Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Framställning av icke-mänskliga primater hjärnvävnad för Pre-inbäddning Immunohistokemi och elektronmikroskopi

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55397
Automatic Translation
1,2, 1
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Summary

Här ger vi en enkel, billig och tidseffektivt protokoll för att kemiskt fixera primathjärnvävnad med akrolein fixativ, vilket möjliggör långtidskonservering som är kompatibel med pre-inbäddning immunohistokemi för transmissionselektronmikroskopi.

Abstract

Trots alla tekniska framsteg på ljusmikroskop nivån förblir elektronmikroskopi det enda verktyget i neurovetenskap för att undersöka och karaktärisera ultra och morfologiska detaljer av nervceller, såsom synaptiska kontakter. God konservering av hjärnvävnad för elektronmikroskopi, kan erhållas genom rigorösa Cryo-fixeringsmetoder, men dessa tekniker är relativt dyra och begränsa användningen av immunomärkning, vilket är avgörande för att förstå anslutning av identifierade neuronala system. metoder fryssubstitutions har utvecklats för att möjliggöra kombinationen av kryo-fixering med immunomärkning. Men reproducerbarhet av dessa metodologiska tillvägagångssätt förlitar sig vanligtvis på dyra frysning enheter. Dessutom uppnå tillförlitliga resultat med denna teknik är mycket tidskrävande och skicklighet utmanande. Hence, den traditionella kemiskt fixerade hjärnan, i synnerhet med akrolein fixativ, förblir en tidseffektiv och billig metod för att kombinera elektronmikroskopi med immunohistokemi. Här ger vi en tillförlitlig försöksprotokoll med användning av kemisk akrolein fixering som leder till bevarandet av primathjärnvävnad och är kompatibel med redan inbäddning immunohistokemi och transmissionselektronmikroskopundersökning.

Introduction

Ijusmikroskopi, inklusive konfokala och två-foton-mikroskopi, har visat sig vara ett effektivt verktyg för att studera in vivo-neuronala processer, bland annat 1, 2. Även om den typiska spatiala upplösningen på Light Mikroskopisk (LM) nivå är ungefär 200 nm, de senaste tekniska framstegen med användning av olika ljuskällor, såsom extrem ultraviolett och mjuka röntgen mikroskopi, har i synnerhet ökat denna resolution till en nästan 10 nm rumslig upplösning 3 , 4, 5. Andra tekniska framsteg i avbildnings innefattar kombinerad magnetisk resonanstomografi med histologi och åstadkomma ett nytt förfarande för mätning av tjockleken av myelinskidan in vivo, en parameter som var traditionellt mätbar enbart vid Electron Mikroskopisk (EM) nivå 6, 7. although dessa framsteg på LM-nivå ger en utmärkt verktyg för att studera levande processer, en detaljerad vy och karakteriseringen av strukturer, såsom synaptiska kontakter, endast kan uppnås med EM, vilket ger en upplösning som kan nå 0,5 nm. Men observation på EM nivå kräver proverna att vara död och ändras på något sätt, med kemiska fixerings och uttorkning processer, i syfte att bevara cytoarchitecture. Sålunda kan undersöka biologiska prover med hög upplösning vara utmanande på grund av strålningsskada från elektronstråle, låg kontrast, strukturella avvikelser av membran, eller till och med närvaron av artefakter som kan inträffa efter dehydratisering och epoxi inbäddning 8, 9, 10.

Bevara prover i deras nativa form för strukturanalys kan uppnås genom att använda "Cryo EM av förglasad Sektioner" eller CEMOVIS, en sektione tillvägagångssätt sominvolverar snabbt frysa och inbäddning provet i glaskroppen is och undersöka de sektionerna under EM vid en kryogen temperatur 11, 12. Denna procedur möjliggör för undersökning av prover, medan de fortfarande är fast och fullständigt hydratiserat, vilket eliminerar artefakter som orsakas av dehydrering processer 13. Emellertid innefattar denna metod ytterligare anordningar för kryo-ultramicrotomy samt ytterligare enheter på standard EM, för att möjliggöra denna observation vid mycket låga temperaturer, som genererar betydande merkostnader. Dessutom utesluter CEMOVIS tillvägagångssätt användningen av immunomärkning tekniker, eftersom antikroppar har oftast som skall inkuberas vid RT. Alternativt är det möjligt att kombinera ultrastrukturell analys med immunhistokemiska procedurer med användning av en fryssubstitutionsmetoden, under vilken kryo-fixerade prover långsamt tinas under det nedsänkta i kryo-skyddande kemikalier och är thsv inbäddad i specialiserade hartser, såsom Lowicryls. Post-inbäddning immunomärkning kan sedan utföras på sådant material 12. frys substitutions- och Cryo-fixeringstekniker är emellertid tidskrävande. De kräver installation av ytterligare utrustning och kräver fortfarande prover som skall exponeras för organiskt lösningsmedel och kemisk fixativ som kan förändra cytoarchitecture, trots användningen av en låg temperatur 14, 15. Hence, trots alla tekniska framsteg både på LM och EM-nivå, kemisk fixering av hjärnvävnad, i synnerhet med akrolein, förblir en låg kostnad och tidseffektiv metod för att kombinera immunohistokemi med EM 16.

