Summary
脳血行動態およびin vivoでのラット脳組織の光散乱特性の同時評価は、従来のマルチスペクトル拡散反射イメージングシステムを用いて実証されています。
Introduction
マルチスペクトル拡散反射率イメージングは、皮質組織に固有の光信号（IOSs）の空間的マップを取得するための最も一般的な技術です。形態学的変化によって誘導される光散乱性の光吸収の変化とによる皮質血行動態の散乱特性、低減又はミトコンドリアにおけるシトクロムの酸化に依存して吸収の変化、および変形：IOSsは、主に3つの現象に起因するインビボ脳で観察され1。
近赤外（NIR）スペクトル範囲（VIS）可視光の光を効果的に吸収され、生体組織によって散乱されます。 インビボで脳の拡散反射スペクトルは、吸収および散乱スペクトルによって特徴づけられます。換算散乱係数は単調散乱スペクトルの展示にVIS-に-NIR波長範囲の結果で脳組織のs ' を μより長い波長で小さい大きさをINGの。等価散乱係数μスペクトルS「（λ）は、μSなどのべき乗則関数2、3の形態であると近似することができる」（λ）×λ-bを =。散乱電力Bは、組織2,3生体内生物学的散乱体の大きさに関連しています。組織及び皮質生体組織の生存率の減少の形態学的変化は、生物学的散乱体4、5、6、7、8、9の大きさに影響を与えることができます。
マルチスペクトル拡散反射結像光学系は、容易白熱リチウムから構築することができますGHTソース、簡単な光学部品、及びモノクロ電荷結合素子（CCD）。したがって、様々なアルゴリズムおよびマルチスペクトル拡散反射撮像のための光学系が皮質血行動態および/または組織形態10、11、12、13、14、15、16、17、18を評価するために使用されてきました。
この資料に記載された方法は、血行動態及び従来のマルチスペクトル拡散反射イメージングシステムを用いて、in vivoでのラット脳組織の光散乱特性の両方を可視化するために使用されます。代替技術に比べて、この方法の利点は、脳の血行動態および皮質組織の両方における時空間変化を評価する能力です形態学だけでなく、様々な脳機能障害の動物モデルへの適用。したがって、この方法は、外傷性脳損傷、てんかん発作、脳卒中、および虚血の調査のために適切であろう。
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Protocol
動物のケア、準備、および実験プロトコルは、東京農工大学の動物研究委員会によって承認されました。この方法のために、ラットは、食物および水を自由に摂取して、制御された環境（24℃、12時間の明/暗サイクル）に収容されています。
従来のマルチスペクトル拡散反射イメージングシステムの構築1。
- マウントの中心波長を有する9つの狭帯域光干渉フィルタ500、520、540、560、570、580、600、730、及び電動フィルタホイールのフィルタ孔760 nmでした。
- 広帯域白色光源、狭帯域干渉フィルタの上記セット、ライトガイド、集光レンズ、ビデオズームレンズ、及びモノクロCCDカメラで電動フィルターホイールを使用して、マルチスペクトル画像化システムを構築します。 図 2に示される光学部品のレイアウトは、目のために参照することができます構築手順です。
注：照明の角度は約45°で試料表面に対してです。 - 干渉フィルター、光ガイド、及び集光レンズを介して試料の表面を照明するハロゲンランプ光源をオンにします。
- CCDカメラの動作するソフトウェアを開きます。
2.動物の準備
注：このプロトコルでは、ラットは、将来の実験のために使用されていなかった、それはマルチスペクトル画像の測定直後に殺しました。
- 管を麻酔機の出口ポートに誘導室の入口ポートを接続します。第二管を麻酔機の入口ポートに誘導チャンバーの出口ポートを接続します。
- 誘導室にラットを置き、5.0％イソフルランで麻酔を誘導します。ラットは、つま先のピンチに応答しないような深さで麻酔を維持します。 L麻酔機にロータリーノブを使用して2.0％イソフルランにower。
- 定位フレームにラットの頭を固定してください。定位フレームに麻酔のためのマウスピースを取り付けます。
- 管を麻酔機の出口ポートにマウスピースの入口ポートを接続します。管を麻酔機の入口ポートにマウスピースの出口ポートを接続します。
- 皮膚表面が表示されるまで、バリカンを使用して将来の切開部位を越えて頭部を剃ります。
- 外科用メス使用頭部の正中線に沿って約20mm長い縦切開を行う（ 図1（a）参照 ）および皮下結合組織を露出させる（ 図1（b）参照 ）。
- 鋭いキュレットまたはペンチを使用して、皮下結合組織を除去し（ 図1（c）参照 ）頭蓋骨を露出させるためにヘッドの両側にそれを引っ張ります。
- 頭蓋内sutur頭蓋骨上の楕円溝を掘ります（冠状縫合、矢状縫合、およびラムドイド縫合）を、高速ドリルを用いて行った（ 図1（d） ）。
- 高速ドリルを使用して溝の中の骨をゆっくりと均一に掘削します。
