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का उपयोग कर इन विट्रो लाइव सेल इमेजिंग Chemotherapeutics लिपिड आधारित नैनोकणों द्वारा दिया का पता लगाने के लिए

Published: November 1, 2017 doi: 10.3791/55405
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus MC

Summary

लाइव सेल इमेजिंग गतिशील प्रक्रियाओं कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । स्थिर कोशिकाओं की परीक्षा केवल स्थैतिक चित्र प्रदान करता है, जो गलत व्याख्या और प्रक्रिया के बारे में भ्रम की वजह बन सकता है । यह काम एक विधि के अध्ययन के लिए, दवा जारी करने के लिए, और liposomal नैनोकणों के intracellular स्थानीयकरण जीवित कोशिकाओं में प्रस्तुत करता है ।

Abstract

पारंपरिक इमेजिंग तकनीक सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं । हालांकि, यह जानकारी एक अंयथा गतिशील प्रणाली में स्थिर छवियों पर आधारित है, और लगातार चरणों आसानी से अनदेखी या गलत व्याख्या कर रहे हैं । लाइव सेल इमेजिंग और समय चूक माइक्रोस्कोपी, जिसमें रहने वाले कोशिकाओं घंटे या एक अधिक या कम निरंतर फैशन में भी दिन के लिए पीछा किया जा सकता है, इसलिए बहुत जानकारीपूर्ण रहे हैं । यहां वर्णित प्रोटोकॉल डॉक्सोरूबिसिन (dox) के जीवित कोशिकाओं में प्रसव के बाद कीमोथेरेपी नैनोकणों के भाग्य की जांच के लिए अनुमति देता है । Dox एक intercalating एजेंट है कि अपने nanocarrier से जारी किया जाना चाहिए के लिए जैविक रूप से सक्रिय हो गया है । दो दशकों से अधिक के लिए अपने नैदानिक पंजीकरण के बावजूद, इसके ऊपर, टूटने, और दवा जारी अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । यह लेख परिकल्पना की पड़ताल करता है कि लिपिड आधारित नैनोकणों ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है और धीरे से नीचा कर रहे हैं । स्पर्म dox नाभिक को translocated है । निर्धारण कलाकृतियों को रोकने के लिए, लाइव सेल इमेजिंग और समय चूक माइक्रोस्कोपी, इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में वर्णित, लागू किया जा सकता.

Introduction

कोशिका-कोशिका सहभागिता, अंतर-और intracellular परिवहन, साइटोटोक्सिक यौगिक के रूप में एक जैविक प्रक्रिया का पालन करने की क्षमता, और जीवित कोशिकाओं और ऊतकों में एकल अणुओं के प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत, पिछले पर काफी रुचि प्राप्त की है दशक, के रूप में यह "वास्तविक समय के अतिरिक्त आयाम प्रदान करता है." इस पांडुलिपि में नैनोकणों (dox-एनपी) में शामिल मुक्त dox और dox के intracellular भाग्य का पालन करने के लिए एक विधि बताई गई है ।

नैनोकणों कुछ कैंसर के इलाज के लिए दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है । Dox-एनपी एड्स से संबंधित Kaposi सार्कोमा, उन्नत डिंबग्रंथि और स्तन कैंसर के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया है, और एकाधिक मायलोमा1। यह पहली liposomal नैनोकणों विकसित और नैदानिक सेटिंग में शुरू की एक थी । नि: शुल्क फार्म, dox, काफी रक्त परिसंचरण से मंजूरी दे दी है, अपनी क्षमता सीमित करने के लिए पर्याप्त मात्रा में ट्यूमर साइट तक पहुंचने । इसके अलावा, उपचार गंभीर और खुराक के साथ है-ऐसे stomatitis और दिल की विफलता के रूप में सीमित पक्ष प्रभाव, । जब pegylated liposomal में समझाया नैनोकणों संचलन समय बढ़ जाती है मिनट से दिनों के लिए2। कोलेस्ट्रॉल युक्त liposome के इस प्रकार के काफी स्थिर है और इस स्थिरता encapsulated दवा के फार्माकोकाइनेटिक्स निर्धारित करता है ।

हालांकि, इस कठोरता एक नकारात्मक पक्ष है । ट्यूमर कोशिकाओं की दिशा में एक यौगिक की साइटोटोक्सिक क्षमता पहले विट्रो मेंमूल्यांकन किया गया है, और यह दिखाया गया है कि dox साइटोटोक्सिक परख3,4में dox-एनपी से अधिक शक्तिशाली है । यह परिकल्पना की गई थी कि वाहक की स्थिरता दवा की रिहाई और सेलुलर को आगे बढ़ाने से रोकती है, और यह इस घटना की जांच करने के लिए सार्थक है । आंतरिक liposomal गुण, रक्त प्रवाह में आक्रामक तत्वों पिछले करने के लिए बनाया गया है और ट्यूमर को बरकरार साइट तक पहुंचने के लिए, लक्ष्य स्थल पर साइटोटोक्सिक घटक (यानी, dox) की बिगड़ी जैव उपलब्धता के परिणामस्वरूप (यानी, ट्यूमर सेल नाभिक) । हालांकि Dox-NP hardily मुक्त रूप की तुलना में प्रतिक्रिया में सुधार, यह अभी भी नैदानिक मूल्य की थी, के रूप में encapsulation काफी cardiotoxic प्रभाव कम5। निंनलिखित वर्षों में, अंय यौगिकों नैनो-वाहक6में समझाया गया था । इसके अलावा, वाहक को संशोधित करने ट्रिगर दवा रिलीज (यानी, ट्यूमर साइट पर) के परिणामस्वरूप, लेकिन रक्त परिसंचरण7,8में स्थिरता बनाए रखा । वर्षों से जांच और नैदानिक उपयोग के बावजूद Dox-एनपी जैसे nanocarriers के intratumoral फाटे अभी भी पूरी तरह स्पष्ट नहीं हो सके हैं. हाल ही में एक प्रकाशन में यह दिखाया गया कि nanoparticle को पूरी तरह से लिया जाता है जबकि dox lysosomes9में फंसा रहता है ।

एक nanoparticle और नशीली दवाओं के रिलीज के सेलुलर एक गतिशील प्रक्रियाओं है कि सबसे अच्छा रहते सेल इमेजिंग का उपयोग कर निगरानी की जा सकती हैं । इसके अलावा, शास्त्रीय प्रोटोकॉल, जो कोशिकाओं में गर्मी और उसके बाद तय कर रहे हैं, गलत परिणाम दे अगर निर्धारण liposomal वाहक नष्ट कर देता है और कलाकृतियों का परिचय कर सकते हैं । लाइव सेल इमेजिंग के लिए मुख्य आवश्यकता दृश्य है, अधिमानतः प्रतिदीप्ति द्वारा, वांछित प्रक्रिया की । कुछ यौगिकों, dox की तरह, एक आंतरिक लाल प्रतिदीप्ति है । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट मार्करों वाहक में पेश किया जा सकता है, और सेल organelles लाइव सेल मार्कर का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । इस तरह, मापदंडों की एक सरणी, वाहक, दवा रिहाई, और वाहक और दवा के सेलुलर स्थानीयकरण की तरह, छवि और विश्लेषण किया जा सकता है । यहां, एक विधि वर्णित है जिसमें dox और dox-NP के कई ट्यूमर कोशिकाओं में सेलुलर भाग्य वास्तविक समय में पीछा किया जाता है । इसके अलावा, इस विधि को आसानी से लक्षित (उदा, नैनोकणों आरोप लगाया के लिए आदर्श स्थितियों बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है10) और ट्रिगर (जैसे, अतिताप7) दवा रिलीज ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. वडा

  1. इमेजिंग चैंबर, जो दो भागों के होते है इकट्ठा ।
    1. जगह एक 25 मिमी कवर ग्लास (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a -1) चैंबर के निचले भाग पर (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a -2) और ऊपरी भाग को निचले भाग में पेंच (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > figure 1a -3). कस भी मत करो, जैसे कांच टूट सकता है । आटोक्लेव पूरे चैंबर (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a -4).
  2. पूरक द्वारा कोशिका संस्कृति माध्यम तैयार Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम (DMEM) बिना phenol लाल के साथ 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और 1 मिमी एल-glutamine के तहत बाँझ स्थितियों. दुकान पर 4 & #176; ग र उष्ण ते ३७ & #176; ग से पहले प्रयोग.
  3. सेल संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं संवर्धन कुप्पी में मानक सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग कर बनाए रखने.
    नोट: यहां, दो माउस सेल लाइनों, मेलेनोमा B16BL6 < सुप वर्ग = "xref" > 11 और लुईस लंग कार्सिनोमा (LLC), और दो मानव melanomas, BLM और 1F6 < सुप वर्ग = "xref" > 12 , का उपयोग किया गया.
  4. ३७ & #176; सी रात में फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में वजन और भंग जिलेटिन द्वारा ०.१% जिलेटिन बनाओ । समाधान को किसी ०.२२-& #181 के माध्यम से फ़िल्टर करके उसे निष्फल करें; m फ़ लि् टर और इसे 4 & #176 पर store; C.
< p class = "jove_title" > 2. प्लेट सेल

  1. एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में नसबंदी बैग से इमेजिंग चैंबर को हटा दें, ध्यान से चैंबर कस, और यह एक पेट्री डिश में जगह है ।
    नोट: संदूषण से बचने के लिए, एक पेट्री डिश में इमेजिंग चैंबर रखें जब तक चैंबर माइक्रोस्कोप के नीचे रखा जा सकता है ।
  2. कोट ०.१% बाँझ जिलेटिन की 1 मिलीलीटर के साथ इमेजिंग चैंबर के गिलास पर 20 मिनट के लिए ३७ & #176; ग र 5% सह 2 .
    नोट: यह बेहतर सेल अनुलग्नक की अनुमति देगा ।
  3. सेल संस्कृति कुप्पी से मध्यम निकालें (१.२ और १.३ कदम देखें), 1x पंजाबियों के साथ एक बार धोने, और अलग ०.२५% trypsin का उपयोग कर कोशिकाओं । सेल संस्कृति माध्यम जोड़कर trypsin को निष्क्रिय, कोशिकाओं को इकट्ठा, उंहें 5 मिनट के लिए १,१०० x g पर नीचे स्पिन, और सेल संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  4. पतला 20 & #181; l के साथ सेल सस्पेंशन के 20 & #181; l का trypan नीला (जो मृत कोशिकाओं द्वारा लिया जाएगा). एक hemocytometer का उपयोग कर रहने वाले और मृत कोशिकाओं की संख्या गिनती; मृत कोशिकाओं की संख्या 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
  5. महाप्राण जिलेटिन और प्लेट एक कमजोर पड़ने में कोशिकाओं है कि 24 घंटे के भीतर ७०% कवरेज की एक अधिकतम के लिए अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, एक कमजोर पड़ने का उपयोग करें 5 x 10 4 या 10 x 10 4 कोशिकाओं में 1 मिलीलीटर. कक्षों को 5% पर पालन करने की अनुमति दें सह 2 और ३७ & #176; ग के लिए 24 ज.
< p class = "jove_title" > 3. समय-चूक माइक्रोस्कोपी (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ )

< p class = "jove_content" > NOTE: यहां, एक कस्टम के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप-मंच धारक का इस्तेमाल किया गया था, हालांकि सबसे अधिक निर्माण के लिए जी सेल इमेजिंग कि कर रहे है के लिए मशीन की एक श्रृंखला की पेशकश इसके अलावा nanoparticulated दवा वितरण की जांच के लिए उपयुक्त है ।

  1. एक खुर्दबीन के नीचे प्रवाह, सेलुलर आकृतिक, और संदूषण के लिए कोशिकाओं का मूल्यांकन । सह 2 मशीन में चैंबर वापस प्लेस ।
    नोट: प्रवाह ७०% से अधिक नहीं होना चाहिए । यदि सेलुलर आकृति विज्ञान असंगत है ( यानी, कोशिकाओं का पालन नहीं करते हैं) या संदूषण का पता चला है, इमेजिंग चैंबर त्यागें ।
  2. पर स्विच ऑफ फोकल माइक्रोस्कोप (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -1), फ्लोरोसेंट बत्ती (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -2), और संगणक (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -3).
  3. उद्देश्य के लिए लेंस हीटर कनेक्ट और यह ३५ के लिए सेट & #176; ग (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -4 + insert).
  4. तैयार करने के लिए, जैसा कि < सुदृढ वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा 1b .
    नोट: इस इकाई में एक गरम अवस्था होती है (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 1b -1), सह 2 ट्यूबों के लिए एक संबंधक के साथ एक प्रवाह चरण (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b -2) और सह 2 जांच (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b -3), और एक लाल बंद पैच (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b -4). इस पैच को अस्थायी रूप से इकाई बंद करने के लिए उपयोग किया जाता है जब तक इमेजिंग चैंबर रखा जाता है ।
  5. माइक्रोस्कोप मंच पर मशीन इकाई जगह और में और बाहर प्रवाह सह कनेक्ट 2 ट्यूबों (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -5). खुला मुख्य सह 2 वाल्व (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -6) र विच पर सह 2 उसम (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -7) । जांच करें कि नियंत्रक के लिए सेट है 5% सह 2 .
    नोट: आर्द्रता के लिए, CO 2 एक humidifier (< सबल वर्ग = "xfig" > आरेख 1E -8) के माध्यम से गुजरता है । हाइपोक्सिया प्रयोगों के लिए, एक अलग ओ 2 नियामक (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -9) सेटअप में शामिल है.
  6. चरण तापमान सेट करने के लिए ३७ & #176; ग (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -10). अतिताप प्रयोगों के लिए, तापमान सेट करने के लिए ४२ & #176; C. गर्मी इकाई के चयनित तापमान और सह 2 प्रतिशत तक पहुंचने के लिए अनुमति दें ।
  7. मुख्य सह 2 मशीन से इमेजिंग चैंबर ले और सूक्ष्म कमरे में एक पेट्री डिश में चैंबर परिवहन ।
  8. जगह इमेजिंग चैंबर (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a -4) एक कस्टम में बनाया, ३५ मिमी व्यास स्टेज धारक (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a -5) और एक कस्टम-बनाया सील ढक्कन के साथ चैंबर बंद (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 1a -6).
    नोट: ढक्कन अनुमति देता है CO 2 पास करने के लिए और वाष्पीकरण और संदूषण रोकता है ।
    1. मशीन इकाई खोलें, इमेजिंग चैंबर के साथ लाल पैच की जगह, और इकाई बंद (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ). इस के रूप में तेजी से कोशिकाओं के नीचे ठंडा रोकने के रूप में संभव है । सुनिश्चित करें कि कोई केबल स्टेज और माइक्रोस्कोप के बीच फंस रहे हैं ।
  9. इकाई को acclimatize 30 min.
    10. के लिए छोड़ दें
  10. सॉफ्टवेयर खोलने के लिए और पराबैंगनीकिरण पर स्विच.
    नोट: यहां ४८८ एनएम आर्गन, ५४३ एनएम हीलियम-नियॉन, और ६३३-एनएम हीलियम-नियॉन पराबैंगनीकिरण का इस्तेमाल किया गया ।
  11. क्लिक करके एक नया डाटाबेस बना & #34; नया & #34; के अंतर्गत फ़ाइल टैब. नाम और डेटाबेस को सहेजें ।
  12. पर क्लिक करके कॉंफ़िगरेशन सेट करें & #34; Config & #34; के अंतर्गत प्राप्त करें टैब चुनें & #34; चैनल मोड & #34; और & #34; सिंगल ट्रैक & #34; एक एकल fluorophore या & #34 का मूल्यांकन करने के लिए; मल्टी ट्रैक & #34 कई fluorophores के लिए; fluorophore ( उदा., ५६० से ६१५ एनएम बैंड-पास फ़िल्टर के लिए dox और dox-NP से मेल खाती उपयुक्त बैंड-पास फ़िल्टर का चयन करें; प्रतिनिधि परिणाम देखें अधिक उदाहरण के लिए) । पटरियों में से एक में उज्ज्वल क्षेत्र चैनल का चयन करें.
  13. पर क्लिक करके स्कैन नियंत्रण सेट करें & #34; स्कैन & #34; मोल टैब के अंतर्गत. फ़्रेम का आकार सेट करें (१,०२४ x १,०२४), स्कैन गति (इष्टतम), स्कैन दिशा (8-bit, एकल), और स्कैन औसत (4) क्लिक करके & #34; मोड. & #34; pinhole (२०० & #181; m) सेट करें, लाभ और ऑफ़सेट ( उदा., ५८०, ७००, और ८३५; see < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ), और लेजर शक्ति (४८८ = 10%, ५४३ = १००%, ६३३ = १००%) by click & #34; चॅनेल. & #34;
  14. इन सेटिंग्स को क्लिक करके सहेजें & #34; Config & #34; कॉंफ़िगरेशन टैब में और उंहें कॉंफ़िगरेशन डेटाबेस में सहेजें ।
  15. पर क्लिक करके समय-चूक सेट कर & #34; बहु समय X & #34; (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 d ) मैक्रो टैब पर क्लिक करें & #34; एकल स्थान & #34;.
  16. कक्षों को फ़ोकस में रखने के लिए, क्लिक करके मैक्रो में स्वचालित फ़ोकस का चयन करें & #34; ऑटो फोकस. & #34;
    ध्यान दें: फोकस ६३३-एनएम लेजर एक संदर्भ बिंदु के रूप में कांच के प्रतिबिंब का उपयोग कर के साथ हासिल की है ।
  17. पर क्लिक करके सहेजी गई कॉंफ़िगरेशन लागू करें & #34; सिंगल ट्रैक & #34; या & #34; मल्टी ट्रैक, & #34; कॉन्फ़िगरेशन डेटाबेस में आवश्यक कॉन्फ़िगरेशन के लिए स्क्रॉल करना, समय अंतराल ( उदा , 15 min), स्कैन की संख्या ( उदा. , ९७) की स्थापना और क्लिक & #34; लोड Config. & #34;
    नोट: इन सेटिंग्स का उपयोग कर, ९७ x 15 मिनट की एक समय श्रृंखला = 24 एच किया जाएगा ।
  18. नाम समय-चूक म & #34; आधार फ़ाइल नाम & #34; और डेटाबेस (चरण ३.११ में किए गए) का चयन करें क्लिक करके & #34; इमेज डाटा बेस & #34; समय-चूक को बचाने के लिए । क्लिक करके एक अस्थाई फ़ोल्डर सेट करें & #34; Tmp छवि फ़ोल्डर । & #34;
    नोट: यदि सिस्टम रोकता है या किसी भी कारण के लिए क्रैश, छवियाँ इस फ़ोल्डर में स्थित हैं ।
  19. मशीन खोलने, इमेजिंग अंगूठी उठा, उद्देश्य के लिए विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ने के लिए, और के रूप में तेजी से संभव के रूप में इकाई बंद । फोकस और इमेजिंग चैंबर में एक स्थिति का चयन करें ।
    नोट: इस स्थिति में एक monolayer में कक्ष होते हैं, जिसमें ंयूनतम ७०% की प्रवाह के साथ, व्यक्तिगत कक्षों की इमेजिंग के लिए अनुमति होती है ।
  20. पृष्ठभूमि के लिए कॉन्फ़िगरेशन सेटिंग्स की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो सही ।
    नोट: बैकग्राउंड गेन या लेजर पावर को कम करके ठीक किया जा सकता है । (चरण ३.१७ देखें) और लोड (देखें चरण ३.१८) फिर से मैक्रो में सहेजा जा करने के लिए कॉन्फ़िगरेशन में कोई भी परिवर्तन की आवश्यकता है ।
    21. लामिना फ्लो कैबिनेट में
  21. , नि: शुल्क दवा या नैनोकणों की सांद्रता पर पतला करना 5 & #181; जी/एमएल ड्रग या ०.०५ & #181; सेल कल्चरल मीडियम में लिपिड्स का मॉल. एक ०.२२-& #181 के माध्यम से फ़िल्टर करें; m सिरिंज फिल्टर अगर दवा नैनोकणों बाँझ न हो.
  22. मशीन कक्ष खोलने के लिए, सील ढक्कन उठा, कोशिकाओं से मध्यम निकालें, पतला दवा के 1 मिलीलीटर जोड़ें/नैनोकणों, और इकाई के रूप में तेजी से बंद के रूप में ।
    23. कोशिकाओं पर फोकस
  23. और टाइम-चूक स्टार्ट करके & #34; स्टार्ट टाइम & #34; मल्टी टाइम में एक्स मैक्रो.
  24. यह देखने के लिए नियमित रूप से जांच करें कि क्या कक्ष अभी भी फ़ोकस में है या (चरण ३.१६ देखें) का उपयोग करें । कार्यक्रम स्वचालित रूप से समय-चूक डेटाबेस में बचाता है; प्रोग्राम चल रहा है, जबकि डेटाबेस बंद नहीं है ।
< p class = "jove_title" > 4. डेटा विश्लेषण

  1. मूल शोध प्रश्न के आधार पर, डेटा विश्लेषण के लिए ImageJ जैसे सॉफ़्टवेयर प्रोग्रांस का उपयोग करें (उदाहरण के लिए परिणाम अनुभाग देखें) ।

Representative Results

विभिंन मार्करों के साथ लेबलिंग liposomal वाहक पहले9बताया गया है । दूर-लाल dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine perchlorate के साथ लेबल वाहक (किया; Ex = ६४४ एनएम; Em = ६६५ एनएम) या हरा 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = ४९० एनएम; Em = ५१५ एनएम) इस पांडुलिपि में प्रस्तुत कर रहे हैं । सेलुलर समानताएं और liposomal में अंतर दिखाने के लिए, रिहाई, और intracellular स्थानीयकरण, कई ट्यूमर प्रकार का अध्ययन किया गया । ये दो माउस लाइनें, B16BL6 मेलेनोमा11 और लुईस फेफड़े कार्सिनोमा (LLC), और दो मानव melanomas, एक उच्च मेटास्टेटिक (BLM) और एक गैर मेटास्टेटिक (1F6) मेलेनोमा12,13शामिल हैं । सभी प्रयोगों में जीवित कोशिकाओं का प्रयोग किया गया. सभी प्रयोगों में, 5 µ जी/एमएल dox, 5 µ जी/एमएल dox-NP, या ०.०५ µmol की एकाग्रता 3 या 24 घंटे के लिए प्रशासित किया गया था मापा और नैनोकणों विश्लेषण (मुक्त, जारी, encapsulated, तनहा, या dox फार्म) में intercalated के रूप में भेजा गया । एक 40X (संख्यात्मक एपर्चर: १.३) तेल उद्देश्य लेंस का इस्तेमाल किया गया था, और इमेजिंग एक ४८८ एनएम आर्गन लेजर के साथ प्रदर्शन किया गया था (10%/0.2 मेगावाट बिजली) और एक ५०५ करने के लिए ५५० एनएम बैंड-पास फिल्टर के लिए CF-पीई और लाइसोसोमल मार्कर (एल एम)-ग्रीन । एक ५४३ एनएम हीलियम-नियॉन लेजर (100%/ ०.२ मेगावाट बिजली) और एक ५६० करने के लिए ६१५ एनएम बैंड-पास फिल्टर dox, dox-एनपी, और लाइसोसोमल मार्कर-लाल के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक ६३३ एनएम हीलियम-नीयन लेजर (100%/0.5 मेगावाट बिजली) और एक ६४० एनएम लंबी पास फिल्टर के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

अपने encapsulation की वजह से, इन विट्रो cytotoxicity, जैव उपलब्धता, और dox के फार्माकोकाइनेटिक्स काफी बदल रहे थे3,9,14. जब नि: शुल्क और encapsulated रूप में प्रशासित दवा की जैव उपलब्धता के बीच का अंतर चित्रा 3में प्रदर्शन किया है । Dox एक intercalating एजेंट है और साइटोटोक्सिक बनने के लिए कोशिका नाभिक में प्रवेश करना होगा । चित्रा 3 और संबंधित फिल्में 1 और 2 BLM कोशिकाओं के एक 3 एच समय चूक शो dox या dox-NP के साथ समान परिस्थितियों में इलाज किया । dox जोखिम के मिनट के भीतर, परमाणु DXR देखा जा सकता है (चित्र 3ए, फिल्म 1) और, एक कम लाभ (डालने) का उपयोग कर, नाभिक में intercalating देखा जा सकता है । इसके विपरीत, जब Dox-NP के संपर्क में, intracellular DXR शायद ही इस समय-सीमा के भीतर दिखाई देता है (चित्र 3 बी, मूवी 2) । केवल photomultiplier लाभ में वृद्धि करके, कोशिका में DXR (insert) मनाया जा सकता है । ImageJ का उपयोग करते हुए, cytoplasmic और नाभिकीय DXR के पिक्सेल घनत्व का विश्लेषण किया गया । के रूप में कोशिकाओं को गति में समय चूक मूल्यांकन के दौरान कर रहे हैं, यह उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के साथ फ्लोरोसेंट गठबंधन महत्वपूर्ण है । यह व्यक्तिगत कोशिकाओं पर नज़र रखने और XY स्थिर ImageJ में विशिष्ट plugins का उपयोग बहाव की संभावना प्रस्तुत करता है । चित्रा 3में प्रस्तुत विश्लेषण में, उज्ज्वल क्षेत्र छवि कोशिका (ठोस लाइन) और नाभिक (बिंदीदार रेखा) के आसपास ब्याज (ROI) के एक क्षेत्र को आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ImageJ में रॉय के मैनेजर को मेन्यू आइटम में पाया जा सकता है विश्लेषण & #62; tools & #62; रॉय मेनेजर. इन ROIs फ्लोरोसेंट छवि में उपयोग के लिए मेनू मद का उपयोग करके पिक्सेल घनत्व का विश्लेषण कर रहे है विश्लेषण & #62; माप । नाभिक में पिक्सेल घनत्व के बीच अंतर (चित्रा3) और कोशिका (चित्रा 3d) dox-या dox-NP-इलाज कोशिकाओं की पुष्टि करता है क्या छवियों में देखा जाता है । इसके अलावा, कोशिकाओं dox या dox-NP, जिसके बाद यौगिक माध्यम से प्रतिस्थापित किया गया था और तुरंत photomultiplier लाभ (चित्रा 4) की वृद्धि की संवेदनशीलता के साथ imaged के साथ 24 एच के लिए मशीन थे । अंय सेटिंग्स, जैसे लेज़र पावर, ऑफ़सेट, pinhole, और छवि प्रदर्शन, समान थे । Dox-इलाज कोशिकाओं की तुलना में Dox-NP-इलाज में कम DXR संकेत हड़ताली है । ७०० के लाभ का उपयोग करते हुए, DXR Dox-NP-इलाज कोशिकाओं में दिखाई देता है, जबकि Dox की छवि पहले से ही उजागर हो जाता है । इस सरल इन विट्रो प्रयोग मुक्त बनाम encapsulated दवा की जैव उपलब्धता में एक महत्वपूर्ण अंतर visualizes ।

जब कोशिकाओं को लगातार Dox-NP के लिए 24 घंटे के लिए उजागर कर रहे हैं, DXR समय के साथ बनाता है, के रूप में चित्रा 5 और फिल्म 3 और 4 में दिखाया गया है । कोशिका में सिग्नल बढ़ जाता है, और बाद में, DXR भी नाभिक में intercalated पाया जाता है । इन टिप्पणियों पिक्सेल घनत्व रेखांकन (चित्रा 5B) द्वारा पुष्टि कर रहे हैं । मापा cytoplasmic पिक्सेल घनत्व intracellular वितरण में अंतर की वजह से 1F6 कोशिकाओं की तुलना में BLM में कम है । 1F6 कोशिकाओं में DXR जबकि सेल भर में वितरित किया जाता है, BLM कोशिकाओं में DXR नाभिक के करीब एक organelle में अधिक ध्यान केंद्रित है (चित्रा 5C) ।

इसलिए, विभिन्न सेल लाइनों (चित्रा 6) में दवा और वाहक के स्थानीयकरण की जांच की गई । कोशिकाओं Dox के साथ 24 घंटे के लिए मशीन-NP/ उज्ज्वल क्षेत्र छवि, कोशिका झिल्ली (ठोस लाइन) और नाभिक (बिंदीदार रेखा) के एक ओवरले का उपयोग तीन अलग सेल लाइनों के फ्लोरोसेंट छवि में तैयार किया गया था । यह यहां दिखा दिया है कि वाहक, के साथ लेबल किया है, DXR के रूप में एक ही cytoplasmic पैटर्न निंनानुसार: BLM में नाभिक के करीब एक organelle में केंद्रित है, LLC में पूरे नाभिक के आसपास, और बेतरतीब ढंग से कोशिका कोशिकाओं में B16BL6 भर में बिखरे हुए । नाभिक में, केवल DXR और कोई नहीं किया देखा जा सकता है, जारी dox का संकेत है । photomultiplier लाभ को कम करने से, व्यक्तिगत सेलुलर DXR और वाहक युक्त बुलबुले, साथ ही साथ CF-पीई (आंकड़े घमण्ड और 6C), देखा जा सकता है के साथ लेबल ।

Cytoplasmic छोटे बुलबुले में DXR sequesters, और कोशिकाओं को हरे या लाल रंग में एक जीवित सेल लाइसोसोमल मार्कर के साथ लेबल थे । इन lysosomes के मूवमेंट को कोशिकाओं (Movie 5) में फॉलो किया जा सकता है । Cytoplasmic DXR और इन संरचनाओं के भीतर nanocarrier colocalize, और DXR पैटर्न में सेलुलर अंतर है, जैसा कि चित्रा 6में देखा गया है, यहां समझाया गया है । Lysosomes बेतरतीब ढंग से B16BL6 में कोशिका भर में वितरित कर रहे हैं और BLM कोशिकाओं (चित्रा 7A) में नाभिक के बगल में स्थित हैं । ImageJ का उपयोग करके, lysosome में DXR और वाहक के बीच colocalization की गणना की गई (आरेख 7B) । रंग छवियों द्विआधारी बनाया गया था (प्रक्रिया & #62; बाइनरी & #62; बाइनरी बनाओ) और, colocalization प्लग का उपयोग कर (विश्लेषण & #62; colocalization), एक colocalization छवि DXR के साथ किया गया था । यह दोनों छवियों के colocalized पिक्सल का प्रतिनिधित्व सफेद पिक्सल के साथ, एक हरे रंग की सफेद रंगीन छवि बनाता है । के माध्यम से मेनू मद प्रक्रिया & #62; बाइनरी & #62; बाइनरी बनाओ, सफेद पिक्सल अलग और काले पिक्सल में बदल दिया जाएगा, जिसमें से पिक्सेल घनत्व मापा जाता है (विश्लेषण & #62; माप) । इसके बाद, एक colocalization छवि इस DXR-किया छवि और लाइसोसोमल मार्कर (एल एम) और पिक्सेल घनत्व मापा के द्विआधारी छवि के बीच किया गया था । colocalization डेटा DXR-दिड और DXR-दिड/लाइसोसोमल मार्कर (फिगर 7C) के लिए पिक्सल पॉजिटिव का प्रतिशत है । कि वाहक, CF-पीई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किया था के साथ लेबल, lysosome में स्थित है भी चित्र 7dमें दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: उपकरणों और उपकरण सेटअप. A) इमेजिंग चैंबर + आवश्यकताएं । 25-मिमी #1 कवर ग्लास (1), चैंबर का निचला हिस्सा (2), चैंबर के शीर्ष भाग (प्लेसडी उल्टा) और ओ-अंगूठी (3), स्टेज धारक (4), और ढक्कन सील (5) । स्केल बार: 2 cm. B) मशीन यूनिट । गरम माइक्रोस्कोप स्टेज (1), के साथ प्रवाह चरण में और सह के लिए बाहर प्रवाह2 (2), एक सह2 जांच (3), और एक बंद पैच (4) । स्केल बार: 2 सेमी. ग) मशीन इकाई में इमेजिंग चैंबर, के रूप में माइक्रोस्कोप के नीचे देखा । D) बहु-समय श्रृंखला मैक्रो । ई) इमेजिंग के लिए उपकरण । उल्टे माइक्रोस्कोप (1), फ्लोरोसेंट लाइट (2), कंप्यूटर (3), रिंग हीटर (4, डालने) और नियंत्रक (4, मुख्य आंकड़ा), सह2 प्रवाह ट्यूबिंग (5), सह2 वाल्व (6), सह2 नियंत्रक (7), सह2 humidifier (8), हे2 वाल्व और नियंत्रक (9), और मंच तापमान नियंत्रक (10) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल खंड 3 में विस्तृत माइक्रोस्कोप पैरामीटर की योजनाबद्ध. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: dox और dox-NP के अल्पकालिक की जांच कर रहा है ।  BLM कोशिकाओं लगातार 3 एच के लिए dox या dox-NP के संपर्क में थे, और एक समय चूक लिया गया था । (एक) अभी भी समय की तस्वीरें-dox के साथ मशीन की कोशिकाओं की चूक । (ख) Dox-NP के साथ मशीन की कोशिकाओं की समय-चूक की अभी भी तस्वीरें । स्केल बार = ५० µm. (C) dox-और dox-NP-उपचारित कक्षों में नाभिकीय DXR की पिक्सेल घनत्व वृद्धि । (D) dox-और dox-NP-उपचारित कक्षों में cytoplasmic DXR की पिक्सेल घनत्व वृद्धि । डेटा क्षेत्र प्रति 3 कोशिकाओं के अर्थ ± एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: dox और dox-NP की लंबी अवधि के लिए विभिन्न सेल लाइनों में जांच । कक्ष dox या dox-NP और imaged 24 ज बाद में सामने आ गए । छवियां तुरंत दवाओं को हटाने के बाद लिया गया था, 3 अलग लाभ के साथ । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: सेलुलर और liposomal एजेंटों की रिहाई की जांच । कोशिकाओं को लगातार 24 घंटे के लिए Dox-एनपी के संपर्क में थे, और एक समय चूक बना दिया गया था । (क) अभी भी समय-चूक की तस्वीरें. स्केल बार = ५० µm. (B) नाभिक और कोशिका में DXR की पिक्सेल घनत्व वृद्धि । डेटा क्षेत्र प्रति 3 कोशिकाओं के अर्थ ± एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं । (C) कक्ष के भीतर DXR के स्थानीयकरण का प्रदर्शन छवियां । ठोस रेखा: कोशिका झिल्ली, बिंदीदार रेखा: नाभिक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: विभिन्न सेल लाइनों में दवा और वाहक के स्थानीयकरण की जांच. (A) कक्ष Dox-NP/24 घंटे के लिए किया गया था और imaged । स्केल बार = ५० µm. (B) कक्षों को Dox-NP/दिड/CF-PE के लिए 24 घंटे के लिए दिखाया गया था और व्यक्तिगत बुलबुले को अलग करने के लिए एक कम तीव्रता लाभ के साथ imaged । (ग) उज्ज्वल क्षेत्र और DXR ओवरले cytoplasmic बुलबुले में DXR दिखा (तीर) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: दवा और वाहक के intracellular स्थानीयकरण की जांच । कोशिकाओं को उजागर किया गया Dox-NP/दिड या CF-PE/24 एच के लिए किया था, और lysosomes लाइव सेल लाइसोसोमल मार्कर (LM) हरे या लाल रंग में उपयोग कर रहे हैं visualized. (क) DXR का Intracellular स्थानीयकरण और वाहक (यहे). तीर DXR के 3 उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते है और lysosome में स्थानीयकृत किया । स्केल बार = ५० µm. (ख) DXR का सह-स्थानीयकरण विश्लेषण और lysosomes (LM) में ImageJ का उपयोग करते हुए वाहक (यहे) । (ग) DXR के सह-स्थानीयकरण और lysosomes में वाहक का प्रतिशत । डेटा 3 व्यक्तिगत प्रयोगों का मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । (D) दो भिंन मार्करों का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ की गई लाइसोसोमल sequestering । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Movie 1
चलचित्र 1: संबंधित चित्र 3 : BLM कोशिकाओं dox के साथ 3 एच के लिए मशीन थे । समय चूक: 10 मिनट की एक अंतराल के साथ 19 छवियां,. फ़्रेम दर: 3 एफपीएस । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
चलचित्र 2: संबंधित चित्र 3 : BLM कोशिकाओं Dox-एनपी के लिए 3 एच के साथ मशीन थे । समय चूक: 10 मिनट की एक अंतराल के साथ 19 छवियां,. फ़्रेम दर: 3 एफपीएस । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 3
चलचित्र 3: संबंधित चित्र 5 : BLM कोशिकाओं Dox-एनपी के लिए 24 घंटे के साथ मशीन थे । समय चूक: ९६ छवियां, 15 मिनट के अंतराल के साथ फ्रेम दर: 8 एफपीएस । स्केल बार = ५० µm । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 4
चलचित्र 4: से संबंधित चित्र 5 : 1F6 कोशिकाओं Dox-एनपी के लिए 24 एच के साथ मशीन थे । समय चूक: ९६ छवियां, 15 मिनट के अंतराल के साथ फ्रेम दर: 8 एफपीएस । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 5
मूवी 5: संबंधित चित्र 7 : B16BL6 कोशिकाओं के Lysosomes एक जीवित सेल मार्कर के साथ दाग थे । समय-चूक: 10 एस के एक अंतराल के साथ 10 छवियां, फ्रेम दर: 3fps । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

के रूप में अतीत में मनाया, निर्धारण liposomal nanocarriers नष्ट कर सकते है लगभग तुरंत और DXR जारी फार्म इन नष्ट liposomes अभी भी समय के लिए नाभिक में प्रवेश किया था, बहुत मुश्किल और भी भ्रामक डेटा की व्याख्या कर रही है । कुछ सूक्ष्म समायोजन के साथ, जीवित कोशिकाओं और ऊतकों में कीमोथेरेपी भाग्य नियमित रूप से पुष्टि या ऊतकीय टिप्पणियों को उखाड़ फेंकने के लिए जांच की जा सकती है । हाल ही में एक पत्र में दिखाया, जारी है, और DXR के स्थानीयकरण मुक्त और encapsulated dox के साथ व्यवहार किया रहते सेल समय चूक इमेजिंग9का उपयोग कर । यह कार्य अधिक विवरण में प्रायोगिक सेटअप का वर्णन करता है । इस मॉडल का प्रयोग, यह नाभिक, जहां यह लगातार जब तक सेल अंततः मर जाता है के लिए dox के तत्काल परिवहन कल्पना संभव है । इसके विपरीत, जब Dox-NP उपयोग किया जाता है, केवल छोटी मात्रा में जारी Dox नाभिक में पाए जाते हैं । हालांकि सतत DXR buildup में निरंतर जोखिम परिणाम, फ्लोरोसेंट संकेत Dox-NP बनाम Dox-इलाज कोशिकाओं में बहुत कम है, सेलुलर एकाग्रता और बाद में cytotoxicity में एक अंतर का संकेत है । इसके अलावा, लाइव सेल मार्कर का उपयोग करके, यह दिखाया गया था कि, जब Dox के लिए कोशिकाओं को उजागर-एनपी, DXR और nanocarrier lysosome में स्थित हैं । यह इंगित करता है कि पूरा liposome सेल द्वारा लिया जाता है और इन नैनोकणों के दौरान एक endocytic मार्ग की भागीदारी को दर्शाता है । नाभिक में DXR स्पष्ट रूप से जारी dox से है । हालांकि, इस विधि का उपयोग करते हुए, दोनों DXR और वाहक के रूप में सह-स्थानीयकरण और lysosomes में फंस होने लगते हैं, यह अभी भी अनिर्णायक है कि क्या यह समझाया या जारी dox है । यह संभव है कि nanoparticle की आंतरिक स्थिरता dox रिलीज़ रोकता है जब lysosome में स्थानीयकृत ।

इस प्रोटोकॉल में, लाइव सेल इमेजिंग एक विशिष्ट सूक्ष्म सेटअप का उपयोग कर प्रदर्शन किया है, एक कस्टम के साथ मंच धारक (विनिर्देशों के अनुरोध पर दिया जा सकता है) । हालांकि, सबसे फोकल माइक्रोस्कोप के निर्माण की एक श्रृंखला की पेशकश की है कि लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन । सेल संस्कृति की स्थिति के संरक्षण (यानी, तापमान,2, पीएच, आर्द्रता, और बांझपन) इन मशीन की मुख्य कसौटी है और कुछ प्रारंभिक परीक्षण के लिए उचित स्थिति है, जो आगे समझाया है निर्धारित करने की आवश्यकता है । स्वचालित डेटा अधिग्रहण कार्यक्रम भी उसी के द्वारा वितरित किया जा सकता है बनाती है । एक "बहु स्थान" विकल्प यह एक ही कक्ष में छवि कई पदों के लिए संभव बनाता है, सांख्यिकीय विश्लेषण परिष्कृत । हालांकि, इस पांडुलिपि में उल्लेख किया स्थूल में इस विकल्प को निश्चित XYZ पदों की आवश्यकता है, जिसके द्वारा Z-बहाव के लिए सही करने की संभावना खो दिया है । स्कैनिंग Z-आयाम इस मैक्रो में शामिल किया जा सकता है और विश्लेषण के लिए एक फोकस विमान का उपयोग करता है । हालांकि, इस phototoxicity और ब्लीचिंग की संभावना को बढ़ाने, अतिरिक्त स्कैनिंग की आवश्यकता है ।

सभी फ्लोरोसेंट माप के साथ के रूप में, अधिक जोखिम एक समस्या है, खासकर जब एक अलग सेलुलर के साथ दो यौगिकों की तुलना. फ्लोरोसेंट तीव्रता यौगिक के आंतरिक संकेत पर ही निर्भर नहीं है, लेकिन यह भी ऊपर की दर पर, एकाग्रता, और दवा जोखिम समय. जैसा चित्र 3 में दिखाया गया है, dox-उपचारित कक्षों की नाभिकीय DXR सामग्री पहले से दृश्यमान है, जबकि dox-NP-इलाज कक्षों में कोई सिग्नल नहीं देखा गया है । केवल लाभ में वृद्धि करके Dox-NP-इलाज कोशिकाओं में DXR कर सकते है visualized, Dox-इलाज कोशिकाओं में अधिक जोखिम के लिए अग्रणी । इसके अलावा, यहां तक कि intracellularly, Dox-NP विषम रूप से वितरित की है, जो अपरिहार्य में परिणाम कर सकते है या अधिक जोखिम । विशेष रूप से सेलुलर DXR फंसाने की जांच करते समय, लाभ व्यक्तिगत organelles (आंकड़े 5B और 5C) भेद करने के लिए काफी कम हो गया था । इस प्रकार, पिक्सेल घनत्व द्वारा प्रतिनिधित्व माप परिणामों की उचित व्याख्या के लिए प्रतिनिधि छवियों के साथ होना चाहिए ।

Phototoxicity, ब्लीचिंग, और एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात भी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में महत्वपूर्ण मुद्दे हैं, और छवि की गुणवत्ता और छवि अधिग्रहण के बीच एक समझौता स्थापित किया जाना चाहिए । हालांकि, यहां तक कि जब माइक्रोस्कोप सेटअप इष्टतम है, छवि गुणवत्ता भी काफी हद तक कोशिकाओं की गुणवत्ता और जोड़ा यौगिक द्वारा निर्धारित किया जाता है । DXR एक मजबूत संकेत देता है और, उचित सावधानियों के साथ, ब्लीचिंग नहीं देखा गया था, यहां तक कि लंबे समय के बाद (अप करने के लिए ७२ ज). हालांकि, फ्लोरोसेंट सिग्नल की कमी भी समाप्ति का नतीजा हो सकता है । समाप्ति दवा प्रतिरोध15 में एक महत्वपूर्ण घटना है और तब होता है जब कोशिकाओं कार्रवाई की intracellular साइट से दवा बाहर पंप । समय के साथ फ्लोरोसेंट संकेत की कमी इसलिए भी dox समाप्ति9का एक परिणाम हो सकता है । एक गैर के फ्लोरोसेंट संकेत की तुलना समय चूक श्रृंखला से पिछले छवि के साथ प्रयोग के अंत में स्कैन स्थान ब्लीचिंग प्रदर्शन (यानी, संकेत होगा गैर में उच्च स्थान-स्कैन) या समाप्ति (यानी, दोनों के लिए हो जाएगा सिग्नल समान होंगे). कई सुधारात्मक विकल्प (जैसे, पृष्ठभूमि, बहाव, ब्लीचिंग, आदि) ImageJ16जैसे कार्यक्रमों में उपलब्ध हैं । इसके अलावा, समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता बढ़ जाती है के रूप में, विंयास सेटिंग्स पूर्व एक पायलट प्रयोग में मूल्यांकन के लिए समय के अंत में अधिक जोखिम कम कर सकते है चूक (३.२१ कदम) । वैकल्पिक रूप से, पहले से ही वांछित समय अवधि के लिए दवा को उजागर कोशिकाओं के साथ एक इमेजिंग चैंबर सेटिंग्स शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, विश्लेषण के इस प्रकार के लिए, विषाक्त दवा सांद्रता (३.२२ कदम) से बचा जाना चाहिए और पूर्व पारंपरिक जैव-परख का उपयोग कर स्थापित ।

कोशिकाएं लगातार कल्चर्ड और phenol रेड के बिना मीडियम में बनाए रखी जाती हैं । Phenol लाल fluoresces स्पेक्ट्रम के लाल भाग में और सेलुलर organelles में मनाया जा सकता है, सबसे अधिक संभावना lysosomes, झूठी सकारात्मक जानकारी पेश (१.२ कदम) । व्यक्तिगत कक्षों की निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए, कक्ष संगम ७०% (चरण ३.१.) से अधिक नहीं होना चाहिए । CO2 प्रवाह-गति (चरण ३.५) की आवश्यकता है जब उपकरण खरीदा है या रखरखाव के बाद एक मांयता प्रयोग में विनियमित करने के लिए । जब गति बहुत अधिक है, मध्यम लुप्त हो जाएगा । जब स्पीड बहुत कम होगी तो मीडियम का पीएच बढ़ेगा, जो सेल ग्रोथ को प्रभावित कर सकता है । के रूप में मध्यम phenol लाल पीएच में पीएच संकेतक परिवर्तन के बिना नहीं देखा जा सकता है और इसलिए आसानी से अनदेखी कर रहे हैं । एक बार CO2 प्रवाह मांय है, तो इन सेटिंग्स का उपयोग भविष्य के सभी प्रयोगों में किया जा सकता है ।

विधि का उपयोग यहां वर्णित है, नैनोकणों के भाग्य आसानी से रहते सेल इमेजिंग और समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जांच की जा सकती है । इस कार्यविधि में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नैनोकणों का उपयोग किया गया । हालांकि, thermosensitive के भाग्य17, cationic liposomes10; liposomes लघु श्रृंखला shingolipids18के साथ समृद्ध; और नैनोकणों encapsulating अंय दवाओं8,19 भी ट्यूमर और सामांय कोशिकाओं में इस तरीके से जांच की गई ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपिक सुविधाएं इरास्मस ऑप्टिकल इमेजिंग सेंटर का हिस्सा हैं, और हम उनकी सेवाओं के लिए ओआईसी के कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (no phenol-red) Sigma D1145 Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS
Trypsin-versene (EDTA) Lonza BE17-161E
Fetal calf serum Sigma F7524 Heat inactivate for 30 min at 55 ºC
L-Glutamin Lonza BE17-605E
Gelatin from bovine skin Sigma G9391 Make a 0,1% solution in PBS, sterile
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Stericup 0,22 µm filter - 500 ml  Millipore SCGPU05RE
Trypan-blue Sigma T8154
Cells: Lewis lung carcimoma ATCC CRL-1642
Cells: B16BL6 Dr. P. Brouckaert, Ghent University donated Ref.10
Cells: BLM and 1F6 Dr. van Muijen, University of Nijmegen donated Ref.11
Petri dish Greiner 664160
Doxorubicin Actavis  mentioned as dox in the manuscript
Doxil/Caelyx Janssen-Cilag mentioned as Dox-NP in the manuscript
Syringe filter 0.2 µm VWR international 10462200
Lysotracker-green DND-26 Invitrogen L7526 mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript
Lysotracker-red DND-99 Invitrogen L7528 mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript
Attofluor cell ring Invitrogen A7816
Cover glass 25 mm #1 Thermo scientific CB00250RA1
Stage holder + sealing lid Custom made
ZEISS LSM 510 microscope Zeiss
Software LSM 510 version 3.2 SP2 Zeiss
Image J NIH https://imagej.nih.gov/ij/index.html

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References

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Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T. L. M. Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles. J. Vis. Exp. (129), e55405, doi:10.3791/55405 (2017).

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