Summary
라이브 셀 이미징은 동적 프로세스를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 고정된 셀의 시험만 정적 사진을, 오해 및 과정에 대 한 혼란으로 이어질 수 있는 제공 합니다. 이 작품 이해, 약물 방출, 및 자주 나노 살아있는 세포에서의 세포내 지역화 하는 방법을 제공 합니다.
Abstract
기존의 이미징 기술을 세포 프로세스에 대 한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나,이 정보는 그렇지 않으면 동적 시스템에서 정적 이미지에 근거 하 고 연속 단계는 쉽게 간과 되거나 오해. 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경 검사 법, 있는 살아있는 세포 수에 따라 몇 시간 또는 며칠 더 많거나 적은 연속 방식에서 들이 따라서 매우 유익한. 여기에 설명 된 프로토콜 살아있는 세포에서 독 소 루비 (dox)의 납품 후에 화학요법 나노 입자의 운명을 조사 수 있습니다. Dox는 intercalating 에이전트 생물학적으로 활성 되는 nanocarrier에서 발표 해야 합니다. 십년 이상에 대 한 임상 등록, 불구의 이해, 분석, 및 약물 방출 아직도 완전히 이해 된다. 이 기사에서는 지질 기반 나노 입자는 종양 세포에 의해 채택 하 고 천천히 저하 가설. 출시 된 dox 핵에 translocated 다음 이다. 고정 아티팩트를 방지 하기 위해, 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경 검사 법,이 실험 절차에 따라 적용할 수 있습니다.
Introduction
세포 세포 상호 작용 같은 생물 학적 과정에 따라 수 간-세포내 수송, 세포 독성 화합물 통풍 관, 및 살아있는 세포와 조직에 단일 분자의 단백질 단백질 상호 작용 및 마지막에 큰 관심을 얻고 있다 10 년, "실시간"의 여분의 차원을 제공 합니다 이 원고에서 무료 dox dox 나노 (Dox-NP)에 통합의 세포내 운명에 따라 하는 방법 설명입니다.
나노 입자 특정 암 치료에 수십 년 동안 사용 되었습니다. 에이즈 관련 Kaposi 육 종, 치료에 대 한 난소 고급 유방암과 다중 골 수 종1, Dox NP 승인 되었습니다. 그것은 첫 번째 자주 나노 입자 개발 및 임상 설정에서 도입 중 하나 였다. 자유형, dox, 광대 하 게 충분 한 양의 종양 사이트에 접근을 제한 하는 혈액 순환에서 지워집니다. 또한, 치료는 심한 고 복용량 제한 부작용, 구내 염, 심장 마비 등을 동반 된다. Pegylated 자주 나노 입자에 캡슐화 순환 시간이 일2분에서 증가 합니다. 콜레스테롤을 포함 하는 이러한 유형의 liposome 상당히 안정적 이며 캡슐화 된 약물의 약 동학이이 안정성에 따라 결정 됩니다.
그러나,이 강성 단점이 있다. 세포 독성 종양 세포에 대 한 화합물의 기능은 첫 번째 평가 된 생체 외에서그리고 그 dox는 Dox-NP에서 세포 독성 분석 실험3,4보다 더 강력한 표시 되었습니다. 그것은 릴리스 및, 약의 세포질 통풍 관을 방지 하는 캐리어의 안정성 그리고이 현상 더 조사 가치가 가설 했다. 대상 사이트 (즉, 종양에서 세포 독성 구성 요소 (즉, dox)의 장애인된 bioavailability 귀착되 었 다 혈 류에서 공격적인 요소를 마지막에 그대로, 종양 사이트에 도달를 내장 기본 자주 속성 세포 핵)입니다. Dox NP 대담 자유 형식에 비해 응답을 개선, 비록 그것은 여전히 임상 값의 캡슐화는 크게5cardiotoxic 효과 감소. 다음 몇 년 동안, 다른 화합물 나노 캐리어6캡슐 했다. 또한, 반송파 수정 트리거 마약 릴리스 (즉, 종양 사이트)에서 가져왔지만 혈액 순환을7,8에 안정성을 유지. 조사 및 임상 사용의 년에 불구 하 고 같은 Dox NP nanocarriers의 intratumoral 운명을 아직 명확 하지 않다 완전히. 최근 간행물에서 그것 동안에 dox 리소좀9에 갇혀는 나노 전체적으로 채택 되는 표시 했다.
나노 및 약물 방출의 세포질 통풍 관에는 최고의 라이브 셀 이미징 사용 하 여 모니터링할 수 있는 동적 프로세스입니다. 또한, 클래식 조직학, 셀에서 알을 품는 그리고 잘못 된 결과 줄 수 그 후 고정, 고정 자주 캐리어를 파괴 하 고 유물을 소개 하는 경우. 라이브 셀 이미징에 대 한 주요 요구 사항 시각화, 형광, 선호에 의해 원하는 과정입니다. Dox, 같은 특정 화합물 있다 본질적인 붉은 형광. 또한, 형광 마커는 캐리어에 소개 될 수 있다 고 휴대 organelles 라이브 셀 마커를 사용 하 여 구상 될 수 있다. 이 방법에서는, 매개 변수, 캐리어, 마약 릴리스 및 캐리어 및 마약, 셀룰러 현지화의 다양 한 군데 고 분석 될 수 있습니다. 여기, 메서드는 dox Dox-NP 여러 종양 세포에서의 세포 운명 뒤에 실시간으로 설명 합니다. 또한,이 방법은 쉽게 적용할 수 있습니다 (예를 들어, 나노 입자10청구) 대상 및 실행에 대 한 이상적인 조건을 만들려고 마약 릴리스 (예: 고 열7).
Protocol
1. 준비
- 이미징 챔버, 두 부분으로 구성 된 조립.
- 챔버 ( 그림 1A-2)의 하단 부분에 25 m m 커버 유리 ( 그림 1A-1)를 배치 하 고 하단 부분 ( 그림 1A-3)에 상단 부분을 나사. 마십시오 하지 조여 너무 열심히, 유리를 깰 수로. 압력솥 전체 챔버 ( 그림 1A-4).
- Dulbecco를 보완 하 여 세포 배양 매체를 준비 ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 페 놀 레드 10% 태아 종 아리 열 비활성화 혈 청 (FCS)와 무 균 조건 하에서 1 m m L-글루타민 없이. 4 ° C에서 37 ° c 사용 하기 전에 따뜻한 게.
- 유지 표준 세포 배양 기술을 사용 하 여 플라스 크 배양에서 세포 배양 매체와 셀.
참고: 여기, 두 개의 마우스 셀 라인, 흑색 B16BL6 11와 루이스 폐 암 (LLC는), 그리고 2 개의 인간 정면을, BLM와 1F6 12, 사용 되었다. - 무게 및 젤라틴 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° C에 용 해 하 여 만들어 0.1% 젤라틴 하룻밤. 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 여 솔루션을 소독을 4 ° c.
2. 세포를 플레이트
- 이미징 약 실에서에서 제거 층 류 캐비닛에 살 균 가방, 신중 하 게 챔버, 강화 하 고 페 트리 접시에.
참고: 오염을 방지 하려면 이미징 챔버 페 트리 접시에까지 계속 현미경 챔버를 둘 수 있다. - 코트 37 ° C, 5% CO 2 시 20 분에 대 한 0.1% 살 균 젤라틴의 1 mL와 이미징 챔버의 유리.
참고: 이것은 더 나은 셀 첨부 파일 수. - (단계 1.2 및 1.3 참조) 셀 문화 플라스 크에서 매체를 제거, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리. 세포 배양 매체를 추가 하 여는 트립 신을 비활성화, 세포를 수집, 5 분, 1100 x g에서 스핀 다운 및 세포 배양 매체의 5 ml에서는 펠 릿 resuspend.
- 20 세포 현 탁 액의 희석 20 µ L µ L trypan 블루 (이 죽은 세포에 의해 채택 될 것 이다)의. Hemocytometer;를 사용 하 여 생활 하 고 죽은 세포의 수를 계산 죽은 세포의 수 10%를 넘지 말아야 한다.
- 는 젤라틴을 발음 하 고 24 시간 이내 70%의 최대 허용 희석에서 셀 접시. 예를 들어 5 x 10 4 또는 10 x 10 4 셀 1 mL에 희석을 사용 합니다. 5% CO 2와 24 h. 위해 37 ° C에서 준수를 셀 수 있도록
3. 시간 경과 현미경 ( 그림 2)
참고: 여기, 주문 품 단계 홀더 confocal 현미경, 대부분 제조 라이브 셀 이미징에 대 한 incubators의 범위를 제공 하지만 사용 되었다 또한 조사 nanoparticulated 약물 전달에 적합.
- Confluency, 세포 형태학 및 오염에 대 한 현미경으로 세포를 평가. CO 2 배양 기에 다시 챔버를 놓습니다.
참고:는 confluency 70%를 초과 하지 않아야 합니다. 세포 형태는 일치 하지 않습니다 (즉, 셀 고착 하지 않는다) 또는 오염 감지, 이미징 챔버 삭제. - 전환에 confocal 현미경 ( 그림 1E-1), 형광등 ( 그림 1E-2), 컴퓨터 ( 그림 1E-3).
- 목적 렌즈 히터를 연결 하 고 설정 35 ° C (-4 그림 1E + 삽입).
- 그림 1B와 같이 외피 단위 준비.
참고:이의 단위 구성 됩니다 ( 그림 1B-1)가 열된 단계 흐름 단계 CO 2 튜브 ( 그림 1B-2)에 대 한 커넥터와 CO 2 프로브 ( 그림 1B -3), 및 빨간 닫는 패치 ( 그림 1B-4). 이 패치 이미징 챔버에 배치 됩니다 때까지 단위를 일시적으로 종료 하는 데 사용 됩니다. - 는 현미경 스테이지에 외피 단위 놓고에-및 아웃-flow CO 2 튜브 ( 그림 1E-5)를 연결 합니다. 주요 공동 2 밸브 ( 그림 1E-6) 열고 CO 2 컨트롤러 ( 그림 1E-7)에 전환. 컨트롤러는 5% CO 2로 설정 되어 있는지 확인.
참고: 습도, CO 2는 가습기 ( 그림 1E-8)를 통해 전달합니다. 저 산소 증 실험은 별도 O 2 레 귤 레이 터 ( 그림 1E-9)는 설치 프로그램에 포함 되어. - 설정 단계 온도 37 ° C ( 그림 1E-10). 고 열 실험 설정 온도 42 ° C. 허용 선택한 온도 CO 2 비율 도달 외피 단위.
- 주요 공동에서 이미징 챔버 2 인큐베이터 고 전송 현미경 검사 법을 페 트리 접시에 챔버.
- 이미징 챔버 ( 그림 1A-4)에 주문 품, 35 m m 직경 홀더 ( 그림 1A-5) 무대와 주문 품 씰링 뚜껑 챔버를 닫습니다 ( 그림 1A-6).
참고: 뚜껑 CO 2 통과 허용 하 고 증발 및 오염 방지.- 외피 단위를 열고, 이미징 챔버와 붉은 패치를 대체 하 고 단위 ( 그림 1C)을 닫습니다. 이렇게 셀의 냉각을 방지 하기 위해 가능한 한 빨리. 케이블 사이 단계 및 현미경 붙어있는 다는 것을 확인.
- 30 분에 대 한 순응을 두고
- 소프트웨어 열고 레이저 스위치.
참고: 여기, 488 nm 아르곤, 543 nm 헬륨-네온와 633 nm 헬륨-네온 레이저 사용. - 클릭 하 여 새 데이터베이스를 만드는 " 새로운 " 파일 탭 이름 아래와 데이터베이스 저장.
- 설정 구성을 클릭 하 여 " 구성 " 취득 탭 선택에서 " 채널 모드 " 및 " 단일 트랙 " 단일 fluorophore 평가 하 또는 " 멀티 트랙 " 여러 fluorophores에 대 한. 적절 한 대역 통과 필터 (dox와 Dox NP에 대 한 예를 들어, 560 615 nm 대역 통과 필터, 참조에 대 한 더 많은 예 대표 결과) fluorophore 일치를 선택 합니다. 트랙 중 하나에 밝은 필드 채널을 선택 합니다.
- 클릭 하 여 스캔 컨트롤 설정 " 스캔 " 취득 탭 설정 프레임 크기 (1024 x 1024), 스캔 속도 (최적의), 아래 스캔 방향 (8 비트, 단일), 및 평균 (4)를 클릭 하 여 스캔 " 모드. " 홀 (200 µ m)를 설정 하며, (오프셋 예를 들어, 580, 700, 및 835; 그림 3 참조), 레이저 출력 및 (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%)를 클릭 하 여 " 채널. "
- 클릭 하 여 이러한 설정을 저장 " 구성 " 탭에서 구성 하 고 구성 데이터베이스에 저장.
- 클릭 하 여 시간 경과 설정 " 멀티 시간 X " ( 그림 1D) 매크로 탭 클릭에에서 " 위치를 단일 ".
- 초점, 셀을 계속 클릭 하 여 매크로에서 자동된 초점을 선택 " 자동 초점. "
참고: 자동 초점 유리의 반사를 사용 하 여 기준점으로 633 nm 레이저와 함께 이루어집니다. - 클릭 하 여 저장 된 구성을 적용 " 단일 트랙 " 또는 " 멀티 트랙 " 스크롤 시간 간격 (예를 들어, 15 분), 검사 (예: 97)의 수를 설정 하는 구성 데이터베이스에는 필요한 구성 및 클릭 하면 " 부하 구성. "
참고: 이러한 설정을 사용 하 여, 97 x 15 분 = 24 h의 시간 시리즈 이루어집니다. - 이름에 시간 경과 " 기본 파일 이름 " (단계 3.11에서에서 만든) 데이터베이스를 클릭 하 여 선택 하 고 " 이미지 데이터 베이스 "는 시간 경과 하기. 클릭 하 여 임시 폴더를 설정 " Tmp 이미지 폴더. "
참고: 이미지가이 폴더에 있는 경우 시스템 중지 또는 어떠한 이유로 든 충돌,. - Incubating 장치를 엽니다, 그리고 이미징 반지를 들어, 목적, 침수 기름 방울을 추가 하 고 단위를 가능한 한 빨리 닫습니다. 집중 하 고 이미징 약 실에 있는 위치를 선택 합니다.
참고:이 위치 포함 최소 70 %confluency, 개별 셀의 이미징에 대 한 허용의 단층에 셀. - 배경에 대 한 구성 설정을 확인 하 고 필요한 경우 수정.
참고: 배경 이득 또는 레이저 전력 줄여 수정 될 수 있습니다. 구성에서 변경 (단계 3.17 참조) 저장 하 고 로드 (단계 3.18 참조) 다시 매크로에서. - 층 류 캐비닛, 희석 무료 마약 또는 5 µ g/mL 약물의 농도 또는 세포 배양에서 지질 0.05 µmol 나노 입자. 마약/나노 살 균 하지 않은 경우 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링.
- Incubating 챔버 씰링 뚜껑 리프트, 세포에서 매체를 제거, 희석된 마약/나노 입자의 1 개 mL를 추가 단위를 가능한 한 빨리 닫습니다.
- 클릭 하 여 셀에 시작 시간 경과 집중 " 시작 시간 " 멀티 시간 X 매크로에서.
- 셀 초점에 아직도 있는지 확인 하기 위해 정기적으로 확인 하거나 자동 초점 (3.16 단계 참조)를 사용 합니다. 프로그램은 데이터베이스;에 시간 경과 저장 자동으로 프로그램이 실행 되는 동안 데이터베이스는 닫지 마십시오.
4. 데이터 분석
- 원래 연구 질문에 따라 데이터 분석을 위한 ImageJ 같은 소프트웨어 프로그램을 사용 (예를 들어 결과 섹션을 참조).
Representative Results
자주 사업자와 다른 마커 라벨 앞에서 설명한9되었습니다. 빨강 dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine 과염소산염 (않았다;으로 표시 하는 항공사 Ex = 644 nm; 엠 = 665 nm) 또는 녹색 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; 엠 = 515 nm)이이 원고에 표시 됩니다. 세포 유사점 및 차이점에 자주 통풍 관, 릴리스, 그리고 세포내 지역화를 표시 하려면 여러 종양 종류 공부 했다. 이러한 두 마우스 라인, B16BL6 흑색 종11 와 루이스 폐 암 (LLC는), 그리고 두 인간의 정면을, 높은 전이성 (BLM), 전이성 비 (1F6) 흑색 종12,13포함 됩니다. 모든 실험은 살아있는 세포를 사용 하 여 수행 했다. 모든 실험에 대 한 3 또는 24 h. 측정 된 고 (무료, 발표, 캡슐화, 분리 된, 또는 형태로 삽입) 분석된 dox 라고도 했다 DXR 5 µ g/mL dox, 5 µ g/mL Dox-NP, 또는 0.05 µmol 나노 입자의 농도 관리 되었다. 40 X (숫자 조리개: 1.3) 오일 렌즈 사용 되었다, 그리고 영상 CF-PE 및 lysosomal 마커 (LM) 488 nm 아르곤 레이저 (10%/0.2 mW 전력)와 505 550 nm 대역 통과 필터 수행 되었다-녹색. 543 nm 헬륨-네온 레이저 (100% / 0.2 mW 전력) 560 615 nm 대역 통과 필터 dox, Dox NP 및 lysosomal 마커-레드 사용 되었다. 633 nm 헬륨-네온 레이저 (100%/0.5 mW 전력)와 640 nm 긴 패스 필터가 사용 되었다 않았다.
캡슐화 때문에 체 외에서 세포 독성, 생체 이용률, dox의 약 동학 크게 변경된3,,914했다. 자유롭고 캡슐 형태로 투여 하면 약물의 생체 이용률의 차이 그림 3에서 보여 줍니다. Dox intercalating 에이전트 이며 될 세포 독성 세포 핵을 입력 해야 합니다. 그림 3 관련 영화 1 및 2 3 h BLM 셀 dox 또는 Dox NP 동일한 조건 하에서 치료의 시간 경과 표시. Dox 노출의 몇 분 안에 핵 DXR (그림 3A, 영화 1) 관찰 될 수 있다 그리고, 낮은 사용 하 여 이득 (삽입), 핵에 있는 intercalating 볼 수 있습니다. 대조적으로, Dox NP에 드러낼 때, 세포내 DXR 거의 표시 됩니다이 시간 내-(그림 3B, 영화 2). 광 전 증폭 관 이득, 증가에 의해서만 DXR 세포질에서 관찰 될 수 있다 (삽입). ImageJ를 사용 하 여, 세포질 및 핵 DXR의 픽셀 밀도 분석 되었다. 로 셀 모션에서 시간 경과 평가 하는 동안, 밝은 필드 이미지 형광 결합 하는 것 중요 하다. 이 개별 셀을 추적 하 고 안정화 ImageJ의 특정 플러그인을 사용 하 여 XY 드리프트의 가능성을 제공 합니다. 그림 3에서 제시 하는 분석에 밝은 필드 이미지 세포질 (실선)와 핵 (점선) (ROI) 관심 영역을 그리는 데 사용 되었다. ImageJ의 ROI 관리자 메뉴 항목 분석에서에서 찾을 수 있습니다 > 도구 > ROI 관리자. 이러한 ROIs 메뉴 항목 분석을 사용 하 여 픽셀 밀도 분석 하는 형광 이미지에 사용 되는 > 측정. 핵 (그림 3C)의 픽셀 밀도 dox-또는 Dox-NP-치료 세포의 세포질 (그림 3D)의 차이 이미지에서 본 것을 확인 합니다. 또한, 셀 dox 또는 Dox-NP, 후 화합물 매체에 의해 대체 되었고 즉시 광 전 증폭 관 이득 (그림 4)의 감도 증가 함께 몇 군데 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다. 레이저 파워, 오프셋, 핀 홀, 및 이미지 디스플레이, 등의 다른 설정을 동일 했다. Dox NP 처리 dox 처리에 비해 셀에 낮은 DXR 신호 강렬 합니다. 700의 이득을 사용 하 여, DXR Dox NP 처리 셀에 표시 됩니다, 반면에 dox의 이미지는 이미 과다 노출. 이 간단한 생체 외에서 실험 캡슐화 된 약 대 무료의 bioavailability에 상당한 차이 시각화.
24 h에 대 한 세포는 Dox NP에 노출 되는 지속적으로 때 DXR 빌드 시간이 지남에 그림 5A 와 영화 3, 4에서와 같이. 신호는 세포질에서 증가 하 고 후, DXR 발견 된다 핵에 삽입 된. 이러한 관측 픽셀 밀도 그래프 (그림 5B)에 의해 확인 됩니다. 측정 된 세포질 픽셀 밀도 BLM 세포내 분포에 차이가 있기 때문에 1F6 세포에 비해 서에서 낮습니다. DXR 1F6 셀에 셀에 걸쳐 배포 됩니다, 반면 DXR BLM 셀에 핵 (그림 5C) 가까운 세포 기관이에 더 집중 된다.
따라서, 약물 및 다른 셀 라인 (그림 6)에서 캐리어의 지역화 조사 했다. 셀은 Dox-NP/한 군데와 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다. 밝은 분야 이미지를 사용 하 여, 세포 막 (실선) 및 핵 (점선)의 오버레이 세 개의 다른 셀 라인의 형광 이미지에 그려진 했다. 그것은 여기 표시 캐리어 DXR로 동일한 세포질 패턴에 따라, 설명 된다: LLC는에서 전체 핵 주위에 있는 BLM, 핵에 가까운 세포 기관이 집중 하 고 무작위로 B16BL6 세포에서 세포질에 흩어져. 핵에서 유일한 DXR 없고 않았다 볼 수 있습니다, dox 출시 나타내는. 광 전 증폭 관 이득 줄임으로써, DXR 및 캐리어, 표시와 함께 포함 된 개별 세포질 소포, 뿐만 아니라 CF-PE (그림 6B 와 6 C)와 함께 볼 수 있습니다.
세포질 DXR 작은 소포에 sequesters 그리고 셀 녹색 또는 빨간색에 라이브 셀 lysosomal 표시와 함께 표시 했다. 이러한 리소좀의 움직임 (영화 5) 셀에 다음 수 있습니다. 세포질 DXR과는 nanocarrier이이 구조 내에서 colocalize 그리고 DXR 패턴에서 작성 차이 그림 6에서 보듯이 설명 여기. 리소좀은 B16BL6에 세포질 걸쳐 무작위로 배포 하 고 핵 BLM 셀 (그림 7A)에 옆에 있습니다. ImageJ를 사용 하 여, DXR과 캐리어는 리소좀에 사이 colocalization 계산 되었다 (그림 7B). 컬러 이미지 바이너리 되었다 (프로세스 > 이진 > 이진 하 게) colocalization 플러그인을 사용 하 고 (분석 > Colocalization), colocalization 이미지와 DXR의 되었다 않았다. 이 두 이미지의 colocalized 픽셀을 나타내는 흰색 픽셀 그린-레드-화이트 색된 이미지를 만듭니다. 메뉴를 통해 프로세스 항목 > 이진 > 이진 하 게 흰색 픽셀을 구분 하 고 검은 픽셀, 픽셀 밀도 측정으로 변환 됩니다 (분석 > 측정). 그 후, colocalization 이미지가이 DXR 사이 되었다-이미지 않았다 고 lysosomal 마커 (LM) 및 픽셀 밀도의 바이너리 이미지 측정. Colocalization 데이터는 픽셀 DXR에 대 한 긍정적인의 비율-않았다 DXR-않았다/lysosomal 마커 (그림 ℃). 그 뿐만 아니라 CF-PE와 라벨이 캐리어로,에 있는 리소좀 그림 7D에 표시 됩니다.
그림 1: 악기와 장비 설치. A) 챔버 + 필수품 이미지입니다. 25 m m #1 커버 유리 (1), (2), 챔버의 하단 부분 상위 챔버 (곳에의 부분아래로 거꾸로 d)와 링 (3), 무대 홀더 (4), 및 씰링 뚜껑 (5). 눈금 막대: 2 cm. B) 외피 단위. 열띤된 현미경 단계 (1) 흐름 단계와에-및 아웃-flow CO2 (2), (3), CO2 프로브 및 닫는 패치 (4). 눈금 막대: 2 cm. C) 현미경 아래에서 본 인큐베이터 장치에서 챔버를 이미징. D) 다중 시계열 매크로입니다. E) 이미징 장비입니다. 거꾸로 현미경 (1), 형광등 (2), 컴퓨터 (3), 링 히터 (4, 삽입)와 컨트롤러 (4, 주요 그림), CO2 흐름 튜브 (5), CO2 밸브 (6), CO2 컨트롤러 (7), CO2 가습기 (8), O2 밸브 및 컨트롤러 (9), 그리고 단계 온도 컨트롤러 (10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프로토콜 섹션 3에에서 대 한 자세한 현미경 매개 변수의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 단기 통풍 관에 dox 그리고 Dox NP를 조사. BLM 셀 3 h, dox 또는 Dox NP에 지속적으로 노출 됐다 고 한 경과 찍은. (A) 셀 dox로 인 큐베이 팅의 시간 경과의 스틸 사진. 셀의 경과의 (B) 스틸 사진을 Dox NP와 인 큐베이 팅. 눈금 막대 50 µ m. (C) 픽셀 밀도의 증가 핵 DXR dox-Dox-NP-처리 셀에 =. (D) dox-Dox-NP-처리 세포에서 세포질 DXR의 픽셀 밀도 증가. 데이터 필드 3 셀의 평균 ±를 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 다른 세포에 dox Dox NP의 장기 도입을 조사. 셀은 dox 또는 Dox NP에 노출 됐다 고 후 24 h를 몇 군데. 이미지 3 다른 이득 갖는 약물의 제거 직후 찍은 사진. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 세포질 통풍 관 그리고 자주 에이전트의 방출 조사. 셀 24 h, Dox NP에 지속적으로 노출 됐다 고 한 시간 경과 되었다. (A)는 시간 경과의 스틸 사진. 눈금 막대 50 µ m. (B) 픽셀 밀도 증가 DXR의 핵 및 세포질에서 =. 데이터 필드 3 셀의 평균 ±를 SD를 나타냅니다. (C) 이미지 셀 내에서 DXR의 지역화를 설명 합니다. 실선: 세포 막, 점선: 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 약물 및 다른 세포에서 캐리어의 지역화를 조사. (A) 세포 Dox-NP/한 24 h에 노출 되었고 몇 군데. 눈금 막대 = 50 µ m. (B) 셀 24 h 동안 Dox-NP/했/CF-PE에 노출 되었고 개별 소포를 구별 하는 낮은 강도 이득으로 몇 군데. (C) 밝은-필드와 DXR DXR 세포질 소포 (화살표)를 보여주는 오버레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 약물 및 캐리어의 세포내 지역화의 조사. 셀 Dox-NP/또는 CF-PE/한 24 h에 노출 됐다 고 리소좀 녹색 또는 빨간색에 라이브 셀 lysosomal 마커 (LM)을 사용 하 여 시각화 됩니다. (A) DXR과 캐리어 (않았다)의 세포내 지역화. 화살표는 DXR의 3 예제 나타내고는 리소좀에 지역화 된 않았다. 눈금 막대 = 50 µ m (B) 공동 지역화 분석 DXR 및 캐리어 (않았다) 리소좀 (LM) ImageJ를 사용 하 여에. DXR의 공동 지역화와 리소좀에 운반대의 (C) 비율. 데이터 3 개별 실험의 평균 ±를 SEM을 나타냅니다. (D)는 캐리어의 Lysosomal 격리는 두 다른 마커를 사용 하 여 시각입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 관련 그림 3 : BLM 셀 3 h. 위해 dox로 인 큐베이 팅 했다 시간 경과: 19 이미지, 10 분 프레임 속도의 간격: 3 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 2: 관련 그림 3 : BLM 셀 3 h. 위해 Dox NP와 인 큐베이 팅 했다 시간 경과: 19 이미지, 10 분 프레임 속도의 간격: 3 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 3: 관련 된 그림 5 : BLM 셀 24 h.에 Dox NP와 인 큐베이 팅 했다 시간 경과: 프레임 속도 15 분 간격으로 96 이미지: 8 fps. 눈금 막대 = 50 µ m.이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (다운로드를 오른쪽 클릭 합니다.)
영화 4: 관련 그림 5 : 1F6 셀 했다 24 h.에 Dox NP와 인 큐베이 팅 시간 경과: 프레임 속도 15 분 간격으로 96 이미지: 8 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 5: 관련 그림 7 : 리소좀의 B16BL6 세포 라이브 셀 표식으로 물 했다. 시간 경과: 10의 간격으로 10 이미지 s. 프레임 속도: 3 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
Discussion
과거에 관측 된 고정 거의 즉시 자주 nanocarriers를 파괴할 수 있다 고 DXR 발표 양식 이러한 파괴 리는 여전히 핵, 입력 시간 했다 매우 어렵고 심지어 잘못 된 데이터의 해석 만들기. 일부 미세한 조정, 살아있는 세포 및 조직 화학요법 운명 수 정기적으로 조사 확인 또는 조직학 관측 전복. 최근 종이 자유롭고 캡슐화 된 dox 라이브 셀 시간 경과 영상9를 사용 하 여 치료 하는 셀에 통풍 관, 릴리스 및 DXR의 지역화를 보여주었다. 이 작품에서는 좀 더 자세하게에서 실험적인 체제를 설명합니다. 이 모델을 사용 하 여, 그것은 핵에 dox의 즉각적인 교통을 시각화 수 그것은 지속적으로 셀 결국 죽을 때까지 축적. 대조적으로, Dox NP를 사용 하면 적은 양의 나온된 dox 핵에서 발견 된다. 지속적인 노출 결과 연속 DXR 형성, 형광 신호 이지만 Dox에 훨씬 낮은-NP-dox 처리 세포 대 세포 농도 후속 세포 독성에 차이 나타내는. 또한, 라이브 셀 표식을 사용 하 여 그것, Dox NP에는 셀을 노출할 때 DXR 및는 nanocarrier에에서 있는 리소좀 표시 했다. 이 완전 한 liposome 셀에 의해 채택 되 고 이러한 나노 입자의 통풍 관 동안 endocytic 통로의 참여 보여줍니다 나타냅니다. 핵에서 DXR 나온된 dox에서 명확 하 게 이다. 그러나, DXR와 캐리어 공동 지역화와 리소좀에 갇힌 것이 방법을 사용 하 여, 아니에요 아직 결정적인이 캡슐화 여부 dox를 발표. 나노 입자의 본질적인 안정성 dox 릴리스는 리소좀에 지역화 방지 가능 하다.
이 프로토콜에서 라이브 셀 이미징 맞춤 단계 홀더 (사양 요청에 주어질 수 있다)를 가진 특정 현미경 설치를 사용 하 여 증명 됩니다. 그러나, 가장 confocal 현미경 제조 수행 라이브 셀 이미징 하는 인큐베이터의 범위를 제공 합니다. 세포 배양 조건 (즉, 온도, CO2, pH, 습도, 및 불 임)을 보존은이 산부인과의 주요 기준 이며 적절 한 상태를 확인 하기 위해 몇 가지 예비 테스트는 추가 설명입니다. 자동화 된 데이터 수집 프로그램은 또한 동일한 제조 업체에 의해 전달할 수 있습니다. "멀티 위치" 옵션 통계 분석 정제 동일한 약 실에서 여러 위치에 이미지를 가능 하 게. 그러나,이 원고에 언급 된 매크로에서이 옵션 고정된 XYZ 위치, Z-드리프트에 대 한 수정 가능성 있는 손실 됩니다 필요 합니다. 이 매크로에 분석에 대 한 초점 비행기 사용 Z-차원 검사를 포함할 수 있습니다. 그러나,이 여분의 검색, phototoxicity의 가능성을 증가 하 고 표백 필요 합니다.
모든 형광 측정, 것과 같이 과도가 문제다, 다른 세포질 통풍 관을 가진 두 화합물을 비교 하는 경우에 특히. 형광 강도 통풍 관, 농도, 및 약물 노출 시간 속도에 뿐만 아니라, 화합물의 본질적인 신호에 따라 종속 되지 않습니다. 그림 3에서 보듯이, 반면에 Dox NP 처리 셀에서 아무 신호를 볼 dox 처리 셀의 핵 DXR 콘텐츠 표시, 이미입니다. 증가 하는 이득에 의해서만 수 Dox NP 처리 셀에서 DXR 구상 될, dox 처리 셀에 과도에 지도. 또한,도 침, Dox NP heterogeneously 배포는 아래 피할 수 없는 발생할 수 있습니다-또는 노출 과도. 세포질 DXR 함정 수사를 조사 하는 경우에 특히 이득 개별 세포 (그림 5B 및 5c)을 구별 하는 것 크게 감소 되었다. 따라서, 픽셀 밀도로 표현 하는 측정 결과의 적절 한 해석에 대 한 대표적인 이미지에 의해 동반 되어야 합니다.
Phototoxicity 표백, 낮은 신호 대 잡음 비율에에서는, 및 또한 중요 한 문제 형광 현미경 검사 법, 그리고 이미지의 품질과 이미지 수집 사이 타협을 설정 해야 합니다. 그러나, 현미경 설치 최적입니다, 경우에 이미지 품질은 또한 크게 전지와 추가 화합물의 품질에 의해 결정 됩니다. DXR 강한 신호를 제공 하 고, 적절 한 주의와 표백 하지 관찰 되었다, (최대 72 h) 오랜 후에. 그러나, 형광 신호 감소 경과의 결과 수 있습니다. 경과 약물 저항15 중요 한 현상 이며 셀 펌프 액션의 세포내 사이트에서 마약을 하는 경우에 발생 합니다. 시간이 지남에 형광 신호 감소 하실 수 있습니다 따라서 dox 경과9의 결과. 표백 시연할 예정 이다 시간 경과 시리즈에서 마지막 이미지와 실험의 끝에 비 스캔 위치의 형광 신호를 비교 (즉, 신호 높은 것 비 스캔 위치에서) 또는 (즉, 두 경과 신호 것입니다 동일)입니다. (예를 들어, 배경, 드리프트, 표백, 등) 여러 교정 옵션 ImageJ16같은 프로그램에서 사용할 수 있습니다. 또한, 형광 강도 시간이 지남에 따라 증가, 구성 설정 시간 경과 (단계 3.21)의 끝에 과도 최소화 하기 위해 파일럿 실험에서 미리 계산 된 수 있습니다. 또는, 이미 원하는 기간에 대 한 약물에 노출 된 세포 이미징 챔버 설정을 초기화를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 유형의 분석, 독성 약물 농도 (단계 3.22) 피해 야 한다 하 고 미리 기존의 바이오-분석 실험을 사용 하 여 설정.
세포는 지속적으로 교양 하 고 페 놀 레드 없이 매체에 유지. 페 놀 레드는 스펙트럼의 빨간 부분에 fluoresces 고 휴대 organelles, 가장 가능성이 리소좀, 거짓 양성 정보 (1.2 단계)에서 관찰 될 수 있다. 개별 셀의 모니터링에 대 한 수 있도록, 셀 합류 70% (3.1 단계.) 넘지 말아야 한다. CO2 흐름-속도 (3.5 단계) 또는 유지 보수 후 유효성 검사 실험 장비를 구입 하는 경우에 통제 될 필요가 있다. 속도가 너무 높은, 중간 증발 됩니다. 속도 너무 낮은 경우에, 세포 성장에 영향을 미칠 수 있는 매체의 pH 증가 합니다. 매체 없이 pH에 페 놀 레드 산도 표시기 변경 관찰 될 수 없다 고 따라서 쉽게 간과 된다. CO2 흐름의 유효성을 검사 하는 일단 이러한 설정은 모든 미래 실험에 사용할 수 있습니다.
여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 나노 입자의 운명 수 있다 쉽게 조사 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경을 사용 하 여. 이 절차에서는 상업적으로 이용 가능한 나노 입자 사용 되었다. 그러나, 열에 민감한17, 양이온 리10;의 운명 짧은 체인 shingolipids18; 농축 리 그리고 나노 캡슐화 다른 약물8,19 도 이러한 방법으로 종양과 정상 세포에 조사 되었다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
사용 하는 현미경 시설 에라스무스 광학 이미징 센터의 일부 이며, 우리는 그들의 서비스에 대 한 OIC의 직원을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
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