- 脳血管が出現した後、骨の太さと強度を推定するために、狭窄した頭蓋骨の表面を軽く押す。間引かれた頭蓋骨領域が容易に押し下げられる場合、高速ドリルで頭骨の縮小を終了する。
- 狭窄した頭蓋骨の楕円形の境界線を、かぎ針の先端または小さな外科用はさみを用いて短く切る。
- 細い頭蓋骨を脳の表面からゆっくりと、やさしくピンサーを使って外す。
- 生理食塩水で頭蓋の窓を静かに浸し、厚さ約0.1mmの透明なガラス板で覆う。
3.インスピレーション酸素の割合を調節する
注：呼吸条件ンは、吸入酸素（のFiO 2）の割合を調節することによって変更することができます。
- チューブを使用して、別のY字管コネクタ（コネクタ2）の第1のポートにY字管コネクタ（コネクタ1）の第1ポートを接続します。
- チューブコネクタ1の第2のポートにマウスピースの入口ポートを接続します。
- チューブを用いて、酸素濃度監視装置にチューブコネクタ1の第3ポートに接続。
- 管を、麻酔機の出口ポートにチューブコネクタ2の第2ポートを接続します。
- チューブを使用して、ガス混合装置の出口ポートにチューブコネクタ2の第3のポートを接続します。
- チューブを用いて5％CO 2ガスボンベ-高圧95％O 2へのガス混合装置の一つの入口ポートを接続します。
- チューブを用いて5％CO 2ガスボンベ-高圧95％のN 2へのガス混合装置の他の入口ポートを接続します。
- Oガスの流量を変更しますf O 2およびN 2をガス混合装置の回転ノブを使用して測定する。
- 酸素濃度モニタ装置を使用してFiO 2を確認し、調整する。
4.マルチスペクトル拡散反射像の取得
- 参照画像の取得
注：この実験で使用される光源、光ファイバー、検出器などの光学部品は、独自のスペクトル特性を持っています。したがって、これらの成分を通過する光の強度は、基準画像として記録されるべきである。基準画像は、光源からの光で照明された標準的な白色ディフューザで撮影された画像である。- ステージ上に標準の白色ディフューザーを水平に置きます。
- 鏡筒のズームリングを回して、白いディフューザーの表面にカメラのレンズを合わせます。
- カメラからの適切な値を選択して、カメラの積分時間を調整します。ドロップダウン積分時間のリストをカメラのオペレーティングソフトウェアの光の最大量が最大カウントの約75％である信号を生成するようになっています。画素値のヒストグラムを見ながら、信号強度レベルが最大カウントの約75％になるまで、積分時間を調整します。
- ファイルに画像を保存するために、ファイルメニューから「保存」コマンドを選択します。
- フィルタホイールを回転させることにより、フィルタの位置を変更します。
- 上述した方法に従って、他の波長の画像を保存します。ファイル名には、サンプルと使用波長（ 例えば、W500、W520、W540 ... W760）を特定すべきです。
- サンプル画像の取得
注：9つの波長で露出したラット脳の拡散反射光強度の画像が捕捉され、同一の取得条件を用いて、パーソナルコンピュータのハードドライブに保存されています。- 静かにRを配置ステージ上では、ゆっくりとカメラがラット脳の表面に集中できるように、ステージレベルを調整します。
- ファイルに画像を保存するために、ファイルメニューから「保存」コマンドを選択します。
- フィルタホイールを回転させることにより、フィルタの位置を変更します。
- 上述した方法に従って、他の波長の画像を保存します。ファイル名には、サンプルと波長（ 例えば、R500、R520、R540 ... R760）を特定すべきです。
- 暗い画像の取得
注：CCDカメラは、電気信号に応答して光強度を生成することができます。しかし、光が検出器に入らない場合であっても、原因の電気回路及び検出器のノイズに若干の出力があります。これは、暗電流ノイズと呼ばれています。正確に光の分光強度を測定するため、暗電流成分は、暗画像として記録し、次いで測定信号から減算されるべきです。暗い画像はイメージテイクですブロックされた光路を有するn。- ハロゲンランプ光源をオフにします。
- 遮蔽板を用いたCCDカメラシステムの光路を遮断します。
- ファイルに画像を保存するために、ファイルメニューから「保存」コマンドを選択します。ファイル名は、試料（ 例えば、ダーク）を特定すべきです。
5.ヘモグロビン含有量および光散乱パラメータの可視化
注：マルチスペクトル拡散反射画像のセットは、パソコンのハードドライブに保存し、オフラインで分析されます。 9つの波長（500、520、540、560、570、580、600、730、760 nm）におけるマルチスペクトル拡散反射画像のモンテカルロシミュレーション19によって補助重回帰分析は、2つの次元を視覚化するために行われます酸化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、総ヘモグロビン濃度、局所脳酸素飽和度、及びスキャットのマップ電源をtering。詳細なアルゴリズムは文献17、18に掲載されました。
- 基準画像と各波長でのサンプル画像の両方から暗画像を差し引きます。
- 各波長λにおける参照画像がサンプル画像を正規化します。拡散反射画像Rとして正規化された画像を扱います。
- 各波長λでの拡散反射画像Rの逆数の対数をとることによって、吸光度（または光学密度）画像Aを計算します。
（1） - y平面脳表面について得られた構造情報を示し、zは γ軸スペクトル情報を示す- xは 、それらの波長のオーダーで吸光度画像を積層した三次元マトリックスを生成します。
- PE座標各XYでの吸光度スペクトルA（λ）は、重回帰分析をrform。
- ステップ5.5の独立変数と従属変数とHBO（λ）ε酸素化ヘモグロビンのモル吸光係数スペクトル及び脱酸素化ヘモグロビンεのHBR（λ）として吸光度スペクトルA（λ）を使用する（ のHbOεの値を公開（λ）そしてεHBR（λ））を 表1に示します。
- 3重回帰係数HBO、HBR、0の二次元マップ（画像）を確認。
- 順HBO、HBR、及び0に重回帰係数の画像を積層した三次元マトリックスを生成します
- 次の実験式を用いて座標酸素化ヘモグロビン濃度C HBO、脱酸素化ヘモグロビン濃度C HBRを計算し、多重回帰のセットからの散乱電力Bは、それぞれXYでHBO、HBR、及び0係数 （彼は、βの値HBO、I、βHBR、I、およびβ0、I（I = 0,1,2,3）は、表2に提供されます）。
（2） 
（3）
（4） - 酸素化ヘモグロビン濃度C HBO、脱酸素化ヘモグロビン濃度C HBR、散乱電力Bの二次元マップ（画像）を確認。
- 各xにおけるC のHbO及びC HBRを加算することにより総ヘモグロビン濃度C HBTの二次元マップを計算- y座標 。
- 各xにおける総ヘモグロビン濃度C HBTによって酸素化ヘモグロビン濃度C のHbOを分割して局所脳酸素飽和度RSO 2の二次元マップを計算- y座標 。
（1） 
（2） 
（3）
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Representative Results
インビボラットの脳から得られた拡散反射の代表的なスペクトル画像を図3に示す.500,520,540,560,570,580nmの画像は、大脳皮質の血管の緻密なネットワークを明瞭に視覚化する。 600,730,760nmの画像で観察される血管と周囲組織との間のコントラストの低下は、より長い波長およびNIR波長でのヘモグロビンによる光のより低い吸収を反映する。
図4は、酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、全ヘモグロビン濃度、局所脳酸素飽和度、および散乱力についての暴露されたラット脳の代表的な推定画像を示す。 図3のより短い波長の拡散反射像から予想されるように、血液中の全ヘモグロビン濃度SEL領域は、周囲の組織の領域におけるよりも高いです。一方、細動脈における酸素化ヘモグロビン濃度は動脈血中のヘモグロビンは、はるかに酸素静脈血よりもあることに起因する静脈内のものよりも高いです。したがって、細動脈及び細静脈の分布は、明らかに局所酸素飽和度の推定画像に区別することができます。
500 nmのR（500）、酸素化ヘモグロビンC HBO、脱酸素化ヘモグロビンC HBR、総ヘモグロビンC HBTの濃度、局所脳酸素飽和濃度の濃度で拡散反射するためのFiO 2の変化中に露出ラット脳の代表的な推定画像RSO 2、及び散乱電力Bは 、図5に示されています。 RSO 2の値は、高酸素条件下で増加しました無酸素状態の誘導後に顕著に減少した。 bの値は無酸素症の発症から呼吸停止までの間にわずかに増加したが、無酸素症発症後5分から30分にかけて連続的に減少した。 bの値におけるこれらの変化は、脳における組織生存能力の喪失によって誘発される細胞および細胞下構造の膨張および収縮などの形態学的変化を示した。
図1：ラット大脳皮質の外科的曝露におけるステップ。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：管理麻酔のための実験装置の概略図と酸素吸入の割合を変更します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： インビボラット脳から得られた500、520、540、560、570、580、600、730、および760 nmでの代表的なマルチスペクトル拡散反射イメージ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：露出ラット脳の代表的な推定画像。 <酸化ヘモグロビンC のHbOの強い>（A）の濃度、脱酸素化ヘモグロビンCのHBr（b）の濃度は、総ヘモグロビンC HBTの（c）の濃度は、（d）の局所脳酸素飽和度RSO 2、および（e）散乱電力B。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：のFiO 2の変更中に露出ラット脳の代表的な結果。 500 nmのR（500）、酸素化ヘモグロビンC のHbOの濃度、濃度で拡散反射するためのFiO 2の変化の間のin vivoラット皮質組織の画像脱酸素化ヘモグロビンC HBR、総ヘモグロビンC HBT、局所脳酸素飽和RSO 2の濃度、及び散乱電力Bの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 波長λnmの | ε のHbO（λ） | HBR（λ）ε |
| 500 | 113.03712 | 112.6548 |
| 520 | 130.69296 | 170.58384 |
| 540 | 287.4744 | 251.5968 |
| 560 | 176.11128 | 290.4552 |
| 570 | 240.2784 | 243.3888 |
| 580 | 270.5616 | 199.908 | 600 | 17.28 | 79.25688 |
| 730 | 2.106 | 5.95188 |
| 760 | 3.1644 | 8.36201 |
表1：ε のHbOの値とεHBOが重回帰分析に使用しました。各波長λでの酸化ヘモグロビンε のHbO及び脱酸素化ヘモグロビンε のHBrのモル吸光係数です。
| 私 | βHBO、I | βHBR、I | βのB、I |
| 0 | -8.3302 | -5.85271 | -0.76587 |
| 1 | 4405.877 | -143.23 | 53.34134 |
| 2 | 2740.622 | 3798.067 | 124.4656 |
| 3 | -4.40454 | -2.81699 | -1.36919 |
表2：βHBO、I、βHBRの値は、I、およびβ0、I（I = 0,1,2,3）C HBO、C HBR、及びBの実験式で使用されます。これらの実験式から誘導されるC のHbO及びC HBRの単位は、44％のヘマトクリットの読み取りと全血のヘモグロビン濃度は、ヘモグロビンの100％の体積濃度であると解釈された体積濃度、であることに留意されたいです。ヘモグロビンconcentrのための実験式ationsは光輸送19のモンテカルロシミュレーションにより算出された拡散反射スペクトルから誘導することができます。実験式の導出のための詳細な方法は、文献17,18に記載されています。
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Discussion
このプロトコルの中で最も重要なステップは、頭蓋窓を作るために薄くなった頭蓋骨領域の除去です。これは予期せぬ出血を避けるために、慎重に行われるべきです。この工程は、高い精度で反射率画像を拡散多重スペクトルの高品質を得るために重要です。可能な場合は実体顕微鏡の使用は、外科的処置のために推奨されます。ゼラチンスポンジの小片は、止血のために便利です。
この資料に記載された光学系は、光源の前方に位置する干渉フィルタを通して単色光を通過させます。これは、ビデオカメラのレンズやCCDカメラの前にフィルタホイールを配置することによって修飾することができます。ただし、この場合、異なる厚さを有する干渉フィルタを使用する場合の焦点面を可変することができ、これは、画像品質の劣化の原因となります。記録電極が挿入された場合には頭蓋窓のガラス板を除去する必要がありますこのような電気局所電場電位の測定値としての電気生理学的測定のための皮質組織へ。この場合、撮像システムは、皮質表面から望ましくない鏡面反射を検出することができます。この問題は、クロスニコル配向と偏光板のセットを使用することによって回避することができます。
車輪のフィルタ位置を機械的に変更されるので、この記事で実証従来のマルチスペクトル撮像装置は、多少時間がかかる使用することです。これは、撮像システムは、異なる波長の時点で、各拡散反射画像を順次撮像することを意味します。この制限のため、このシステムは、神経活動20による反射スペクトルの変化として、高速IOSsを捕捉するには不十分です。酸化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンは、シトクロムcオキシダーゼ、フラビンとして生きている脳組織における主な発色団、他の発色団は、ですが、アデニンジヌクレオチドおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、可視波長領域における吸収係数に寄与する。したがって、C HBO、C HBR、C HBT、RSO 2、及びBの推定値は、マイナーな発色団の影響を受けることができます。それは拡散反射に依存しているので、また、このアプローチは、深さ方向に沿ったすべての情報を統合します。したがって、撮像システムは、深さ分解測定を行いません。
本発明のシステムに使用されるアルゴリズムはまた、音響光学可変フィルタ21のような他の迅速な分光イメージング技術によって捕捉マルチスペクトル拡散反射画像に適用することができることが有利であり、干渉とマルチ開口レンズレットアレイ22をフィルタリングし、そしてRGB画像17、2からスペクトル再構成画像3。提案されたアルゴリズムと高速スペクトル技術を併用することは、高速IOSイメージングを評価する有望なアプローチであり、臨床状況での使用にも有望である。
今日までの大部分のマルチスペクトル脳画像技術は、大脳の血液量、局所的な脳酸素飽和度、および酸素の脳代謝速度などの皮質血行動態および組織代謝に主に集中していた10,11,12,13,14。いくつかの既存のアプローチは、散乱パワーが一定であるとの仮定の下で散乱振幅を評価する15,16。しかし、病態生理学的変化および生存皮質組織における生存率の低下による組織の形態学的変化は、生物学的散乱体のサイズに影響を及ぼす可能性がある4、5、6、7、8、9。したがって、脳の組織形態を評価するために定量的にBの散乱パラメータを推定することが重要です。既存の方法に対する本技術の重要性は、同時に脳の血行動態及び皮質組織形態の時空間変化を測定する能力です。
将来のアプリケーションの面では、このアルゴリズムは、このような外傷性脳損傷、てんかん発作、脳卒中、および虚血など様々な脳障害の動物モデルの皮質組織で脳機能、バイタル、および生存度を監視するために使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150-W halogen-lamp light source | Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan | LA-150SAE | |
| Light guide | Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan | LGC1-5L1000 | |
| Collecting lens | Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan | SH-F16 | |
| Interference filters l@ 500 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65088 | |
| Interference filters l@ 520 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65093 | |
| Interference filters l@ 540 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65096 | |
| Interference filters l@ 560 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #67766 | |
| Interference filters l@ 570 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #67767 | |
| Interference filters l@ 580 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65646 | |
| Interference filters l@ 600 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65102 | |
| Interference filters l@ 730 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #65115 | |
| Interference filters l@ 760 nm | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | #67777 | |
| Motorized filter wheel | Andover Corporation, NH, USA | FW-MOT-12.5 | |
| 8-bit monochromatic CCD camera | THE IMAGINGSOURCE, Germany | DMK21BU618.H | |
| Video zoom lens | Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan | VZMTM300i | |
| Spectralon white standard with 99% diffuse reflectance | Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA | SRS-99-020 |
References
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