Summary
Live-celle imaging er et kraftfuldt værktøj til at visualisere dynamiske processer. Undersøgelse af faste celler giver kun statiske billeder, som kan føre til fejlfortolkninger og forvirring om processen. Dette arbejde præsenterer en metode til at studere optagelse, drug frigivelse og intracellulære lokalisering af liposomal nanopartikler i levende celler.
Abstract
Konventionelle Billeddannende teknikker kan give detaljerede oplysninger om cellulære processer. Men disse oplysninger er baseret på statiske billeder i en ellers dynamisk system, og successive faser er let overset eller misforstået. Live-celle imaging og time-lapse mikroskopi, hvor levende celler kan følges timer eller endda dage i en mere eller mindre konstant mode, er derfor meget informativ. Protokollen beskrevet her giver mulighed for undersøgelse af kemoterapeutiske nanopartikler skæbne efter leveringen af doxorubicin (dox) i levende celler. DOX er en intercalating agent, der skal frigives fra sin nanocarrier bliver biologisk aktive. Trods sin kliniske registrering for mere end to årtier, er dets optagelse, fordeling og stof frigivelse stadig ikke fuldt forstået. Denne artikel undersøger den hypotese, at lipid-baserede nanopartikler er taget op af tumorcellerne og er langsomt nedbrydes. Frigivne dox er derefter omplantes til kernen. For at forhindre fiksering artefakter, kan live-celle imaging og time-lapse mikroskopi, beskrevet i denne eksperimentelle procedure, anvendes.
Introduction
Evnen til at følge en biologisk proces, såsom celle-celle interaktioner, inter- og intracellulære transport, cytotoksiske sammensatte optagelse og protein-protein interaktion mellem enkelt molekyler i levende celler og væv, har vundet stor interesse i seneste årti, da det giver den ekstra dimension i "realtid." I dette manuskript er en metode til at følge gratis dox og dox indarbejdet i nanopartikler (Dox-NP) intracellulære skæbne beskrevet.
Nanopartikler har været anvendt i årtier til behandling af visse kræftformer. DOX-NP er blevet godkendt til behandling af AIDS-relaterede Kaposis sarkom, avanceret æggestokkene og bryst kræft og myelomatose1. Det var en af de første liposomal nanopartikler udviklet og introduceret i de kliniske omgivelser. Fri form, dox, ryddes langt fra blodcirkulationen, begrænse dens evne til at nå tumor sitet i tilstrækkelige mængder. Desuden er behandling ledsaget af alvorlige og begrænsning af dosis side-effekter, såsom stomatitis og hjertesvigt. Når indkapslet i pegyleret liposomal nanopartikler øger omsætning tid fra minutter til dage2. Denne type af kolesterol-holdige Liposom er ganske stabil og denne stabilitet bestemmer farmakokinetik af indkapslede stof.
Denne stivhed har imidlertid en bagside. Cytotoksiske evnen af et sammensat mod tumorceller er første evalueres i in vitro, og det har vist sig at dox er mere potent end Dox-NP i cytotoksiske undersøgelser,3,4. Det var den hypotese, at stabiliteten af luftfartsselskabet forhindrer frigivelse og cellulære optagelse af stoffet, og det er værd at undersøge fænomenet yderligere. De iboende liposomal egenskaber, bygget til at vare de aggressive elementer i blodet og at nå tumor site intakt, resulterede i nedsat biotilgængeligheden af komponenten cytotoksisk (dvs., dox) på mål-webstedet (dvs. tumor cellekerne). Selv om Dox-NP blev hardily forbedret reaktion i forhold til fri form, var det stadig af klinisk værdi, som indkapsling betydeligt reduceret kardiotoksiske virkning5. I de følgende år, blev andre forbindelser indkapslet i nano-luftfartsselskaber6. Også, redigering medbringerne resulterede i udløste drug release (dvs. ved tumor site) men opretholdt stabilitet i blod omløb7,8. Trods års undersøgelse og klinisk brug er intratumoral skæbner af nanocarriers som Dox-NP stadig ikke helt klart. I en nylig publikation, blev det vist, at en nanopartikel taget som helhed, mens dox er stadig fanget i lysosomer9.