Under de senaste decennierna har många försök gjorts för att hitta en blandning av aldehyder som ger den bästa vävnads bevarande. Före 1960-talet, den enda kemiska fixativ som gav acceptabla resultat för EM var osmiumtetroxid. Emellertid är osmiumtetroxid höggradigt toxiskt och dyra, vilket utesluter dess användning genom det vaskulära systemet för att fixera organ såsom hjärnan. Akrolein introducerades i slutet av 1950 som en tillförlitlig metod för animalisk vävnad konservering lämplig för EM observation av cellulära strukturer 17. Den penetrerar vävnaden djupare och reagerar snabbare än andra aldehyder när de används för fixering genom nedsänkning och tillåter god konservering av cytoplasmiska komponenter, med minimal krympning av vävnaden 17. Ett sådant särdrag ger akrolein fixering en klar fördel jämfört med andra aldehyder när de används i färsk vävnad, genom att tillåta en mer exakt lokalisering av levande molekylära föreningar, såsom enzymer och andra proteiner 18. I själva verket har det varit validerats genom åren som ett enkelt, effektivt och billig metod för fixering för visualisering på EM-nivå i många arter, inklusive amfibier och gnagare, eftersom det effektivt stabiliZES peptider och proteiner, bibehåller antigenicitet och ger relativt intakt ultrastruktur när den används i kombination med en annan aldehyd fixativ 16, 18, 19, 20, 21. Protokoll för akrolein fixering hos gnagare har sedan dess standardiserats och används i stor utsträckning, särskilt av Pickel grupp, för att implementera dubbla immunomärkning för EM 16, 22. Några grupper har använt akrolein fixering i icke-mänskliga primater hjärnvävnad 23. Men så vitt vi vet finns det bara ett publicerat protokoll effektivt beskriva kemiska fixering med akrolein i icke-mänskliga primater som är kompatibel med EM immunomärkning 24.

I den här artikeln ger vi en enkel och tillförlitlig metod för att effektivt kemiskt fixa icke-humen primat hjärnor med akrolein, vilket möjliggör en potentiellt långsiktigt bevarande tillsammans med pre-inbäddning undersökning immunomärkning och transmissions-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Statement: Alla protokoll som involverar djur godkändes av Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval och gjordes i enlighet med den kanadensiska rådet om Animal Care Rens guide till skötsel och användning av försöksdjur (Ed. 2). Protokollet som beskrivs här var optimerad för vuxna djur av cirka 800 g. Volymerna av fixativ bör justeras i enlighet med djurets storlek.

1. Framställning av Lösningar för transkardial perfusion

  1. Förbereda ett L av en 50 mM natriumfosfat-buffrad saltlösning (PBS) lösning enligt följande steg. Bered lösningen högst 24 h före perfusion och hålla vid 4 ° C fram till användning.
    1. Mäta 800 ml destillerat vatten i en 1 L bägare. Lägga 5,87 g dibasiskt vattenfritt natriumfosfat (Na 2 HPO 4), 1,20 g monobasisk monohydrat natriumfosfat (NaH 2 PO 4 • H2O), och 9 gav natriumklorid (NaCl). Rör om för att lösa upp.
    2. Justera pH till 7,4 genom gradvis tillsats av 5 N NaOH. Tillsätt destillerat vatten för att nå en total volym på 1 L.
      FÖRSIKTIGHET: NaOH är en korrosiv kemisk förening. Bär lämplig personlig skyddsutrustning (PPE;. Laboratorierock, handskar, skyddsglasögon, etc).
  2. Förbereda 2 L av 4% paraformaldehyd (PFA) enligt följande steg. Denna lösning bör framställas vid de flesta 24 timmarna före kirurgi och hölls vid 4 ° C fram till användning.
    1. Mäta 1,5 L av destillerat vatten i en 2-liter bägare. Lägga 23,48 g dibasiskt vattenfritt natriumfosfat (Na 2 HPO 4) och 4,80 g monobasiskt monohydrat natriumfosfat (NaH 2 PO 4 · H2O). Rör om för att lösa upp. Tillsätt destillerat vatten för att nå en total volym på 2 L.
    2. Upphetta lösningen under en avluftning huv tills temperaturen når cirka 45 - 55 ° C. Värm inte till över 60 ° C.
    3. Gradvis lägga 80 g av PFA till lösningen och rör om tills allt löst sig (ca 30 - 60 min). Hålla övervakning av temperaturen för att hålla den under 60 ° C.
      VARNING: PFA är mycket volatil i pulverform. Det är mycket giftigt vid kontakt med ögon eller hud och är farlig vid inandning eller förtäring. Bär personlig skyddsutrustning och använda med försiktighet under ventilationskåpan.
    4. Kyla lösningen ner till 4 ° C och filtrera. Lagra vid 4 ° C.
  3. Förbereda ett L av 3% akrolein i 0,1 M fosfatbuffert (PB) enligt följande steg. PB lösning bör beredas högst 24 timmar före perfusion.
    VARNING: Akrolein är mycket giftigt vid inandning och kan producera omedelbara skador. Det är också frätande och mycket giftiga om absorberas genom huden. Det är cancerframkallande och mutagena. Bär lämplig skyddsutrustning och användning under en ventilationsfläkt.
    1. Mäta 800 ml destillerat vatten. Lägga 8,66 g dibasiskt vattenfritt natriumfosfat (Na 2 4) och 5,38 g monobasiskt monohydrat natriumfosfat (NaH 2 PO 4 · H2O). Rör om tills alla salter löser sig. Tillsätt destillerat vatten för att nå en total volym på 1 L. Håll lösningen vid 4 ° C.
    2. Före operation, överföra 900 ml av PB-lösning till en 1 liters glasbehållare och tillsätt 30,94 ml 97% akrolein lösning under en luftningskåpa. Lägga PB-lösning för att nå en total volym av 1 L och rör om. Filtrera lösningen och hålla den vid 4 ° C.

2. transkardial perfusion och Brain Dissection

  1. Håll lösningar på is under hela kirurgiska ingreppet. Förbereda pumpen genom att placera röret i den första lösningen som ska användas (PBS; 50 mM) och vrida på pumpen tills ingen luft finns kvar i slangen. För transkardiell perfusion av en makakapa, använda en 21 G nål och ställ utflödet vid ca 80 ml / min.
  2. Söva djur med en intramuskulär injektion av en blandningture av ketamin (20 mg / kg), xylazin (4 mg / kg), och acepromazin (0,5 mg / kg). Upprätthålla djuret under isofluran (3%) sedering.
  3. Fäst djurets lemmar till en ventilations bord.
  4. Med en skalpell, ta bort huden upp till armhålorna. Skär magmusklerna. Använd tunga kirurgiska sax för att klippa revbenen i sidled genom att noggrant undviker de vitala organ.
  5. Skär membranet med kirurgisk sax och höja bröstkorgen att exponera hjärtat. När membranet skärs, gå snabbt, eftersom hjärtat slutar slå inom några minuter.
  6. Ta hjärtsäcken med ett skalpellblad och stick in nålen i vänster kammare. Med en skalpell, försiktigt göra en liten excision till höger förmak. Snabbt starta pumpen vid 72 ml / min och håll nålen på plats. Om möjligt, luta djuret för att få huvudet på en lägre nivå än hjärtat.
    OBS: Var noga med att inte tränga igenom skiljeväggen när nålen infoga.
    1. Rinse blodet med ca 300 ml PBS tills lungorna är vita och inget blod kommer ut ur det högra förmaket.
  7. Stoppa pumpen, snabbt överföra slangen / röret till akrolein lösning 3%, och starta pumpen igen. Gradvis öka pumpningshastigheten till 80 ml / min när hjärtat har slutat slå. BEGJUTA cirka 500 ml av akrolein lösningen.
  8. Stoppa pumpen snabbt överföra slangen till 4% PFA-lösning, och starta pumpen igen. Detta steg kräver ungefär 1 L av PFA.
    OBS: Fixeringen är klar när frambenen är stela och halsen är stel.
  9. Skär huvudet och försiktigt dissekera hjärnan ur skallen. Var noga med att inte skada hjärnan med kirurgiska instrument. Perfusionen är optimal när hjärnan är blek (inga spår av blod) och styv (Figur 1A).
  10. Doppa den intakta hjärnan i 4% PFA under 1 h vid 4 ° C.
  11. Seriellt skära hjärnan med en kylande vibratome (4 ° C)i det önskade planet i 50 | j, m tjocka sektioner och samla dem i PBS (0,1 M) (Figur 1B).
    OBS: Detta steg kan utföras på många sätt i enlighet med det önskade protokollet. Hemisfärerna kan separeras före vibratome skärning, eller hålls helhet. Om hjärnan är för stor för vibratome plattformen kan det skäras i mindre block. Efter detta steg, kan sektioner lagras under en lång tidsperiod vid -30 ° C i en antifryslösning framställd av 40% PB (50 mM), 30% glycerol och 30% etylenglykol.

3. Pre-inbäddning Immunohistokemi (Figur 1C)

  1. Bered en 4 L lagerlösning av Tris-buffrad saltlösning (TBS, 50 mM, pH 7,6) enligt följande.
    1. Mäta 2L destillerat vatten i en 4 liter bägare, tillsätt 24,23 g trihydroximetyl aminometan (THAM; C 4 H 11 NR 3), och rör om för att lösa upp.
    2. Justera pH till 7,6 med ca 148 ml 1 N HCl. Syran bör tillsättas med cautipå att undvika att nå ett pH under 7,6. Den totala volymen bör vara 4 L.
      VARNING: HCI är starkt frätande. Bär lämplig skyddsutrustning.
  2. Väljer sektioner (från steg 2,11) innehållande regionen av intresse som skall bearbetas för EM immunohistokemi.
  3. Tvätta fritt flytande sektioner 3x i PBS (0,1 M, pH 7,4) under 5 min vid RT för att skölja antifryslösningen.
  4. Bered en 0,5% lösning av NaBH 4 utspädd i PBS.
    1. Väg 0,05 g NaBH4 och späd den i 10 ml PBS. Täck inte över. Bered denna lösning omedelbart före användning.
  5. Inkubera sektionerna i nyberedd NaBH 4 lösning för 30 min vid RT. Rock försiktigt. Täck inte över.
  6. Tvätta 3x i PBS under 10 min vid RT, gung kraftigt tills ingen av reaktionsgasen kvarstår.
  7. Förbereda en blockerande lösning för EM med 2% lämplig normalt serum och 0,5% kall fiskgelatin utspädd i PBS.
    OBS: Mängden should beräknas för att få tillräckligt för följande tre steg. Använd ett serum göras från samma djurart värd den sekundära antikroppen. Undvika användningen av antigenåtervinning metoder eller tillsats av små mängder av triton (för att öka penetrationen av antikroppar), som dessa metoder kompromissa avsevärt kvaliteten av vävnaden.
  8. Inkubera sektionerna i blockeringslösningen för 1 h vid RT. Rock försiktigt.
  9. Förbereda primär antikropplösning utspädd i blockeringslösningen.
    OBS: Koncentrationen av den primära antikroppen är vanligen densamma som för LM immunohistokemi, men anser ledande provningar vid olika antikroppskoncentrationer i förväg, eftersom vissa primära antikroppar inte kan fungera med akrolein. Om så är fallet, är det möjligt att använda en blandning av glutaraldehyd (0,1 - 2%) och 4% PFA i transkardial perfusion och erhålla liknande resultat. Optimera inkubationstid och temperatur samt.
  10. Inkubera sektionerna i primär antikroppslösningöver natten vid RT med försiktig skakning. Använda en tidigare testats inkubationstid och temperatur.
  11. Tvätta sektionerna 3x i PBS under 5 min vid RT med försiktig skakning.
  12. Bered en 1: 1000 lösning av biotinylerad sekundär antikropp utspädd i blockeringslösningen.
    OBS: Den sekundära antikroppen måste höjas mot värdarten används för att generera den primära antikroppen.
  13. Inkubera sektionerna i sekundär antikropp lösning för 1,5 h vid RT. Rock försiktigt.
  14. Framställa ett avidin-biotin-peroxidas (ABC) lösning minst 60 minuter före slutet av den sekundära antikroppen inkubation.
    1. Använda en kalibrerad pipett för att mäta 8,80 | il / ml av lösningar A och B och späda ut dem i PBS.
    2. Vagga milt under minst 60 min vid RT för att medge fullständig bindning mellan avidin och biotin-molekyler.
  15. Efter inkubation i sekundär antikropplösning, tvätta 3x i PBS under 10 min vid RT.
  16. Inkubera avsnitt i ABC sålution under 1 h vid RT. Rock försiktigt.
  17. Tvätta en gång i PBS och två gånger i TBS under 10 min vid RT med försiktig skakning.
  18. Bered en färsk lösning av 0,05% 3,3'-diaminobensidin (DAB) med 0,005% H 2 O 2 utspädd i TBS.
    1. Väg upp 12,5 mg DAB och späda ut det i 25 ml kall TBS. Skyddas från ljus.
      VARNING: DAB pulvret är mycket flyktigt och skadligt vid inandning. Det är cancerframkallande och teratogent. Därför bör gravida eller ammande kvinnor inte manipulera denna produkt, även vid utspädning. Använd en N95 mask när manipulera och slitage skyddsutrustning.
    2. Filtrera lösningen och tillsätt 4,5 | il av 30% H 2 O 2 precis före användning.
  19. Inkubera sektioner i DAB-lösning för 3 till 7 min vid RT. Rock försiktigt.
    OBS! Den bruna utfällningen bör inte vara alltför mörk för att undvika en hög nivå av bakgrundsfärgning. Inkubationstiden bör optimeras i enlighet därmed.
  20. Stoppa reaktionen genom att snabbt tvättning två gångeri kall TBS, sedan två gånger under 10 minuter i kallt TBS vid RT, följt av två gånger under 10 min i PB, med mild skakning.
    OBS: Användning av PB (och inte PBS) är kritisk för att eliminera eventuella spår av NaCl, eftersom det skulle reagera med osmium och bildar kristaller.

4. Osmification and Embedding för observationer med elektronmikroskop

  1. Framställa en lösning av ett% osmiumtetroxid (OSO4) utspädd i PB. Skyddas från ljus.
    VARNING: Osmium är mycket giftigt och bör inte komma i kontakt med hud, ögon eller mun och bör inte inandas. Det kan leda till döden vid förtäring. Det bör endast användas under en ventilationsfläkt och med lämplig skyddsutrustning.
  2. Inkubera sektionerna i OSO4 lösning under 30 min vid RT under ventilerings huven (utan omröring) och täcka dem med aluminiumfolie för att skydda dem från ljus. Helt platta sektionerna före tillsats av OSO4 lösningen.
    OBS: Sektionerna blir mycket mörk och rigid och bör manipuleras med omsorg efter det här steget.
  3. Förbereda vattenrepellerande epoxiharts under osmification.
    1. Lägga lämpliga mängder av varje komponent i blandningen epoxiharts (20 g epoxiharts, 20 g härdare, 0,6 g av accelerator och 0,4 g mjukningsmedel) till en stor plastkopp. Rör om med en träpinne eller plastpipett tills en homogen brun färg erhålles.
      OBS: Det är viktigt att använda den exakta andelen av varje komponent.
    2. Överföra lika mängder till aluminium koppar lämpliga storlekar, beroende på antalet sektioner som skall bearbetas. Låt den vila.
  4. Tvätta de osmificated sektionerna 3x i PB under 10 min vid RT med låg hastighet skakning.
  5. Dehydrera sektionerna i följande serie av graderad etanol under 2 min vardera: 2 gånger i 35% etanol; En gång var och en i 50, 70, 80, 90, och 95% etanol; och 3x i 100% etanol.
  6. Överför avsnitt för glasflaskor för att slutföra dehydratipå processen genom att inkubera sektionerna 3 gånger under 2 min i propylenoxid.
    FÖRSIKTIGHET: Propylenoxid är en mycket flyktig och toxisk organiskt lösningsmedel. Det kan orsaka allvarliga skador på ögon eller hud vid kontakt eller vid inandning eller förtäring. Det har klassats som en klass 2 cancerframkallande ämne. Det bör endast användas under en ventilationsfläkt och med personlig skyddsutrustning. Det är också mycket brandfarligt och ska hållas borta från värmekälla.
    OBS: Före detta steg bör sektioner överföras noggrant i glaskärl, eftersom propylenoxid är ett organiskt lösningsmedel och är oförenligt med plast. Vid denna punkt, avsnitten är mycket bräckliga och bör manipuleras med omsorg. Sektioner kan alternativt överföras till glasflaskor före steg 4,5.
  7. Överföringssektioner noggrant, en efter en, i aluminiumkoppar och undvika kontakt med luft så mycket som möjligt. Platt-bädda sektionerna i tidigare blandad vattenavvisande epoxiharts och inkubera dem över natten under Venting huva vid RT.
    OBS: I detta steg, sektionerna är helt uttorkad och mycket sköra och bör manipuleras med omsorg.
  8. Användning av mineralolja, förbereda fettbelagda glasskivor tillsammans med smorda plasttäckglas.
  9. Mjuknar hartset genom inkubering aluminiumkoppar vid 60 ° C under 12-15 min som mest. Försiktigt platta sektionerna på smorda sidan av objektglas. Placera smord täck och försiktigt trycka ut eventuell kvarvarande luft.
  10. Inkubera objektglasen vid 60 ° C under 48 h.
    OBS: Det är viktigt att inte överskrida 48 h inkubationstid, eftersom hartset kommer att bli för hårt.
  11. Ta bort plasttäckglas.

5. Provberedning för Ultratunn Sektione och miljöövervakning med hjälp av en transmissionselektronmikroskop

  1. Använd kikare för att hitta det intressanta området och skär en liten fyrkantig bit av cirka 1 mm 2 med en skalpell.
  2. Fil spetsen av en hartsblocket och limma quadrangular stycke på det (Figur 1C). Låta limmet torka i minst 1 h eller över natten före snittning.
  3. Med användning av en ultramikrotom, skär den fyrkantiga bit in i 80 | j, m tjocka sektioner (figur 1D).
    1. Placera hartsblocket i en ultramikrotom däck i vertikalt läge och med hjälp av ett vasst rakblad, gradvis skära varje sida av hartsblocket för att bilda en trapets med släta sidor.
    2. Sätta däcket i sitt horisontella läge och rotera blocket tills den längsta sidan av trapetsoiden är vänd nedåt.
    3. Använd en diamant trimning verktyg eller ett glas kniv att trimma yta fyrkantig bit. Ställa in ultramikrotom för att skära 300 fim tjocka sektioner vid en mm / s. Justera kniven att vara vertikalt parallellt med fyrkantigt stycke och för att visa en mycket liten horisontell vinkel av ungefär 1 °.
      OBS: Denna vinkel gör det möjligt för användaren att närma sig vävnaden nästan parallellt med ytan på blåsa, där immunomärkta element är mer sannolikt att hittas. Vid användning av dessa parametrar med diamant trimning verktyg, visar hartset en skinande vit färg. När vävnaden skärs, ändras den till en lila eller grönaktig färg.
    4. Använda en ultra 45 ° diamantkniv utrustad med en båt fylld med destillerat vatten för att skära 80 um tjocka sektioner, jämna sektioner genom att passera över dem med en bit av absorberande papper lutad i xylen, och samla seriesektioner på Formvar belagda nickel slot galler eller kala 150 mesh koppargaller (figur 1E).
  4. Placera galler i ett rutnät förvaringsbox.
  5. Färga galler med bly citrat.
    1. Använda en 5 ml spruta och en 0,2 | im sprutfilter för att framställa en 1: 1 lösning av filtrerad blycitrat stamlösning och filtrerades destillerat vatten. Skydda mot ljus.
      OBS: stamlösning av bly citrat bör göras färsk varje månad för att undvika bildandet av fasta inlåningdess. Se materialdatablad för aktie recept. Dessutom, om flera serier av nät måste färgas ändrar utspädda lösningen när det blir mjölkig.
    2. Placera varje galler på en droppe av den utspädda lösningen, med avsnittet i kontakt med lösningen. Inkubera i 3 min.
    3. Använd små pincett för att hålla nätet och skölj den i två bägare innehållande destillerat vatten.
    4. Avlägsna överskott av vatten genom att försiktigt med användning av absorberande papper. Förvara näten i ett rutnät låda. Vänta 30 min före undersökning av sektioner genom transmissionselektronmikroskopi (TEM, Figur 1F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I detta avsnitt presenterar vi representativa resultat som erhölls efter observationen, vid överförings EM nivå av immunostained primathjärnvävnad kemiskt fixerad med en blandning av 3% akrolein och 4% PFA. Vi uppnått bra bevarande av ultrastrukturen, vilket framgår av den relativt intakt myelinskidan och den rena visualisering av dubbla membran (Figur 2A). Synaptiska kontakter, tillsammans med neuronala element från mikromiljön, kan lätt identifieras (Figur 2B). Neuronala element märkta med diaminobensidin (DAB) immunoprecipitat redovisas till EM-nivå genom deras fyllda cytoplasman eller axoplasm. Plasmamembranet och den yttre ytan av organeller är också typiskt fodrade med elektrontätt fällning (fig 3).

I detta speciella experiment använde vi antikroppar against serotonintransportören (SERT), kolinacetyltransferas (ChAT), eller tyrosinhydroxylas (TH) för att visualisera immunolabeled neuronala element i den externa (GPe) eller intern (GPi) segment av squirrel monkey globus pallidus (Figur 3). För att göra detta använde vi en kombination av fäst kemikalier som bevarar antigenicitet liksom ultra, vilket gör att en detaljerad morfologisk undersökning. Även om många antikroppar kan användas med transkardial perfusion protokoll som beskrivs ovan, rekommenderar vi att användare utföra tester optimering koncentrations förväg, eftersom vissa primära antikroppar är kända för att inte ge optimal immunomärkning med akrolein fixering. Alternativt, när antikroppar inte ger optimal immunomärkning med akrolein fixering, en utspädning av från 0,1 till 2% glutaraldehyd i 4% PFA kan användas för transkardial perfusion. Det ger vävnadskvalitet relativt motsvarande akrolein fixerad hjärnvävnad med bibehållen antigenicitet för mångaantikroppar (Figur 4).

Slutligen ger vi typiska exempel på EM mikrofotografier som erhållits efter olämpliga manipulationer. A dåliga fixeringsresulterar i förändrade myelinskidor (Figur 5A, B) och svårigheter vid visualisering av de dubbla membranen hos neuriter (Figur 5C, D), som förhindrar en tillförlitlig identifiering och analys av märkta och omärkta neuronala element. En överdriven inkubationstid i DAB-lösning skapar överdriven bakgrund och icke-specifik färgning som potentiellt kan generera falskt positiva resultat. Bakgrund eller icke-specifik färgning uppträder ibland som ofullständig färgning av neuronala element (figur 6A, B), men mer ofta som många och nära beläget färgade neuronala element (Figur 6C, D). Användningen av detergent i blockeringslösningen förändrar signifikant kvaliteten av vävnaden. Det kan leda till att saknasorganeller i märkta element (Figur 7A) eller nedbrytning av myelinskidor (figur 7B) och cellulära membran (figur 7C), vilket gör någon akut tolkning av mikromiljön svårt. Slutligen, en felsteg i osmification processen, såsom användning av sköljlösning innehållande natriumklorid, producerar otillförlitliga resultat där de cellulära strukturerna är svåra att skilja (Figur 7D).

Figur 1
Figur 1: Schema av viktiga steg i protokollet. Apan hjärna (A) skärs i seriesektioner med en kylnings vibratome (B). Det bearbetas sedan för pre-inbäddning immunohistokemi och elektronmikroskopi, varefter det intressanta området är placerat på spetsen av en hartsblocket (C) och skars i 80 nm tjockt avsons med en ultramikrotom (D). Ultratunna sektioner samlas sedan på nakna 150 mesh koppargaller eller Formvar-belagda nickelgaller (E), färgades med blycitrat och redo att observeras under transmissionselektronmikroskop (F). Scale bars: 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Välbevarad Primate hjärnvävnad efter Akrolein-PFA transkardial perfusion. Elektronmikrofotografier av ekorreapa (Saimiri sciureus) hjärnvävnad av GPi (A) och GPe (B) visar representativa välbevarade materialet efter att ha utfört akrolein-PFA transkardial perfusion och immunoperoxidas-diaminobensidin teknik. mYelin hölje av axoner (a) är relativt intakt (se pilspets i A), och den allmänna ultrastrukturen är väl bevarad i A och B. Dendritiska profiler (d), små omyeliniserade axoner (a), och axon varicosities (AV) kan enkelt identifieras. Ett exempel på en axon varicosity upprättande av en symmetrisk synaptisk kontakt (mellan pilarna) med en dendritisk profil (d) visas i B. Scale bar: 1 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3: Snitt från Squirrel Monkey GPe och GPi immunolabeled för kolinacetyltransferas (ChAT), Serotonin Transporter (SERT), och tyrosinhydroxylas (TH) med hjälp av immunoperoxidas-diaminobensidin Technique. Immunomärkta element kan lätt identifieras genom sin cytoplasma eller axoplasm fylld med elektrontätt DAB fällning. Märkta dendritiska profiler är erkända av fyllda mikrofilament, såsom framgår i A, där en ChAT-immunostained dendrit i GPi mottar en synaptisk kontakt (mellan pilarna) från en omärkt axon varicosity (av). Elektronmikrofoto i B visar en myeliniserade axon i GPe med en relativt intakt myelinskida, vars axoplasm är immunolabeled för TH. Exemplet i C visar en axon varicosity i GPi immunolabeled för SERT och ses att upprätta en symmetrisk synaptisk kontakt (mellan pilarna) med en dendrit (d). I detta exempel, DAB utfälla linjer plasmamembranet och den yttre ytan av organeller (mitokondrie och synaptiska vesiklar). Axonet varicosity visas i D observerades i GPe och immunolabeled för TH och representerar ett exempel på DAB fällning helt fylla axoplasm, med synaptiska blåsor vara synlig, men svårare att beskriva. Elementen i mikromiljön kan lätt identifieras, såsom exemplifieras av myeliniserade och omyeliniserade axoner (a) och enstaka dendriter (d) som omger den märkta axonet varicosity. Elektronmikrografier ändras från 25, 26, 27. Scale bar: 1 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Exempel på Primate hjärnvävnad efter glutaraldehyd-PFA transkardial perfusion. Representativa elektronmikrofotografier av makakapa (Macaca fascicularis) hjärnvävnad av GPe (A) och GPi (BD) efter performing transkardial perfusion med 0,2% glutaraldehyd blandad med 4% PFA och immunoperoxidas-diaminobensidin-tekniken med en antikropp mot serotonintransportören (SERT). Såsom i figur 2, immunolabeled element kan identifieras genom sin cytoplasma och axoplasm fylld med elektrontätt DAB fällning. Allmänna ultrastruktur är relativt intakt och elementen i mikromiljön kan lätt identifieras, såsom visas av myeliniserade och omyeliniserade axoner (a) och enstaka dendriter (d) och axon varicosities (AV) som omger de märkta axonet varicosities, såsom beskrivs i figur 2. Observera dock den inkonsekvens i kvaliteten på ultrastrukturen, betecknat med väldefinierade plasmamembranen (pilspetsar), men relativt skadad myelinskidan (pil). Scale bar: 1 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 5: Exempel på primater Brain Tissue Erhölls efter en Misslyckad transkardial perfusion. Resultat från ett misslyckat kemisk fixering Här visas i ekorreapa GPi (A - B) och GPe (C - D) transkardiellt perfusion med 0,9% NaCl sköljlösning och en blandning av iskall 4% PFA och 15% pikrinsyra spädd i 0,1 M PB (pH 7,4). Hjärnorna efterfixerades 1 h vid 4 ° C i 4% PFA och 30% sackaros och skars i 60 pm tjocka sagittala sektioner med en kylande vibratome. Olämpligt fasta hjärnvävnad kan kännas igen av en skadad myelinskidan (A och B, pilspetsar), såväl som genom suddiga eller odefinierade plasmamembran (C och D, se pilspetsar för exempel). Olika neuronala element är difficult att identifiera, vilket gör någon tolkning av ultra opålitliga. Scale bar: 1 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Exempel på Icke-specifik ChAT immunomärkning i Ekorreapa GPe. Bakgrundsfärgning eller icke-specifik immunomärkning uppträder ibland under EM som partiell färgning av stora cellulära element, såsom visas i A - B (pilspetsar). Sådan ospecifik färgning visas oftare på ytan av immun sektioner. Andra exempel på icke-specifik immunomärkning inkluderar den frekventa observationen av mycket små element som frammanar små, omyeliniserade axoner delvis eller fullständigt fyllda med DAB och belägna mycket nära en ennother, såsom visas genom pilspetsar i C och D. Scale bar: 1 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7: Skadade Ekorreapa GPe Tissue efter Missteps i Provberedning för elektronmikroskopi. Användning av detergent, såsom Triton X-100, i blockeringslösningen, även vid en låg koncentration av 0,02%, väsentligt förändrar integriteten av ultrastrukturen genom att skada cytoplasman av dendriter (A) eller myelinskidan av axoner (B ). De olika neuronala elementen är också svåra att skilja från varandra (C), eftersom plasmamembran är skadade och svåra att beskriva. Den osmification processen är also ett viktigt steg i provberedning. Användning av natriumklorid i sköljlösningar (D) förändrar fixering av vävnaden, vilket gör efterföljande analys svår. Skala bar: 800 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna artikel presenterar vi en tillförlitlig protokoll för transkardial perfusion av icke-mänskliga primater och pre-inbäddning immunohistokemi lämplig för EM prov undersökning. Även om typiska Cryo-EM, såsom CEMOVIS, ger en god konservering av hjärnan ultrastruktur, också begränsar det användningen av immunohistokemi 12. Andra tekniker, inklusive Cryo-substitution och Tokuyaso teknik, tillåter efter-inbäddning immunohistokemi, men dessa tekniker är dyra på grund av att ytterligare enheter som behövs under processen och kan vara tidskrävande och skicklighet-utmanande 12, 14, 15. Dessutom, för att effektivt använda den kryo-bindningsmetoden, måste provet vara relativt liten (upp till 200 | j, m i tjocklek vid användning av högtrycks frysning 28 och 10 ^ m vid atmosfärstryck 29). Helst att få braresultat med Cryo-fixering av primat hjärnvävnad, har provet tas från en biopsi, vilket orsakar problem att hitta den exakta platsen för regionen av intresse. Detta problem måste kringgås med hjälp av stereotaktiska koordinater. Den kemiska fixering med akrolein och pre-inbäddning teknik som föreslås ovan ger ett enkelt, låg kostnad, tidseffektivt, och tillförlitlig metod för provberedning av primathjärnvävnad och immunomärkning för EM. Genom att följa dessa steg kommer man erhålla en välbevarad ultrastruktur tillsammans med antigenicitet att möjliggöra immunomärkning av de flesta proteiner. Emellertid har kemisk fixering för EM också sina nackdelar. Först, medan fixeringslösningar såsom akrolein bevara de morfologiska detaljerna i hjärnvävnad, är det möjligt att vissa morfologiska förändringar sker under den kemiska fixeringsprocessen och förändra resultaten jämfört med dem som skulle erhållas med CEMOVIS eller kryo-substitutionstekniker. För det andra fixeringsprocessen ochefterföljande dehydratisering som krävs för harts inbäddning avlägsna det mesta av de extracellulära vätskorna och pressa cellulära komponenter tillsammans, vilket orsakar krympning av vävnad som väsentligt modifierar deras storlek och form jämfört med kryo-fixerade celler 21, 30. Icke desto mindre har aldehyd fixering använts framgångsrikt i många laboratorier runt om i världen och är allmänt accepterad i litteraturen som en tillförlitlig metod för att studera ultrastrukturella särdragen hos neuroner och gliaceller, trots tidigare nämnda farhågor 21, 30, 31, 32.

Genom jämförelse med den ovan beskrivna metoden, är den postembedding immunohistokemi som behövs för kryo-fixerade prover inbäddade i metakrylatharts, mindre känslig och detekteringen av centrala nervsystemet antigener är begränsad 14 >, 33. Dock har aldehyd fixering också sina begränsningar i fråga om antigenicitet. Därför är det viktigt att testa specificiteten hos antikropparna för en given kemisk fixering protokoll på LM nivån innan EM beredning. Kvaliteten på immunohistokemi på akrolein fixerad hjärnvävnad beror också på tidigare bryta de starka aldehyd obligationer som skapats av kemisk fixering. Detta steg kan åstadkommas genom inkubation avsnitten innan immunohistokemi med natriumborhydrid (se steg 3,3-3,5). Utelämnar detta steg skulle definitivt resultera i suboptimal immunfärgning 34. Om antikropparna som skall användas ger inte optimala färgning på hjärnsektioner fixerade med akrolein, är det möjligt att alternativt använda glutaraldehyd (0,1 - 2%) utspädd i 4% PFA. Detta har visat sig väl bevara hjärnan ultra samtidigt tillräckligt bibehålla antigenicitet för många antikroppar och för att ge hjärnvävnadlämplig för långtidslagring med minimal förändringar 20, 21, 35, 36, 37. Det är också möjligt att uppnå relativt god fixering och antigenicitet lämplig för EM med PFA enbart genom att avsevärt höja lösningens pH, men en kombination av fler än ett fixativ under perfusionen har gett bättre resultat 34, och studier stöder att PFA fixering enbart i allmänhet producera dåligt bevarade vävnad för EM undersökning 38, 39. Men i vissa sällsynta fall är antigenicitet mycket svårt att upprätthålla, och PFA fixering ensam förblir det enda hållbara alternativet för EM undersökning.

Många steg i detta protokoll bör följas noggrant för att få optimalt resultat. Till exempel, framställningen av den 4% PFA-lösningmåste utföras vid temperaturer över 45 ° C för att göra det möjligt för PFA-pulver för att lösa upp, men det är absolut nödvändigt att temperaturen förblir under 60 ° C. Annars, depolymeriserar PFA lösningen i formaldehyd och myrsyra, som fixerar vävnad på olika sätt och bildar en sur lösning som avsevärt kan förändra vävnadskvalitet 40, 41. Dessutom är det viktigt att perfusion stegen utföras snabbt när membranet har skurits, eftersom hypoxi och hyperkapni ger irreversibla fysiologiska förändringar i hjärnan som kan förändra kvaliteten och integriteten av vävnaden 31. Defekt fixering kunde vara skadlig för bevarandet av hjärnvävnaden och permanent ändra ultrastrukturen hos vävnaden, såsom plasmamembran, mitokondrier och synapser. Således förberedelse lösning och perfusion åtgärder måste genomföras med omsorg. Framgångsrik EM prov FÖRBEREDELSEn också högst beroende av en bra efter fixering i osmiumtetroxid. Har faktiskt direkt perfusion med osmiumtetroxid beskrivits som producerar någorlunda intakt vävnad för EM observation 21, 39. Men många skillnader i termer av mängden av den extracellulära utrymmet och utseendet på plasmamembranet mellan osmium-perfusion och aldehyd-perfusion djur kunnat konstateras. Vidare svärtningen och härdning av vävnader efter osmium perfusion renderade avlägsnandet av hjärnan från skallen, den efterföljande dissektion, och differentieringen mellan vit och grå massa svårare, gynna aldehyd perfusion för bättre vävnadskonservering och enklare manipulation 21. Aldehyd fixering förefaller ensam för att minska det extracellulära utrymmet, vilket förändrar integriteten hos vävnad och ger intryck av täta förbindelser där extracellulära utrymmet bör ses och därmed inte visagodtagbara elektronmikrofotografier även efter blycitrat färgning 42. Emellertid postfixering i osmiumtetroxid omkastas denna situation genom att tillåta en mest bestämda separationen mellan vävnadselement, vilket är nödvändigt för deras identifiering 42, således klart motiverar vikten av att utföra de osmification stegen (steg 4,1-4,2) med försiktighet.

De villkor och koncentrationer under vilka dessa steg utförs har testats i vårt laboratorium, speciellt för pre-inbäddning immunhistokemi med användning DAB som fällningen på primathjärnsektioner. Även om skill-utmanande, dubbel-immunohistokemi är möjligt genom post-inbäddning immunohistokemi med guldpartiklarna 43. Elektrontäta DAB fällning erhålls efter immunoperoxidas-diaminobensidin teknik som föreslås här är mycket lätt att identifiera på EM-nivå, eftersom det beskriver plasmamembran och utER ytor av organeller, och samtidigt tillåta identifiering av sub-cellulära komponenter, såsom mitokondrier och synaptiska kontakter. Dessutom, när föreliggande teknik behärskas för enkel immunohistokemi, är det möjligt att utföra dubbel immunhistokemi genom att kombinera DAB utfällas till guldpartiklar, som är lättare urskiljas från varandra än guldpartiklar av olika storlekar. Vi rekommenderar att göra rigorösa tester av antikroppar specificitet, osmium koncentrationer och inkubationstid och temperatur före bearbetning hjärnsektioner för EM. Protokoll för pre-inbäddning och dubbel immunhistokemi för EM har tidigare publicerats och kan anpassas för primathjärnvävnad 16.

Sammanfattningsvis transkardial perfusion protokoll för icke-humana primater som presenteras ovan möjliggör långtidsförvaring av hjärnsektioner som därefter kan användas för EM pre-inbäddning immunohistokemi. ITTns erhålls är också lämpliga för neuroanatomiska studier på LM-nivå. Därför, genom användning av ett protokoll som är lämplig för både EM och LM, är det möjligt att minska antalet djur som används, ett kostnadseffektivt och etisk övervägande. Det gör också att en direkt jämförelse mellan resultat erhållna vid LM och EM-nivåer på samma djur och tillåter användning av Korrelat Ljus och elektronmikroskopiska (CLEM) studier. Clem studier har mestadels fokuserats på användningen av genetiskt manipulerade möss som uttrycker fluorescerande proteiner, såsom EGFP, som senare skulle kunna märkas med elektron-täta fällning och observerade på EM-nivå 44. Alternativt, för att kringgå problemet med immunohistokemi, kryo-fixering kan kombineras med en intraneuronala injektion av elektrontäta markörer, såsom kvantprickar 45, före frysning, vilket möjliggör visualisering på EM-nivå 46. Men kvantprickar inte biokompatibla ochderas användning är kostsamt och tidskrävande på grund av den extra frysapparaten behövs för efterföljande vävnadspreparatet. Även om dessa tekniker fortfarande gynna kryo-fixering och frysa-substitutionsmetoder, finns det vissa utvecklingar för användning av kemiska taggar på halvtunna (300 nm) sektioner för att märka olika cellulära proteiner med syntetiska fluoroforer, vilka kan korreleras med EM-analys 47 . Tekniker som gör det möjligt, till exempel, sambandet mellan en specifik axon lokalisering med hjälp fluorescens och dess synaptiska förbindelser med neuroner i ett givet mål struktur som använder EM, är ganska lovande för förståelse för organisationen av nervsystemet, specifikt i primater. I detta fall bör akrolein fixering gynnas över glutaraldehyd, eftersom de senare kommer att producera autofluorescens som kan förändra rätt visualisering av hjärnstrukturer på LM nivå. Emellertid har mycket få studier av detta slag gjorts i primater, mostly på grund av tekniska utmaningar och den höga kostnaden att sådana experiment införa. Således är nya utvecklingen behövs för framgångsrika och billig Clem studier i primater, såsom att förbättra fixeringsmetoder eller kemiska taggar synliga vid både LM och EM-nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC, från 401.848 till 2011 till MP). MP mottog en karriär tilldelning från Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE var mottagare av en doktorsavhandling gemenskap från FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Vi tackar Marie-Josée Wallman för tekniskt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
NaOH EMD SX0590-1 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) Sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18 G 11/2
Needle terumo  NN-2713R 21 G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma S-9125
Normal horse serum (NHS) Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1,000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3,3'-diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0.005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152
4% 19150
 Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin Sigma A: M epoxy resin (44611)
B: hardener 964 (44612)
C: accelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plasticizer (44614) 		 Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate Sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter Corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Tags

Neuroscience transmissionselektronmikroskopi apa neuroanatomi immunohistokemi antikroppar akrolein transkardial perfusion inbäddning ultramikrotom
Framställning av icke-mänskliga primater hjärnvävnad för Pre-inbäddning Immunohistokemi och elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Parent, M. Preparation of… More

Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter