Summary
脑血流和体内大鼠脑组织的光散射特性的同时评估用常规多光谱漫反射成像系统证明。
Introduction
多光谱漫反射成像是用于获得在皮质组织固有的光学信号（IOSS）的空间图的最常用的技术。 IOSS在体内脑电波中所见的主要归因于三个现象：在光吸收的变化和由于皮质血流动力学散射特性，这取决于降低或线粒体细胞色素氧化在吸收变化和变型中通过形态学改变诱导的光散射特性1。
在可见光（VIS）到近红外（NIR）的光谱范围内的光被有效地吸收，并通过生物组织散射。 体内脑的扩散反射光谱的特征在于，吸收和散射光谱。减小的散射系数μ在VIS到NIR波长范围内的结果的脑组织的S'以单调散射光谱表现出在较长波长荷兰国际集团较小幅度。减小的散射系数μ频谱S“（λ）可以近似为在幂律函数2，3的形式为μS”（λ）=α×λ-b。散射能力b为在活组织2,3与生物散射体的大小。组织和减少活皮层组织的生存能力的形态改变可影响生物散射体4，5，6，7，8，9的大小。
多光谱漫反射成像光学系统，可以从白炽灯里容易地构建GHT源，简单的光学部件，和一个单色电荷耦合器件（CCD）。因此，各种算法和多光谱漫反射成像光学系统已被用来评估皮质血流动力学和/或组织形态10，11，12，13，14，15，16，17，18。
这篇文章中描述的方法，被用于可视化两者血液动力学和体内使用常规多光谱漫反射成像系统的大鼠脑组织的光散射性质。这种方法比其它技术的优点是，以评估在两个脑血流和皮层组织时空变化的能力形态，以及它适用于各种脑功能障碍的动物模型。因此，该方法将是适当的创伤性脑损伤，癫痫发作，中风和缺血调查。
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Protocol
动物保健，准备和实验方案是由东京农工大学的动物研究委员会的批准。对于这种方法，将大鼠圈养在受控环境中（24℃，12小时光照/黑暗周期），与食物和水可随意获得。
1.传统多光谱漫反射成像系统的构建
- 摩9个的窄带光学干涉滤光器具有的中心波长500,520，540，560，570，580，600，730，和760纳米至机动滤光轮的过滤孔。
- 构建使用宽带白色光源，机动滤光轮与上述组窄带干涉滤光片，光导，聚光透镜，视频变焦透镜，和一个单色CCD照相机的多光谱成像系统。光学元件，在图 2中所示的布局，可以被称为用于第是施工程序。
注：照明的角度是大约45°相对于样品表面。 - 转动卤素灯光源经由一个干涉滤光器，光导，和聚光透镜来照射样品的表面。
- 打开CCD相机的操作软件。
2.动物的制备
注：在这个协议中，并没有用于未来的实验大鼠和它多光谱图像的测量后，立即处死。
- 感应腔室的入口端口连接到麻醉机的与管出口端口。感应腔室的出口端口连接到麻醉机的进气口与第二管。
- 放置老鼠进入吸气室和诱导具有5.0％异氟烷麻醉。在深度，使得老鼠并没有脚趾捏回应维持麻醉。大号奥尔〜2.0％异氟烷使用麻醉机上的旋钮。
- 在立体定位框架固定所述大鼠头部。附上麻醉喉舌的立体框架。
- 吸嘴的吸入口连接到麻醉机用管出口端口。吸嘴的出口端口连接到麻醉机用管入口端口。
- 剃光头区域使用外推剪，直到出现在皮肤表面的预期切口部位。
- 使形成纵向切口长大约20mm沿着所述头部的使用外科手术刀中线（ 图1（a））和暴露的皮下结缔组织（ 图1（b））。
- 使用锋利刮匙或钳子去除皮下结缔组织并将其拉向头部两侧，以暴露颅骨（ 图1（c））。
- 挖颅骨椭圆形沟颅sutur内es（冠状缝合，矢状缝合和羊角缝合）使用高速钻（ 图1（d） ）。
- 使用高速钻机慢慢均匀地挖掘沟内的颅骨。
- 用钳子的尖端轻轻地压在稀疏头骨的表面上，以估计脑血管出现后的骨厚度和强度。如果变薄的颅骨区域容易下压，则用高速钻机终止颅骨骨折。
- 使用钳子或小手术剪刀切割瘦骨头碎片的椭圆形边界线。
- 从脑表面缓慢地轻轻地使用钳子去除稀疏的头骨。
- 用生理盐水轻轻沐浴颅窗，并用约0.1毫米厚的透明玻璃板覆盖。
3.调节启发氧的分数
注意：呼吸系统灰可以通过调节吸入氧的（ 吸入氧浓度）分数来改变。
- 使用管，一个Y形管连接器（连接器1）的第一端口连接到另一个Y形管连接器（连接器2）的第一端口。
- 吸嘴的吸入口连接到管连接器1的第二端口。
- 使用的管，管连接器1的第三端口连接到一个氧浓度监视器装置。
- 用管，管连接器2的第二端口连接到麻醉机的出口。
- 使用的管，管连接器2的第三端口连接到一个气体混合物装置的出口端口。
- 气体混合物装置的一个进气口连接到一个高压95％O 2 - 5％使用管的CO 2气体圆柱体。
- 气体混合物的设备的另一入口端口连接到一个高压95％N 2 -使用管5％CO 2气瓶。
- 改变气体的流速Ø˚FO 2和N 2使用气体混合物的设备上的旋钮。
- 检查并使用氧浓度监视器装置调节吸入氧浓度。
4.多光谱漫反射图像采集
- 参考图像采集
