0,6 g av akselerator og 0,4 g av mykner) til en stor plastkopp. Rør med en trepinne eller plastpipette inntil en homogen brun farge erholdes.
      MERK: Det er viktig å bruke den eksakte andelen av hver komponent.
    2. Overfør like mengder av aluminium kopper passende størrelse, avhengig av antall seksjoner som skal behandles. La den hvile.
  4. Vask osmificated seksjonene 3 x i PB i 10 min ved RT med lav hastighet vugging.
  5. Dehydrere delene i den følgende serie av gradert etanol i 2 minutter hver: 2 ganger i 35% etanol; En gang hver i 50, 70, 80, 90, og 95% etanol; og 3x i 100% etanol.
  6. Overfør seksjonene til glassampuller for å fullføre dehydratividere prosessen ved å inkubere seksjonene 3 ganger i 2 min i propylenoksyd.
    ADVARSEL: Propylenoksyd er et meget flyktig og toksisk organisk oppløsningsmiddel. Det kan forårsake alvorlig skade på øynene eller huden i tilfelle kontakt eller ved innånding eller svelging. Det har blitt klassifisert som et klasse 2 kreftfremkallende stoff. Det bør kun brukes under luftehette og med PPE. Det er også meget brannfarlig og bør holdes unna varmekilder.
    MERK: Før dette trinn, bør seksjonene være forsiktig overført i glassflasker, ettersom propylenoksyd er et organisk oppløsningsmiddel og er uforenlig med plast. På dette punktet, delene er svært skjøre og bør manipulert med forsiktighet. Seksjonene kan alternativt overføres til glassampuller før trinn 4.5.
  7. Overføringsseksjoner nøye, en etter en, i aluminiumkopper og unngå kontakt med luft så mye som mulig. Flat-bygge delene i tidligere blandet vannavstøtende epoksyharpiks og inkuber dem over natten under Venting hette ved RT.
    MERK: På dette trinnet, delene er helt dehydrert og veldig skjøre og bør manipulert med forsiktighet.
  8. Ved bruk av mineralolje, fremstille fett-belagte objektglass sammen med smurte plastdekkglass.
  9. Mykne harpiksen ved inkubering av aluminium kopper ved 60 ° C i 12-15 minutter ved de fleste. Nøye flate seksjonene på smurt siden av glasset lysbilde. Plasser smurt dekk og nøye presse ut gjenværende luft.
  10. Inkuber objektglass ved 60 ° C i 48 timer.
    MERK: Det er viktig å ikke overstige 48 timers inkubasjonstid, som plast blir for hardt.
  11. Fjern plastdekkglass.

5. Prøvepreparering for supertynn Seksjonering and Observation Ved hjelp av en transmisjonselektronmikroskopi

  1. Bruk kikkert for å finne det aktuelle området og skjær et lite firkantet stykke på ca 1 mm 2 med en skalpell.
  2. Fil spissen av en harpiksblokk og lime quadrangular stykket på den (figur 1C). La limet tørke i minst 1 time eller over natt før seksjonering.
  3. Ved hjelp av en ultramikrotom, kutt firkantet stykke inn i 80 um tykke seksjoner (figur 1D).
    1. Plasser harpiksen blokk i et ultramikrotom dekk i vertikal stilling og, ved hjelp av et skarpt barberblad, gradvis skjære hver side av harpiksblokken for å danne et trapes med glatte sider.
    2. Sett dekket i horisontal stilling og rotere blokken inntil den lengste siden av trapesens vender nedover.
    3. Bruk en diamant trimming verktøy eller et glass kniv til å trimme overflaten av firkantet stykke. Still ultramikrotom å kutte 300 um tykke seksjoner ved 1 mm / s. Kniven stilles vertikalt parallelt med firkantet stykke, og for å vise en meget liten horisontal vinkel på omkring 1 °.