Cellulære optagelse af en nanopartikel og narkotika udgivelse er dynamiske processer, der kan bedst overvåges ved hjælp af live-celle billeddannelse. Desuden klassisk histologi, i hvilke celler er udruget og herefter fast, kan give falsk resultater hvis fiksering ødelægger liposomal transportøren og introducerer artefakter. Det vigtigste krav for live-celle imaging er visualisering, fortrinsvis af fluorescens, den ønskede proces. Visse forbindelser, som dox, har en iboende røde fluorescens. Også, fluorescerende markører kan indføres i flyselskabet, og celle organeller kan visualiseres ved hjælp af live-celle markører. På denne måde, kan en række parametre, som optagelsen af transportøren, drug frigivelse og cellulære lokalisering af transportøren og narkotika, afbildet og analyseret. Her, er en metode beskrevet hvor dox og Dox-NP i flere tumorceller intercellulære skæbne er fulgt i realtid. Denne metode kan også være let tilpasses til at skabe de ideelle betingelser for målrettet (f.eks. opkrævet nanopartikler10) og udløst (fx hypertermi7) stof frigivelse.
Protocol
1. forberedelse
- samle den billeddiagnostiske afdeling, som består af to dele.
- Placere en 25 mm cover glas ( figur 1A -1) på den nederste del af salen ( figur 1A -2) og skrue den øverste del i den nederste del ( figur 1A -3). Spænd ikke for hårdt, så glasset kan bryde. Autoklave hele salen ( figur 1A -4).
- Forberede cellekulturmedium ved at supplere Dulbecco ' s ændret Eagle ' s Medium (DMEM) uden phenol rød med 10% varme-inaktiverede føtalt kalveserum (FCS) og 1 mM L-glutamin under sterile forhold. Opbevares ved 4 ° C og varme til 37 ° C inden brugen.
- Vedligehold celler med cellekulturmedium i dyrkning af kolber bruge standard celle kultur teknikker.
Bemærk: Her, to mus cellelinjer, melanom B16BL6 11 og Lewis lunge karcinom (LLC) og to menneskelige melanomer, BLM og 1F6 12, blev brugt. - Gøre 0,1% gelatine af vejning og opløse gelatine i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved 37 ° C natten over. Sterilisere løsningen ved at filtrere det gennem et 0,22 µm filter og opbevares ved 4 ° C.
2. Plade celler
- fjerne den billeddiagnostiske afdeling fra sterilisation taske i en laminar flow kabinet, omhyggeligt stramme kammeret, og placere den i en petriskål.
Bemærk: For at undgå kontaminering, holde den billeddiagnostiske afdeling i en petriskål indtil salen kan placeres under mikroskop. - Pels den billeddiagnostiske afdeling glas med 1 mL af 0,1% sterilt gelatine i 20 min. ved 37 ° C og 5% CO 2.
Bemærk: Dette vil tillade bedre celle attachment. - Fjerne medium fra celle kultur kolberne (Se trin 1,2 og 1,3), vask en gang med 1 x PBS og frigør celler ved hjælp af 0,25% trypsin. Inaktivere trypsin ved at tilføje cellekulturmedium, indsamle cellerne, spin dem ned på 1.100 x g i 5 min og resuspenderes i 5 mL i cellekulturmedium.
- Fortyndes 20 µL af cellesuspension med 20 µL af trypan blå (som vil blive taget af døde celler). Tæl antallet af levende og døde celler ved hjælp af en hemocytometer; antallet af døde celler bør ikke overstige 10%.
- Opsug gelatine og plade celler i en fortynding, der giver mulighed for maksimalt 70% dækning inden for 24 timer. For eksempel, bruge en fortynding af 5 x 10 4 eller 10 x 10 4 celler i 1 mL. Tillader cellerne til at overholde på 5% CO 2 og 37 ° C i 24 h.
3. Time-lapse mikroskopi ( figur 2)
NOTE: her, en Konfokal mikroskop med en specialfremstillet fase indehaveren blev brugt, men de fleste producenter tilbyder en vifte af væksthuse for live-celle imaging der er også velegnet til at undersøge nanoparticulated medicinafgivelse.
- Evaluere celler under mikroskop for confluency, cellulære morfologi og forurening. Placer mødesalen tilbage i CO 2 inkubator.