注意：在这个实验中使用的光学部件，例如作为光源，光纤，和检测器有自己的光谱特性。因此，光的通过这些部件通过了强度应记录为参考图像。参考图像是用来自光源的光照亮的标准白色扩散器所拍摄的图像。- 放标准白色扩散板在舞台上水平。
- 通过在桶旋转变焦环聚焦白色扩散器的表面上的相机镜头。
- 通过选择适当的值来调整摄像头的积分时间下拉的积分时间列表中相机的操作软件，使最大的光量产生的信号是最大计数的约75％。一边看像素值的直方图，调整积分时间，直到信号强度电平是最大计数的约75％。
- 从文件菜单中的“保存”命令，将图像保存到文件中。
- 通过旋转滤光轮改变滤波器位置。
- 根据上述方法在其它波长保存的图像。文件名应识别样品和使用的波长（ 例如，W500，W520，W540 W760 ...）。
- 样本图像采集
注意：在9个波长暴露的大鼠脑的漫反射光强度的图像被捕获并保存使用相同的采集条件的个人计算机的硬盘驱动器上。- 轻轻地放在将R在舞台上，慢慢调整阶段水平，使相机可以对焦的大鼠脑的表面上。
- 从文件菜单中的“保存”命令，将图像保存到文件中。
- 通过旋转滤光轮改变滤波器位置。
- 根据上述方法在其它波长保存的图像。文件名应识别样品和波长（ 如，R500，R520，R540 R760 ...）。
- 深色图像采集
注：CCD照相机可以响应于电信号产生的光强度。然而，有一些小的输出由于在电气电路和检测器噪声，即使光不进入到检测器;这就是所谓的暗电流噪声。为了精确测量光的光谱强度时，暗电流成分应记录为暗图像，然后从所测量的信号中减去。黑暗的图像是取n，其中的光路阻断。- 关闭卤素灯光源。
- 阻挡光路，以利用屏蔽板的CCD摄像系统。
- 从文件菜单中的“保存”命令，将图像保存到文件中。文件名应确定，样品（ 例如，暗）。
5.可视化血红蛋白含量和光散射参数
注：一组多光谱漫反射的图像保存到个人电脑的硬盘驱动器和离线分析。通过在9个波长（500，520，540，560，570，580，600，730，和760纳米）的多光谱漫反射图像的蒙特卡罗模拟19辅助的多回归分析然后进行以可视化的二维氧化血红蛋白浓度，脱氧血红蛋白浓度，总血红蛋白浓度，局部脑氧饱和度，和SCAT的地图的TeringBay动力。具体算法已发表在文献17，18。
- 来自两个参考图像，并在每个波长处的样本图像中减去暗图像。
- 在每个波长λ归一化由基准图像的样本图像。治疗的归一化的图像作为漫反射率图像R。
- 通过取在每个波长λ的漫反射率图像R的倒数的对数计算的吸光度（或光密度）图像A：
（1） - y平面示出了用于在脑表面所获得的结构信息，而z -轴示出光谱信息-通过在它们的波长的顺序，其中x堆叠的吸光度图像生成的三维矩阵。
- PErform在每个xy坐标的吸收光谱A（λ）多元回归分析。
- 使用的吸收光谱A（λ）作为因变量和氧合血红蛋白的摩尔消光系数光谱εHbO2的 （λ）和脱氧血红蛋白εHBR（λ）作为用于步骤5.5的独立变量（公布值εHbO2的 （λ）和εHBR（λ）在表1中提供）。
- 检查三个多重回归的二维地图（图像）系数a HBO， 一个HBr和一个 0。
- 通过堆叠多重回归系数的图像的次序的HBO， 一个HBr和一个 0，生成的三维矩阵，其中该
- 计算氧合血红蛋白浓度C HBO，脱氧血红蛋白浓度C HBr和从该组的多个回归系数a HBO， 一个HBr和 0在每个xy坐标使用以下经验式（他值β的散射电压B HBO，I，βHBR，i和β0，I（I = 0,1,2,3）在表2中提供）：
（2） 
（3）
（4） - 检查氧化血红蛋白浓度C HBO，脱氧血红蛋白浓度C HBr和散射功率B的二维地图（图像）。
- 计算由求和ÇHbO2的和C HBR在每个x总血红蛋白浓度C HBT的二维地图- y坐标。
- y坐标-通过在每个x除以氧化血红蛋白浓度C HbO2的由总血红蛋白浓度C HBT计算局部脑氧饱和度RSO 2的二维地图。
（1） 
（2） 
（3）
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Representative Results
从体内大鼠脑获取的漫反射的代表性光谱图像示于图3中的图像，在500，520，540，560，570和580nm处清楚地看到血管的密集网络在大脑皮层。的血管，在600，730中的图像中观察到的周围组织，和760纳米之间的对比度恶化反射光中的时间更长，NIR波长下吸收血红蛋白。
图4示出了暴露的大鼠脑的用于氧化血红蛋白浓度，脱氧血红蛋白浓度，总血红蛋白浓度，局部脑氧饱和度，和散射功率代表估计的图像。如从漫反射图像预期在较短波长在图3中，在血液中的VES的总血红蛋白浓度SEL区域比在周围组织区域更高。在另一方面，在小动脉氧合血红蛋白浓度比在静脉由于动脉血液中的血红蛋白比静脉血更多含氧较高。因此，小动脉和小静脉的分布可以清楚地区域的氧饱和度的所估计的图像中区别开来。
在500nm 的R（500），氧合血红蛋白C HBO，脱氧血红蛋白C HBR，总血红蛋白C HBT的浓度，局部脑氧饱和度的浓度的浓度在吸入氧浓度变化为漫反射过程中的暴露的大鼠脑的代表估计的图像RSO 2，和散射功率b的示于图5。 RSO 2的值高氧条件下增加的和缺氧条件诱导后显着降低。 b的值在从缺氧发作直到呼吸停止的期间稍微增加，而它连续缺氧发作后期间降低从5分钟至30分钟。这些变化在b的值分别表示的形态变化，如肿胀和细胞和亚细胞结构的收缩，通过组织的生存力在脑的损失引起的。
图1：在大鼠大脑皮质的手术暴露步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：实验装置用于施用麻醉和改变吸入氧的分数的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：在多光谱代表漫反射图像500，520，540，560，570，580，600，730和760nm处，从体内大鼠脑得到。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：暴露大鼠脑的代表推定图像。 <强>（一）含氧血红蛋白C 高压氧浓度，（b）中的脱氧血红蛋白C HBR的浓度，（c）中总血红蛋白C HBT的浓度，（d）中局部脑氧饱和度RSO 2，和（e）的散射功率湾 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：暴露的大鼠脑的代表性结果在在吸入氧浓度变化。在500nm 的R（500），氧合血红蛋白C 高压氧浓度，浓度在吸入氧浓度变化为漫反射期间在体内大鼠皮层组织的图像的脱氧血红蛋白C HBR，总血红蛋白C HBT，局部脑氧饱和度RSO 2的浓度，和散射功率湾 请点击此处查看该图的放大版本。
| 波长λ处 | εHbO2的 （λ） | εHBR（λ） |
| 500 | 113.03712 | 112.6548 |
| 520 | 130.69296 | 170.58384 |
| 540 | 287.4744 | 251.5968 |
| 560 | 176.11128 | 290.4552 |
| 570 | 240.2784 | 243.3888 |
| 580 | 270.5616 | 199.908 | 600 | 17.28 | 79.25688 |
| 730 | 2.106 | 5.95188 |
| 760 | 3.1644 | 8.36201 |
表1：ε 高压氧的价值观和εHbO2的用于多元回归分析。在每个波长λ氧合血红蛋白εHBO和脱氧血红蛋白εHBR的摩尔消光系数。
| 一世 | βHBO，我 | βHBR，我 | βB，I |
| 0 | -8.3302 | -5.85271 | -0.76587 |
| 1 | 4405.877 | -143.23 | 53.34134 |
| 2 | 2740.622 | 3798.067 | 124.4656 |
| 3 | -4.40454 | -2.81699 | -1.36919 |
表2： C HbO ， C HbR和b的经验公式中使用的βHbO ， i ， βHbR ， i和β0 ， i （ i = 0,1,2,3）的值。注意，从这些经验公式得出的C HbO和C HbR的单位是体积浓度，其中血细胞比容读数为44％的全血的血红蛋白浓度被认为是血红蛋白的100体积浓度。血红蛋白浓缩的经验公式ations可以从通过光传输19的蒙特卡罗模拟中计算出的漫反射光谱来导出。对于经验公式的推导的详细过程已经在文献17,18进行了描述。
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Discussion
在这个协议中最关键的步骤是去除减薄头骨区域，使颅窗口的;这应该小心进行，以避免意外出血。这个步骤是为了获得高品质的多光谱扩散高精度反射图像重要。建议手术过程如果可能的话，使用立体显微镜。明胶海绵小块止血有用。
这篇文章中描述的光学系统穿过位于所述光源的前面的干涉滤光器的单色的光。这可以通过将所述滤光轮在摄像机镜头或CCD摄像机的前面进行修改。在这种情况下，然而，焦平面可以是可变的，如果使用具有不同厚度的干涉滤光器，而这将造成图像质量的恶化。有必要从颅窗口取出玻璃板如果记录电极插入到皮质组织为电生理学测量，如电局部场电位的测量。在这种情况下，成像系统可以检测到来自皮质表面不期望的镜面反射。可以通过使用一组偏振板用正交尼科耳排列，可以避免此问题。
在这篇文章中展示了传统的多光谱成像设备是有点费时使用，由于在轮上的滤波器的位置被机械地改变。这意味着，所述成像系统捕获的每个漫反射图像依次以不同的波长点。由于此限制，该系统是不充分捕捉快速IOSS，如在反射光谱由于神经元的活动20的变化。虽然氧合血红蛋白和氧合血红蛋白是活脑组织的主要发色团，其他的发色团，如细胞色素C氧化酶，黄素腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还有助于在可见光波长区域中的吸收系数。因此，C HbO2的 ，C HBR，C HBT，RSO 2，和b的估计值可以由轻微的发色团所影响。此外，该方法综合了沿深度方向的所有信息，因为它依赖于漫反射。因此，成像系统不执行深度分辨的测量。
有利的是，用于本系统中的算法也可以应用到由其他快速光谱成像技术，例如声光可调滤光器21捕获的多光谱漫反射图像，多孔径小透镜阵列与干涉滤波器22，并从RGB图像17，2光谱图像重建3。将所提出的算法和快速光谱技术一起使用是评估快速IOS成像以及用于临床情况的有希望的方法。
目前大多数多光谱脑成像技术主要集中在皮质血液动力学和组织代谢，如脑血容量，局部脑氧饱和度以及氧气的代谢率10,11,12,13,14。假设散射功率恒定在15,16之间 ，现有的几种方法评估了散射振幅。然而，由于病理生理变化导致的组织形态学改变和生物皮层组织活力的降低可影响生物散射体4的尺寸，5，6，7，8，9。因此，为了估计B的散射参数定量评价大脑的组织形态是很重要的。相对于现有方法，本技术的意义是它能够同时测量在脑血流和皮层组织形态学的时空变化的能力。
在未来的应用而言，这种算法可以用于监测大脑功能，生命体征，和生存能力各种脑部疾病的动物模型，如脑外伤，癫痫发作，中风和缺血皮层组织。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150-W halogen-lamp light source | Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan | LA-150SAE | |
| Light guide | Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan | LGC1-5L1000 | |
| Collecting lens | Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan | SH-F16 | |
| Interference filters l@ 500 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65088 | |
| Interference filters l@ 520 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65093 | |
| Interference filters l@ 540 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65096 | |
| Interference filters l@ 560 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #67766 | |
| Interference filters l@ 570 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #67767 | |
| Interference filters l@ 580 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65646 | |
| Interference filters l@ 600 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65102 | |
| Interference filters l@ 730 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65115 | |
| Interference filters l@ 760 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #67777 | |
| Motorized filter wheel | Andover Corporation, NH, USA | FW-MOT-12.5 | |
| 8-bit monochromatic CCD camera | THE IMAGINGSOURCE, Germany | DMK21BU618.H | |
| Video zoom lens | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | VZMTM300i | |
| Spectralon white standard with 99% diffuse reflectance | Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA | SRS-99-020 |
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