      MERK: Denne vinkel vil tillate brukeren å ta tak i vev nesten parallelt med overflaten av blåse, hvor immunolabeled elementer er mer sannsynlig å bli funnet. Ved bruk av disse parametre ved hjelp av diamantverktøyet trimming, viser at harpiksen en skinnende hvit farge. Når vevet blir kuttet, endres den til en lilla eller grønnaktig farge.
    4. Bruke en ultra 45 ° diamantkniv utstyrt med en båt fylt med destillert vann for å kutte 80 um tykke seksjoner, glatte seksjoner ved å passere over dem med et stykke absorberende papir tippet i xylen, og samler seriesnitt på Formvar-belagt nikkel spor gittere eller bare 150 mesh kobbernett (figur 1E).
  4. Plasser nett i et rutenett oppbevaringsboks.
  5. Flekk mellom gitrene og bly-citrat.
    1. Bruke en 5 ml sprøyte og en 0,2 um sprøytefilter for å fremstille en 1: 1 oppløsning av filtrert bly-citrat stamløsning og filtrert destillert vann. Beskytt mot lys.
      MERK: stamløsning av bly citrate bør gjøres fersk hver måned for å unngå dannelse av faste deposdet er. Se materialet dokument for aksjen oppskriften. I tillegg, hvis mange serier av tavler må være farget, endrer den fortynnede oppløsningen når den blir melkeaktig.
    2. Plasser hvert gitter på en dråpe av den fortynnede oppløsning, sammen med den delen i kontakt med oppløsningen. Inkuber i 3 min.
    3. Bruke små pinsett for å holde gitteret, og skylle den i to begerglass inneholdende destillert vann.
    4. Fjerne overflødig vann ved forsiktig anvendelse av absorberende papir. Oppbevar nett i et rutenett boks. Vent i 30 min før undersøkelse av seksjonene ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM, figur 1F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne delen presenterer vi representative resultater som ble oppnådd etter den observasjon, i sende EM-nivå, av immunfarget primat hjernevev kjemisk fiksert med en blanding av 3% akrolein og 4% PFA. Vi oppnådde god bevaring av ultrastruktur, som angitt ved den forholdsvis intakt myelinlaget og ryddig visualisering av doble membraner (figur 2A). Synaptiske kontakter, sammen med neuronale elementer fra mikromiljøet, kan lett bli identifisert (figur 2B). Neuronal elementer merket med diaminobenzidin (DAB) immunopresipitat føres opp til EM-nivå ved deres fylt cytoplasma eller axoplasm. Plasmamembranen og den ytre overflate av organeller blir også typisk foret med den elektron-tette bunnfall (figur 3).

I dette spesielle forsøket brukte vi antistoffer against serotonintransportøren (SERT), cholin acetyltransferase (ChAT), eller tyrosinhydroksylase (TH) for å visualisere immunolabeled neuronale elementer i den ytre (GPe) eller internt (GPI) segment av globus pallidus ekorn ape (figur 3). For å gjøre dette, brukte vi en kombinasjon av festing kjemikalier som bevarer antigenisitet samt ultra, slik at en detaljert morfologisk undersøkelse. Selv om mange antistoffer kan brukes sammen med den transkardiakperfusjon protokollen beskrevet ovenfor, anbefales det at brukerne utføre optimalisering konsentrasjonstester på forhånd, siden noen primære antistoffer er kjent for å ikke gi optimal immunmerking med akrolein fiksering. Alternativt, når antistoffer ikke gir optimal immunmerking med acrolein fiksering, en fortynning på 0,1 til 2% glutaraldehyd i 4% PFA kan brukes for transkardiakperfusjon. Den gir vev kvalitet forholdsvis tilsvarende acrolein-fiksert hjernevev med bevart antigenisitet for mangeantistoffer (Figur 4).

Til slutt gir vi typiske eksempler på EM photomicrographs innhentet følgende upassende manipulasjoner. En dårlig fikseringen resulterer i endrede myelinarkene (figur 5A, B) og vanskeligheter i visualisering av de doble membraner av nevritter (Figur 5C-D), som hindrer en pålitelig identifisering og analyse av merkede og umerkede neuronale elementer. En overdreven inkubasjonstid i DAB-løsning skaper overdreven bakgrunn og ikke-spesifikk farging som potensielt kan gi falske positive resultater. Bakgrunn eller ikke-spesifikk farging vises noen ganger som ufullstendig farging av neuronale elementer (figur 6A, B), men oftere så tallrike og tett plassert farget neuronale elementer (figur 6C, D). Anvendelse av detergent i blokkeringsoppløsningen vesentlig endrer den kvalitet av vevet. Det kan føre til manglendeorganeller i merkede elementer (figur 7A) eller nedbrytning av myelin-kapper (figur 7B) og cellulære membraner (figur 7C), til å gjengi noen akutte tolkning av mikromiljøet vanskelig. Til slutt, en feilsteg i osmification prosessen, for eksempel ved hjelp av renseoppløsningen inneholdende natriumklorid, gir upålitelige resultater hvor de cellulære strukturer er vanskelige å skjelne (figur 7D).

Figur 1
Figur 1: Skjematisk av avgjørende skritt i protokollen. Apen hjernen (A) kuttes i seriesnitt med en kjøle vibratome (B). Det blir deretter behandlet for pre-innebygging immunhistokjemi og elektronmikroskopi, hvoretter regionen av interesse er plassert på tuppen av en harpiksblokk (C) og kuttet til 80 nm tykk sections med en ultramikrotom (D). Ultratynne snitt ble deretter oppsamlet på bare 150 mesh kobbernett eller Formvar-belagte nikkelnett (E), farget med bly-citrat og klar til å bli observert i henhold til transmisjonselektronmikroskop (F). Skala barer: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Godt bevart Primate hjernevev etter Acrolein-PFA transkardiakperfusjon. Elektronmikrografier av ekorn ape (Saimiri sciureus) hjernevev av GPI (A) og GPe (B) viser representative godt bevart materiale etter å ha utført den akrolein-PFA transkardiakperfusjon og immunperoksydase-diaminobenzidin teknikk. den mYelin kappe av aksoner (a) er forholdsvis intakt (se pilspiss i A), og den generelle ultrastruktur er godt bevart i A og B. dendrittiske profiler (d), små umyelinerte aksoner (a), og axon åreknuter (AV) kan lett bli identifisert. Et eksempel på en axon variakøse etablere en symmetrisk synaptisk kontakt (mellom pilene) med en dendrittisk profil (d) er vist i B. Skalastolpe: 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Deler fra Squirrel Monkey GPe og GPI immunolabeled for cholinacetyltransferase (ChAT), Serotonin Transporter (SERT), og tyrosinhydroksylase (TH) ved hjelp av immunoperoksydase-diaminobenzidin teknikk. Immunomerkede elementer kan lett identifiseres ved deres cytoplasma eller axoplasm fylt med elektron-tette DAB bunnfall. Merkede dendrittiske profiler er anerkjent av fylte mikrofilamenter, som vist i A, hvor en ChAT-immunofarget dendritt i GPI mottar en synaptisk kontakt (mellom piler) fra en umerket axon variakøse (AV). Den elektronmikrograf i B viser en myelinated axon i GPe med en forholdsvis intakt myelinlaget som axoplasm er immunolabeled for TH. Eksemplet i C viser en axon variakøse i GPI immunolabeled for SERT og er sett å etablere en symmetrisk synaptisk kontakt (mellom pilene) med en dendritt (d). I dette eksempel er DAB utfelles linjer plasmamembranen og den ytre overflate av organeller (mitochondrion og synaptiske vesikler). Axon variakøse vist i D ble observert i GPe og immunolabeled for TH og representerer et eksempel på DAB bunnfallet fullstendig fylling av axopLASM, med synaptiske vesikler blir synlig, men vanskeligere å avgrense. Elementer av