Bemærk: Confluency bør ikke overstige 70%. Hvis den cellulære morfologi er inkonsekvent (dvs. cellerne ikke overholder) eller forurening er opdaget, kassere den billeddiagnostiske afdeling. - Skifter på Konfokal mikroskop ( figur 1E -1), fluorescerende lys ( figur 1E -2) og computer ( figur 1E -3).
- Tilsluttes målet linse varmelegeme og sæt den til 35 ° C ( figur 1E -4 + insert).
- Forberede inkubation enhed, som vist i figur 1B.
Bemærk: Denne enhed består af et opvarmet fase ( figur 1B -1), en flow fase med et stik til CO 2 rør ( figur 1B -2) og CO 2 sonde ( figur 1B -3), og en rød lukning patch ( figur 1B -4). Programrettelsen er anvendt midlertidigt lukke enheden før den billeddiagnostiske afdeling er placeret. - Placer inkubation enhed på stadiet mikroskop og tilslutte i - og out-routing - flow CO 2 rør ( figur 1E -5). Åbn den vigtigste CO 2 ventil ( figur 1E -6) og tænd for CO 2 controller ( figur 1E -7). Kontroller, at registeransvarlige er sat til 5% CO 2.
Bemærk: For luftfugtighed, CO 2 passerer gennem en luftfugter ( figur 1E -8). For hypoxi eksperimenter, en separat O 2 regulator ( figur 1E -9) er inkluderet i setup. - Indstil fase temperaturen til 37 ° C ( figur 1E -10). For hypertermi eksperimenter, Indstil temperaturen til 42 ° C. Tillad inkubation enhed at nå frem til den valgte temperatur og CO 2 procentdel.
- Tager den billeddiagnostiske afdeling fra de vigtigste CO 2 inkubator og transportere kammer i en petriskål til mikroskopi værelse.
- Placere den billeddiagnostiske afdeling ( figur 1A -4) i en skræddersyet, 35 mm-diameter fase indehaveren ( figur 1A -5) og lukke kammer med skræddersyede forsegling låg ( Figur 1A -6).
Bemærk: Låget tillader CO 2 til at passere og forhindrer fordampning og kontaminering.- Åbne inkubation enhed, erstatte den rød plet med den billeddiagnostiske afdeling, og lukke enhed ( figur 1 c). Gøre dette så hurtigt som muligt for at forhindre nedkøling af celler. Sørg for, at ingen kabler sidder fast mellem fase og mikroskop.
- Forlader enheden til at akklimatisere i 30 min.
- Åbne softwaren og tænde lasere.
Bemærk: Her, 488 nm argon, 543 nm helium-neon og 633-nm helium-neon lasere blev brugt. - Laver en ny database ved at klikke på " New " under fanen fil navn og Gem databasen.
- Konfiguration ved at klikke på " Config " under fanen erhverve " Channel mode " og " enkelt spor " til at evaluere et enkelt fluorophore eller " Multi track " for flere fluorophores. Vælg de passende sporgruppe-pass filtre matchende fluorophore (f.eks. 560 til 615 nm sporgruppe-pass filter for dox og Dox-NP; Se repræsentant resultater for flere eksempler). Vælg den kanal, lyse-felt i et af sporene.
- Sæt scanning kontrol ved at klikke på " Skan " under fanen erhverve sæt rammestørrelse (1.024 x 1.024), scanning hastighed (optimal), Skan retning (8-bit, enkelt), og scanne gennemsnit (4) ved at klikke på " tilstand. " indstillet pinhole (200 µm), gain og offset () fx, 580, 700 og 835; Se figur 3), og laser power (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) ved at klikke på " kanaler. "
- gemme disse indstillinger ved at klikke på " Config " i konfigurationen fane og gemme dem i konfigurationsdatabasen.
- Indstille den time-lapse ved at klikke på " Multi tid X " ( figur 1 d) under fanen makro Klik " enkelt placering ".
- Til at holde cellerne i fokus, vælger den automatiske fokus i makroen ved at klikke på " Auto fokus. "
Bemærk: autofokus opnås med 633-nm laser ved hjælp af refleksion af glasset som et referencepunkt. - Anvende den gemte konfiguration ved at klikke " enkelt spor " eller " Multi track, " rulle til den ønskede konfiguration i konfigurationsdatabasen, indstilling tidsinterval (f.eks 15 min.), antal scanninger (f.eks. 97) og at klikke på " belastning Config. "
Bemærk: ved hjælp af disse indstillinger, en tidsserie af 97 x 15 min = 24 h vil blive foretaget. - Navn time-lapse i den " Base filnavn " og vælg databasen (lavet i trin 3.11) ved at klikke på " billede Data Base " at gemme den time-lapse. Angiv en midlertidig mappe ved at klikke på " Tmp billede mappe. "
NOTE: Hvis systemet stopper eller krak eller anden grund, billederne er placeret i denne mappe. - Åbner for kvægbruget enhed, løfte den billeddiagnostiske ring, tilsættes en dråbe immersionsolie til målet, og luk enheden så hurtigt som muligt. Fokusere og vælge en position i den billeddiagnostiske afdeling.
Bemærk: Denne holdning indeholder celler i en éncellelag, med et minimum af 70% confluency, giver mulighed for billeddannelse af enkelte celler. - Kontrollere konfigurationsindstillingerne for baggrunden og ret det eventuelt.
Bemærk: Baggrunden kan rettes ved at reducere gevinst eller laser power. Enhver ændring i konfigurationen skal gemmes (Se trin 3.17) og indlæst (Se trin 3,18) igen i makroen. - i laminar flow kabinet, fortyndes gratis narkotika eller nanopartikler i en koncentration på 5 µg/mL stof eller 0,05 µmol af lipider i cellekulturmedium. Filtreres gennem et 0,22 µm sprøjte filter hvis narkotika/nanopartikler ikke er sterilt.
- Åbne kvægbruget salen, løfte den forsegling låg, fjerne medium fra cellerne, tilsættes 1 mL fortyndet stof/nanopartikler og lukke enheden så hurtigt som muligt.
- Fokusere på celler og start den time-lapse ved at klikke på " Start Time " i Multi tid X makro.
- Kontroller regelmæssigt for at se, om cellerne er stadig i fokus eller bruge autofokus (Se trin 3.16). Programmet gemmer automatisk de time-lapse i databasen; ikke lukke databasen, mens programmet kører.
4. Dataanalyse
- alt efter den oprindelige problemformulering, bruge software-programmer såsom ImageJ til dataanalyse (Se afsnittet resultater for eksempler).
Representative Results
Mærkning liposomal luftfartsselskaber med forskellige mærker har været tidligere beskrevet9. Luftfartsselskaber, der er mærket med far-red dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine perchlorat (gjorde; Ex = 644 nm; EM = 665 nm) eller grøn 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; EM = 515 nm) er præsenteret i dette håndskrift. At vise intercellulære ligheder og forskelle i liposomal optagelse, udgivelse og intracellulære lokalisering, flere tumortyper blev undersøgt. Disse omfatter to mus linjer, B16BL6 melanom11 og Lewis lunge karcinom (LLC), og to menneskelige melanomer, en yderst metastatisk (BLM) og en ikke-metastaserende (1F6) melanom12,13. Alle eksperimenter blev udført ved hjælp af levende celler. I alle forsøg, en koncentration på 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP eller 0,05 µmol af nanopartikler blev administreret for 3 eller 24 h. Measured og analyseret dox (i form af gratis, udgivne, indkapslede, afsondret eller indtrængere) blev omtalt som DXR. Et 40 X (numerisk blænde: 1.3) olie mål linse blev brugt, og billedbehandling blev udført med en 488 nm argon laser (10% / 0,2 mW strøm) og en 505 til 550 nm sporgruppe-pass filter for CF-PE og lysosomale markør (LM)-grøn. En 543 nm helium-neon-laser (100% / 0.2 mW strøm) og en 560 til 615 nm sporgruppe-pass filter blev brugt til dox, Dox-NP og lysosomale markør-rød. En 633 nm helium-neon laser (100% / 0,5 mW strøm) og en 640 nm long-pass filter blev brugt til gjorde.
På grund af sin indkapsling var i vitro celletoksicitet, biotilgængelighed og farmakokinetik af dox betydeligt ændret3,9,14. Forskellen mellem biotilgængeligheden af stoffet når det administreres i frie og indkapslede form er vist i figur 3. DOX er en intercalating agent og skal indtaste cellekernen bliver cytotoksiske. Figur 3 og relaterede film 1 og 2 viser en 3 h time-lapse af BML celler behandles med dox eller Dox-NP identiske betingelser. Inden for få minutter af dox eksponering, nukleare DXR kan observeres (figur 3A, film 1), og ved hjælp af en lavere få (Indsæt), kan ses intercalating i kernen. Derimod når de udsættes for Dox-NP, er intracellulære DXR næppe synlige inden for denne tidsramme (figur 3B, Movie 2). Kun ved at øge photomultiplier gevinst, der kan observeres DXR i cytoplasma (indsætte). Bruger ImageJ, blev pixel tætheder af cytoplasmatisk og nukleare DXR analyseret. Som celler er i bevægelse under time-lapse evaluering, er det vigtigt at kombinere fluorescerende med lysfelt billeder. Dette giver mulighed for at spore individuelle celler og stabilisere XY-drift ved hjælp af specifikke plugins i ImageJ. I den analyse, der præsenteres i figur 3, blev lysfelt billedet brugt til at tegne en region af interesse (ROI) rundt i cytoplasma (solid line) og kerne (stiplet linje). ROI manager i ImageJ kan findes i menupunktet analyser > værktøjer > ROI manager. Disse ROIs anvendes i fluorescerende billedet til at analysere pixeltæthed ved hjælp af menupunktet analyser > foranstaltning. Forskellen mellem pixeltæthed i cellekernen (figur 3 c) og cytoplasma (figur 3D) af dox - eller Dox-NP-behandlede celler bekræfter, hvad der er set i billederne. Også, blev cellerne inkuberes i 24 h med dox eller Dox-NP, hvorefter sammensat blev erstattet af medium og straks afbildet med øget følsomhed af photomultiplier gevinst (figur 4). Andre indstillinger, såsom laser power, offset, pinhole og billedvisning, var identiske. Lav DXR signalet i Dox-NP-behandlede i forhold til dox-behandlede celler er slående. Ved hjælp af en gevinst på 700, bliver DXR i de Dox-NP-behandlede celler synligt, mens billedet af dox er allerede overeksponeret. Denne enkle in vitro- eksperiment visualiserer en betydelig forskel i biotilgængelighed af frie versus indkapslede stof.
Når celler er konstant udsat for Dox-NP for 24 h, bygger DXR over tid, som vist i figur 5A og film 3 og 4. Signalet øger i cytoplasmaet, og senere, DXR er også fundet imidlerid i kernen. Disse bemærkninger er bekræftet af pixel tæthed grafer (figur 5B). Den målte cytoplasmatisk pixeltæthed er lavere i BML i forhold til 1F6 celler på grund af forskellen i intracellulære distribution. Mens DXR i 1F6 celler er fordelt i hele cellen, er DXR i BLM celler mere koncentreret i en organelle tæt på kernen (figur 5 c).
Derfor, lokalisering af narkotika og carrier i forskellige cellelinier (figur 6) blev undersøgt. Celler var inkuberes i 24 timer med Dox-NP/gjorde og afbildet. Bruger lysfelt billede, blev en overlejring af cellemembranen (solid line) og kerne (stiplet linje) tegnet i fluorescerende billedet af tre forskellige cellelinjer. Det fremgår her, at luftfartsselskabet, mærket med, følger den samme cytoplasmatisk mønster som DXR: koncentreret i en organelle tæt på kernen i BLM, omkring hele kernen i LLC, og tilfældigt spredt over hele cytoplasma i B16BL6 celler. I kernen, kun DXR og ingen kan ses, med angivelse af udgivet dox. Ved at reducere photomultiplier gevinst, individuelle cellulære vesikler indeholdende DXR og transportør, mærket med gjorde, samt med CF-PE (tal 6B og 6 C), kan ses.
Cytoplasmatisk DXR sequesters i små blærer, og celler var mærket med en live-celle lysosomale markør i grøn eller rød. Flytning af disse lysosomer kan følges i celler (Movie 5). Cytoplasmatisk DXR og nanocarrier colocalize inden for disse strukturer, og intercellulære forskellen i DXR mønster, som det ses i figur 6, er forklaret her. Lysosomer er tilfældigt fordelt over hele cytoplasma i B16BL6 og er placeret ved siden af kernen i BLM celler (figur 7A). Bruger ImageJ, colocalization mellem DXR og carrier i lysosomet beregnedes (figur 7B). Farvebilleder blev foretaget binære (proces > binære > gøre binære) og ved hjælp af colocalization plug-in (analyser > Colocalization), en colocalization billede blev lavet af DXR med gjorde. Dette skaber en grøn-rød-hvid farvede billede, med hvide pixels repræsenterer begge billeder colocalized pixels. Via menuen element proces > binære > gøre binære, de hvide pixel bliver adskilt og konverteret til sort pixel, hvorfra pixeltæthed måles (analyser > foranstaltning). Derefter en colocalization billede blev foretaget mellem denne DXR-image og binære billedet af den lysosomale markør (LM) og pixeltæthed målt. Colocalization data er procentdelen af pixels positive for DXR-gjorde og DXR-gjorde/lysosomale markør (figur 7C). At luftfartsselskabet, mærket med CF-PE samt som gjorde, er beliggende i lysosomet er også vist i figur 7 d.
Figur 1: instrumenter og udstyr setup. A) imaging kammer + fornødenheder. 25 mm #1 cover glas (1), nederste del af salen (2), top del af salen (stedd på hovedet ned) og O-ring (3), fase kortholderen (4) og forsegling låg (5). Skalalinjen: 2 cm. B) inkubation enhed. Opvarmet mikroskop fase (1), flow fase med i - og out-routing - flow for CO2 (2), en CO2 sonde (3) og en afsluttende patch (4). Skalalinjen: 2 cm. C) tænkelig kammer i inkubator enhed, som ses under mikroskop. D) multi tid serien makro. E) udstyr til billedbehandling. Inverteret mikroskop (1), fluorescerende lys (2), computer (3), ring varmelegeme (4, Indsæt) og controller (4, vigtigste figur), CO2 flow slanger (5), CO2 ventil (6), CO2 controller (7), CO2 luftfugter (8), O2 ventil og controller (9), og scenen temperatur controller (10). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af parametrene mikroskop detaljeret i protokollen afsnit 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: undersøge den kortsigtede udbredelsen af dox og Dox-NP. BLM celler blev hele tiden udsat for dox eller Dox-NP for 3 h og en time-lapse blev taget. (A) stadig billeder af time-lapse af cellerne inkuberes med dox. (B) stadig billeder af time-lapse af cellerne inkuberes med Dox-NP. Skalalinjen = 50 µm. (C) Pixel tæthed stigning af nukleare DXR i dox - og Dox-NP-behandlede celler. (D) Pixel tæthed stigning af cytoplasmatisk DXR i dox - og Dox-NP-behandlede celler. Data repræsenterer den gennemsnit ± SD 3 celler pr. felt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: undersøge den langsigtede udbredelsen af dox og Dox-NP i forskellige cellelinier. Celler blev udsat for dox eller Dox-NP og afbildet 24 timer senere. Billeder blev taget umiddelbart efter afskaffelsen af narkotika, med 3 forskellige gevinster. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: undersøge den cellulære optagelse og frigivelse af liposomal agenter. Celler var konstant udsat for Dox-NP i 24 timer, og en time-lapse foregik. (A) stadig billeder af de time-lapse. Skalalinjen = 50 µm. (B) Pixel tæthed stigning af DXR i kernen og cytoplasmaet. Data repræsenterer den gennemsnit ± SD 3 celler pr. felt. (C) billeder demonstrere lokalisering af DXR i cellen. Streg: cellemembranen, stiplede linje: kerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: undersøge lokalisering af narkotika og carrier i forskellige cellelinier. (A) celler blev udsat for Dox-NP/gjorde i 24 timer og afbildet. Skalalinjen = 50 µm. (B) celler blev udsat for Dox-NP/gjorde/CF-PE i 24 timer og afbildet med en lavere intensitet gevinst at skelne enkelte vesikler. (C) Bright-felt og DXR overlay viser DXR i cytoplasmatisk vesikler (pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: undersøgelse af de intracellulære lokalisering af narkotika og transportør. Celler blev udsat for Dox-NP/gjorde eller CF-PE/gjorde i 24 timer, og lysosomer er visualiseret ved hjælp af live-celle lysosomale markør (LM) i grøn eller rød. (A) intracellulære lokalisering af DXR og carrier (gjorde). Pile repræsenterer 3 eksempler på DXR og gjorde lokaliseret i lysosomet. Skalalinjen = 50 µm. (B) Co lokalisering analyse af DXR og transportør (gjorde) i lysosomer (LM) ved hjælp af ImageJ. (C) procentdel af co lokalisering af DXR og carrier i lysosomer. Data repræsenterer den gennemsnit ± SEM af 3 individuelle eksperimenter. (D) lysosomale binding af luftfartsselskabet visualiseres ved hjælp af to forskellige markører. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: relateret til Figur 3 : BLM celler blev inkuberet med dox for 3 h. Time-lapse: 19 billeder med et interval på 10 min. framerate: 3 fps. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 2: relateret til Figur 3 : BLM celler blev udruget Dox - NP for 3 h. Time-lapse: 19 billeder med et interval på 10 min. framerate: 3 fps. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 3: relateret til Figur 5 : BLM celler blev udruget Dox - NP for 24 h. Time-lapse: 96 billeder med et interval på 15 min. framerate: 8 fps. Skalalinjen = 50 µm. Klik venligst her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Movie 4: relateret til Figur 5 : 1F6 celler blev inkuberet med Dox-NP 24 h. Time-lapse: 96 billeder med et interval på 15 min. framerate: 8 fps. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 5: relateret til Figur 7 : Lysosomer af B16BL6 celler blev farves med en live-celle markør. Time-lapse: 10 billeder med et interval på 10 s. framerate: 3fps. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Discussion
Som bemærket tidligere, fiksering kan ødelægge liposomal nanocarriers næsten øjeblikkeligt og DXR udgivet form disse ødelagte Liposomer stadig havde tid til at indtaste kernen, at gøre fortolkningen af data meget vanskeligt og endda vildledende. Med nogle mikroskopiske justeringer, kan den kemoterapeutiske skæbne i levende celler og væv undersøges rutinemæssigt for at bekræfte eller vælte histologiske observationer. Et nyligt papir viste optagelse, udgivelse og lokalisering af DXR i celler behandles med frie og indkapslede dox ved hjælp af live-celle time-lapse imaging9. Den eksperimentelle opsætningen nærmere beskrives dette arbejde. Med denne model, er det muligt at visualisere den umiddelbare transport af dox til kernen, hvor det løbende ophobes indtil cellen dør til sidst. Derimod når Dox-NP er brugt, er kun små mængder af frigivne dox fundet i kernen. Selv om kontinuerlig eksponering resulterer i løbende DXR oprustning, den fluorescerende signal er meget lavere i Dox-NP-versus dox-behandlede celler, der angiver en forskel i cellulære koncentration og efterfølgende cytotoksicitet. Desuden ved hjælp af live-celle markører, var det vist, at når udsætter celler til Dox-NP, DXR og nanocarrier er placeret i lysosomet. Dette angiver, at den komplette Liposom er taget op af cellen og demonstrerer inddragelse af en endocytic pathway under optagelsen af disse nanopartikler. DXR i kernen er klart fra frigivne dox. Men ved hjælp af denne metode, som både DXR og transportør Co lokalisere og synes at være fanget i lysosomer, det er stadig usikkert om det er indkapslet eller udgivet dox. Det er muligt, at den iboende stabilitet af nanopartikel forhindrer dox release når lokaliseret i lysosomet.
I denne protokol demonstreres live-celle imaging ved hjælp af en specifik mikroskopiske opsætning, med en specialfremstillet fase indehaveren (specifikationerne kan gives på anmodning). Dog tilbyder mest Konfokal mikroskop fremstiller en vifte af væksthuse, der udfører live-celle billeddannelse. Bevare celle kultur betingelser (dvs., temperatur, CO2, pH, fugtighed og sterilitet) er det vigtigste kriterium for disse væksthuse og kræver nogle indledende test for at fastlægge de rette betingelser, som er yderligere forklaret. Automatiseret data erhvervelse programmer kan også leveres af de samme fremstiller. En "Multi placering" valgmulighed gør det muligt at billedet flere positioner i den samme afdeling, raffinering statistisk analyse. Denne indstilling i den makro, der er nævnt i dette manuskript kræver imidlertid fast XYZ holdninger, hvorved muligheden for at korrigere for Z-drift er tabt. Scanning Z-dimension kan medtages i denne makro og bruger en fokus flyet til analyse. Det kræver dog ekstra scanning, hvilket øger muligheden for fototoksicitet og blegning.
Som med alle fluorescerende målinger, er overeksponering et problem, især når man sammenligner to forbindelser med en forskellige cellulære optagelse. Den fluorescerende intensitet er ikke kun afhængige af den iboende signal af sammensat, men også efter satsen for udbredelse, koncentration og stof eksponeringstid. Som vist i figur 3, er nukleare DXR indholdet af dox-behandlede celler allerede synlige, mens intet signal er set i Dox-NP-behandlede celler. Kun ved at øge gevinsten kan DXR i Dox-NP-behandlede celler visualiseres, fører til overeksponering i dox-behandlede celler. Desuden selv intracellulært Dox-NP er uensartet fordelt, hvilket kan resultere i uundgåelige under- eller overeksponering. Især når at undersøge de cellulære DXR fastklemning, blev gevinsten reduceret betydeligt for at skelne mellem enkelte organeller (tal 5B og 5 C). Således skal målingerne repræsenteret ved pixeltæthed ledsages af de repræsentative billeder til den rette fortolkning af resultaterne.
Fototoksicitet, blegning og et lavt signal / støj-forhold er også vigtige spørgsmål i fluorescerende mikroskopi, og et kompromis mellem seriøs i billedet og image erhvervelse skal fastsættes. Selv når opsætningen mikroskop er optimal, er billedkvaliteten dog også i vid udstrækning bestemt af kvaliteten af cellerne og det ekstra stof. DXR giver et stærkt signal, og med de rette forholdsregler, blegning blev ikke observeret, selv efter længere perioder (op til 72 timer). Reduktion af de fluorescerende signal kan dog også være et resultat af efflux. Efflux er et vigtigt fænomen i drug resistance15 og opstår, når celler pumpe ud stof fra den intracellulære site af handling. Et fald på fluorescerende signalet over tid kan derfor også være et resultat af dox efflux9. Sammenligne det fluorescerende signal om en ikke-scannede placering i slutningen af forsøget med det sidste billede fra time-lapse serien vil demonstrere blegning (dvs. signalet vil være højere i de ikke-scannede placering) eller efflux (dvs. både signaler vil være identiske). Flere correctional indstillinger (f.eks. baggrund, drift, blegning, etc.) er tilgængelige i programmer som ImageJ16. Også, som fluorescerende intensiteten stiger over tid, konfigurationsindstillingerne kan være pre evalueres i en pilot eksperiment at minimere overeksponering for enden af den time-lapse (trin 3,21). Alternativt, en billeddannelse kammer med celler allerede udsat for stoffet i den ønskede tidsperiode kan bruges til at initialisere indstillingerne. Endelig, for denne form for analyse, giftige stof koncentrationer (trin 3.22) bør undgås og fastlagt på forhånd ved hjælp af konventionelle bio-assays.
Celler er løbende kulturperler og vedligeholdes i medium uden phenol rød. Phenol rød fluorescerer i den røde del af spektret og kan observeres i cellulære organeller, mest sandsynligt lysosomer, præsentation af falsk-positive oplysninger (trin 1.2). For at muliggøre overvågning af individuelle celler, bør celle sammenløbet ikke overstige 70% (trin 3.1.). CO2 flow-hastighed (trin 3.5) skal reguleres i en validering eksperiment når udstyret er købt eller efter vedligeholdelse. Når hastigheden er for høj, vil medium fordampe. Når hastigheden er for lav, vil medium pH stige, som kan påvirke cellevækst. Som mediet uden er phenol rød pH indikator ændringer i pH ikke kan iagttages og er derfor let overset. CO2 flow er blevet godkendt, kan disse indstillinger bruges i alle fremtidige eksperimenter.
Ved hjælp af metoden beskrevet her, kan skæbne af nanopartikler nemt undersøges ved hjælp af live-celle imaging og time-lapse mikroskopi. I denne procedure brugt kommercielt tilgængelige nanopartikler. Men skæbnen, thermosensitive17, kationiske Liposomer10; Liposomer beriget med kortkædede shingolipids18; og nanopartikler indkapsling af andre narkotika,8,19 blev også undersøgt på denne måde i tumor og normale celler.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Mikroskopi faciliteter bruges er en del af Erasmus-optisk Imaging Center, og vi vil gerne takke personalet OIC for deres tjenester.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