mikromiljøet lett kan identifiseres, som eksemplifisert ved myelinerte og umyelinerte aksoner (A) og sporadiske dendritter (d) som omgir den merkede axon variakøse. Elektronmikros er endret fra 25, 26, 27. Skalastolpe: 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Eksempler på Primate hjernevev etter Glutaraldehyd-PFA transkardiakperfusjon. Representative elektronmikrografier av macaque aper (Macaca fascicularis) hjernevev av GPE (A) og GPI (BD) etter performing transkardiakperfusjon med 0,2% glutaraldehyd blandet med 4% PFA og immunperoksidase-diaminobenzidin teknikk med et antistoff mot serotonintransportøren (SERT). Som i figur 2, immunolabeled elementene kan identifiseres ved deres cytoplasma og axoplasm fylt med elektron-tette DAB bunnfall. Generelt ultrastruktur er forholdsvis intakt, og elementer av mikromiljøet lett kan identifiseres, som vist ved myelinerte og umyelinerte aksoner (a) og av og til dendrittene (d) og axon åreknuter (AV) som omgir de merkede nervefiber åreknuter, som beskrevet i figur 2. Legg imidlertid merke til inkonsistens i kvaliteten på ultrastrukturen, betegnet med veldefinerte plasmamembraner (pilhoder), men forholdsvis skadet myelinlaget (pil). Skalastolpe: 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 5: Eksempler på Primate hjernevev oppnådd etter et mislykket transkardiakperfusjon. Resultater fra et mislykket kjemisk fiksering er her vist i den ekornape GPI (A - B) og GPe (C - D) transcardially perfusert med 0,9% NaCl renseoppløsningen og en blanding av is-kald 4% PFA og 15% pikrinsyre fortynnet i 0,1 M PB (pH 7,4). Hjerner ble etterfiksert i 1 time ved 4 ° C i 4% PFA og 30% sukrose og kuttet i 60 um tykke seksjoner sagittal med en kjøle vibratome. Feilaktig fast hjernevev kan bli gjenkjent av en skadet myelinlaget (A og B, pilspisser), så vel som ved uskarpe eller udefinerte plasmamembraner (C og D, se pilspisser for eksempler). Ulike nevrale elementene DIFligere for å identifisere, gjengi noen tolkning av ultra upålitelig. Skalastolpe: 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: eksempler på ikke-spesifikk immunmerking ChAT i Squirrel Monkey GPe. Bakgrunnsfarging eller ikke-spesifikk immunmerking vises noen ganger under EM som delvis farging av store cellulære elementer, som vist i A - B (pilspisser). En slik uspesifikk farging vises oftere på overflaten av immunfarget seksjoner. Andre eksempler på ikke-spesifikk immunmerking omfatter hyppig observasjon av meget små elementer som fremkaller små, umyelinerte aksoner delvis eller fullstendig fylt med DAB og ligger svært nær en ennother, som vist ved pilene i C og D. Skalastolpe: 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: Skadet Squirrel Monkey GPe Tissue etter feiltrinn i Prøvepreparering for elektronmikroskopi. Anvendelse av detergent, slik som Triton X-100, i den blokkerende oppløsning, selv ved en lav konsentrasjon av 0,02%, endrer det vesentlige integriteten av ultrastruktur ved å skade cytoplasma av dendritter (A) eller myelinlaget av aksoner (B ). De forskjellige neuronal elementene er også vanskelig å skille fra hverandre, (C), siden plasmamembraner er skadet og vanskelig å avgrense. Den osmification prosess er also et viktig skritt i prøvepreparering. Bruken av natriumklorid i skylleløsninger (D) endrer fiksering av vevet, hvilket gjør etterfølgende analyse vanskelig. Skala: 800 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen presenterer vi en pålitelig protokoll for transkardiakperfusjon hos ikke-humane primater og pre-forankring immunhistokjemi egnet for EM prøve undersøkelse. Selv om typiske cryo-EM, slik som CEMOVIS, gir en god bevaring av hjernen ultrastrukturen, begrenser også bruken av immunhistokjemi 12. Andre teknikker, inkludert kryo-substitusjon og Tokuyaso teknikk, lar etter innbygging immunhistokjemi, men disse metoder er kostbare på grunn av ytterligere anordninger som er nødvendig under fremgangsmåten og kan være tidkrevende og utfordrende ferdighet-12, 14, 15. Videre, for å effektivt å anvende den kryo-fikseringsmetode, må prøven være relativt liten (opp til 200 pm i tykkelse ved bruk av høytrykks frysing 28 og 10 um ved atmosfæretrykk 29). Ideelt for å få godresultater med cryo-fiksering av primat hjernevev, må bli tatt fra en biopsi, forårsaker problemer med å finne den nøyaktige plasseringen av området av interesse i prøven. Dette problemet må omgås ved hjelp av stereotaxic koordinater. Den kjemiske fiksering med akrolein og pre-innebygging teknikk er foreslått ovenfor gir en enkel, billig, tidsbesparende og pålitelig metode for prøvepreparering av primat hjernevev og immunmerking for EM. Ved å følge denne fremgangsmåten, vil man få et godt bevart ultrastruktur sammen med antigenisitet for å muliggjøre immunmerking av de fleste proteiner. Men kjemisk fiksering for EM har også sine ulemper. Først, mens festing av oppløsninger slik som akrolein bevare de morfologiske detaljene i hjernevevet, er det mulig at noen morfologiske forandringer oppstår under den kjemiske fikseringsprosessen og endre resultatene sammenlignet med de som ville bli oppnådd med CEMOVIS eller kryo-substitusjonsteknikker. For det andre fikseringsprosessen ogpåfølgende dehydratisering behov for harpiks innebygging fjerne det meste av de ekstracellulære væsker og presse cellulære komponenter sammen, forårsaker krymping av vev som i vesentlig grad endrer sin størrelse og form sammenlignet med Cryo-fikserte celler 21, 30. Likevel har aldehyd fiksering vært brukt med hell i mange laboratorier rundt om i verden, og er allment akseptert i litteraturen som en pålitelig metode for å studere ultra funksjoner i nevroner og gliaceller, til tross for tidligere nevnt bekymringer 21, 30, 31, 32.

Ved sammenligning med den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, den postembedding immunhistokjemi som er nødvendig for Cryo-fikserte prøver innleiret i metakrylat-harpiks, er mindre følsom og påvisning av sentralnervesystem-antigener er begrenset 14 >, 33. Imidlertid har aldehyd fiksering også sine begrensninger i forhold til antigenisitet. Derfor er det viktig å teste spesifisiteten av antistoffer til en gitt kjemisk fiksering protokoll ved LM nivå før EM preparatet. Kvaliteten av immunhistokjemi på akrolein-fikserte hjernevev er også avhengig av tidligere bryte de sterke aldehyd-bindinger som er opprettet av det kjemisk fiksering. Dette trinnet kan oppnås ved inkubering av seksjonene før immunohistokjemi med natriumborhydrid (se trinn 3.3 til 3.5). Utelate dette trinnet ville definitivt resultere i suboptimal immunfarging 34. Dersom de antistoffer som skal anvendes ikke gi optimal farging på hjerneseksjoner fiksert med akrolein, er det mulig å alternativt bruke glutaraldehyd (0,1 til 2%) fortynnet i 4% PFA. Dette har vist seg å bevare brønn-hjerne ultrastructure samtidig i tilstrekkelig grad å opprettholde antigeniteten for mange antistoffer og for å tilveiebringe hjernevevpassende for langtidslagring med minimale forandringer 20, 21, 35, 36, 37. Det er også mulig å oppnå forholdsvis god fiksering og antigenisitet egnet for EM med PFA alene ved signifikant å heve pH i løsningen, men en kombinasjon av mer enn ett fikseringsmiddel under perfusjon har gitt bedre resultater 34, og studier støtter det PFA fiksering alene vanligvis produsere dårlig bevart vev for EM undersøkelse 38, 39. Men i noen sjeldne tilfeller, er antigenisitet svært vanskelig å opprettholde, og PFA fiksering alene er fortsatt den eneste levedyktige alternativet for EM undersøkelse.

Mange fremgangsmåten i denne protokollen bør følges nøye for å oppnå de optimale resultater. For eksempel, ved fremstilling av 4% PFA oppløsningmå utføres ved temperaturer over 45 ° C for å tillate pulveret å oppløse PFA, men det er viktig at temperaturen holder seg under 60 ° C. Ellers depolymerizes PFA løsningen inn formaldehyd og maursyre, som fikserer vev på en annen måte og utgjør en sur oppløsning som kan i betydelig grad endre vev kvalitet 40, 41. I tillegg er det viktig at perfusjon trinn utføres hurtig når membranen har blitt kuttet, siden hypoksi og hyperkapni vil produsere irreversible fysiologiske endringer i hjernen som vil kunne forringe kvaliteten og integriteten av vevet 31. Defekt fiksering kan være skadelig for bevaring av hjernevev og endrer selve ultrastrukturen av vev, så som plasmamembraner, mitokondria og synapser. Således oppløsningsfremstilling og perfusjons-trinn må utføres med forsiktighet. Vellykket EM prøve agingn også sterkt avhengig av en god etterfiksering i osmiumtetroksid. Faktisk har direkte perfusjon med osmiumtetroksid blitt beskrevet som å produsere rimelig intakt vev for EM observasjon 21, 39. Imidlertid har mange forskjeller med hensyn til mengden av det ekstracellulære rom og utseendet av plasmamembranen mellom osmium-perfusert og aldehydgruppene-perfuserte dyr blitt lagt merke til. Videre stekingen og herding av vev etter osmium perfusjon gjengitt fjerning av hjernen fra skallen, den etterfølgende disseksjon, og differensieringen mellom hvitt og grått materie vanskeligere å favorisere aldehyd perfusjon for bedre bevaring vev og enklere manipulering 21. Aldehyd fiksering alene synes å redusere det ekstracellulære rom, som endrer integriteten til vev og gir inntrykk av tette koblinger hvor det ekstracellulære rom skal sees, således unnlater å viseakseptable elektronmikroskopibilder, selv etter at bly-citrat-farging 42. Imidlertid postfixation i osmiumtetroksyd reverserte denne situasjonen ved å tillate en mest mulig klar separasjon mellom vev elementer, som er nødvendig for deres identifikasjon 42, således tydelig rettferdiggjøre betydningen av å utføre de osmification trinn (trinnene 4,1 til 4,2) med forsiktighet.

De betingelser og konsentrasjoner under hvilke disse trinn gjennomføres er blitt testet i vårt laboratorium, spesielt for pre-innebygging av immunhistokjemi ved hjelp av DAB som bunnfallet på primate hjernesnitt. Selv om dyktighet utfordrende, dobbelt-immunohistokjemi er mulig ved etter innstøping immunohistokjemi med gull partikler 43. Den elektron-tette DAB erholdte utfelte etter immunperoksydase-diaminobenzidin teknikk foreslås her, er meget lett å identifisere på EM-nivå, siden den beskriver plasmamembraner og uteh overflater av organeller, som samtidig gir identifikasjon av sub-cellulære komponenter, for eksempel mitokondrier og synaptiske kontakter. I tillegg, når den foreliggende teknikk beherskes for enkelt immunhistokjemi, er det mulig å utføre dobbelt immunhistokjemi ved å kombinere DAB felle ut til gullpartikler, som er mer lett skjelnes fra hverandre enn gullpartikler av ulike størrelser. Vi vil anbefale å gjøre nøyaktig testing av antistoffspesifisitet, osmium konsentrasjoner, og inkubasjonstid og temperatur før behandlingen hjernesnitt for EM. Protokoller for pre-koblingen og dobbel immunhistokjemi for EM har tidligere blitt publisert og kan tilpasses for primat-hjernevev 16.

Konklusjonen er at den transkardiakperfusjon protokoll for ikke-humane primater presentert ovenfor, muliggjør for langtidslagring av hjerneseksjoner som senere kan brukes for EM før innebygging av immunhistokjemi. sections oppnås, er også egnet for nevroanatomi studier ved LM nivå. Derfor, ved anvendelse av en protokoll som er egnet for både EM og LM, er det mulig å redusere antallet dyr som benyttes, en kostnadseffektiv og etisk hensyn. Det tillater også en direkte sammenligning mellom resultatene som ble oppnådd ved den LM og EM nivåer på samme dyr og tillater bruk av korrelative lys og elektronmikroskopi (CLEM) studier. Clem studier har hovedsakelig fokusert på bruken av genetisk konstruerte mus som uttrykker fluorescerende proteiner, slik som EGFP, som senere kan bli merket med elektron-tette bunnfall og observert ved EM-nivå 44. Alternativt, for å omgå problemet med immunhistokjemi, cryo-fiksering kan kombineres med en intranevronale injeksjon av elektrontette markører, slik som kvanteprikker 45, før frysing, slik visualisering ved EM-nivå 46. Men kvanteprikker ikke er biokompatible, ogderes anvendelse er kostbar og tidkrevende på grunn av den ytterligere fryseapparaturen som er nødvendig for påfølgende vevspreparatet. Selv om disse teknikkene fortsatt taler for kryo-fiksering og fryse-substitusjonsmetoder, er det enkelte forhold til bruk av kjemiske koder på halv tynne (300 nm) seksjoner for å merke forskjellige cellulære proteiner med syntetiske fluoroforer, som kan bli korrelert med EM-analyse 47 . Teknikker som muliggjør, for eksempel, korrelasjonen mellom en spesifikk axon lokalisering ved hjelp av fluorescens, og dens synaptisk forhold til neuroner fra et gitt mål-struktur ved bruk av EM, er ganske lovende for forståelsen av organiseringen av nervesystemet, spesielt i primater. I dette tilfellet bør akrolein fiksering bli favorisert i forhold til glutaraldehyd, da sistnevnte vil produsere autofluorescens som kunne endre den riktige visualisering av hjernestrukturer på LM-nivå. Imidlertid har svært få studier av denne typen blitt gjennomført i primater, mostly grunn av tekniske utfordringer og de høye kostnadene som slike eksperimenter pålegge. Således blir nye utviklinger som trengs for vellykket og lave kostnader Clem studier hos primater, slik som bedre fiksering eller ved anvendelse av kjemiske koder synlig både på LM og EM-nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC, 401848-2011 til MP). MP fikk en karriere utmerkelse fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE var mottakeren av en doc fra FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Vi takker Marie-Josée Wallman for teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
NaOH EMD SX0590-1 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) Sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18 G 11/2
Needle terumo  NN-2713R 21 G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma S-9125
Normal horse serum (NHS) Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1,000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3,3'-diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0.005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152
4% 19150
 Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin Sigma A: M epoxy resin (44611)
B: hardener 964 (44612)
C: accelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plasticizer (44614) 		 Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate Sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter Corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Tags

Neuroscience utgave 122 transmisjonselektronmikroskopi ape neuroanatomy immunohistokjemi antistoffer akrolein transkardiakperfusjon forankring ultramikrotom
Utarbeidelse av ikke-menneskelige primater hjernevev for Pre-embedding Immunohistokjemi og elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Parent, M. Preparation of… More

Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter