Summary
Formazione immagine della vivere-cella è un potente strumento per la visualizzazione di processi dinamici. L'esame delle cellule fisse fornisce solo immagini statiche, che possono portare a interpretazioni erronee e confusione circa il processo. Questo lavoro presenta un metodo per studiare l'assorbimento, rilascio di farmaci e localizzazione intracellulare di nanoparticelle liposomiale in cellule viventi.
Abstract
Tecniche di imaging convenzionale possono fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari. Tuttavia, queste informazioni sono basate su immagini statiche in un sistema altrimenti dinamico e fasi successive sono facilmente trascurate o male interpretate. Imaging di cellule vive e microscopia time-lapse, in cui le cellule viventi possono essere seguite per ore o persino giorni in maniera più o meno continua, pertanto sono molto ben informativi. Il protocollo qui descritto consente l'indagine del destino delle nanoparticelle chemioterapeutici dopo la consegna della doxorubicina (dox) in cellule viventi. DOX è un agente intercalante che deve essere liberato dalla sua nanocarrier diventare biologicamente attivi. Nonostante la registrazione clinica per più di due decenni, sua l'assorbimento, la ripartizione e il rilascio di farmaci ancora completamente non sono capiti. Questo articolo esplora l'ipotesi che le nanoparticelle basata sui lipidi sono presi dalle cellule del tumore e sono lentamente degradate. Rilasciato dox è quindi trasloca nel nucleo. Per evitare artefatti di fissazione, formazione immagine della vivere-cella e microscopia time-lapse, descritto in questa procedura sperimentale, possono essere applicati.
Introduction
La capacità di seguire un processo biologico, quali le interazioni cellula-cellula, inter- e trasporto intracellulare, l'assorbimento di composto citotossico e interazione proteina-proteina di singole molecole in cellule viventi e tessuti, ha guadagnato grande interesse negli ultimi decennio, poiché fornisce la dimensione del "tempo reale". In questo manoscritto, è descritto un metodo per seguire il destino intracellulare di dox gratis e dox incorporato in nanoparticelle (Dox-NP).
Le nanoparticelle sono state utilizzate per decenni per il trattamento di alcuni tumori. DOX-NP è stato approvato per il trattamento del sarcoma di Kaposi correlato all'AIDS, avanzata ovarico e tumore al seno e mieloma multiplo1. È stato uno dei prime nanoparticelle liposomiale sviluppato e introdotto nella regolazione clinica. La forma libera, dox, viene cancellata enormemente la circolazione del sangue, limitando la sua capacità di raggiungere il sito di tumore in quantità sufficiente. Inoltre, il trattamento è accompagnata da effetti collaterali gravi e dose-limitanti, come stomatite e insufficienza cardiaca. Quando incapsulato in nanoparticelle liposomiale pegilata aumenta il tempo di circolazione da minuti a giorni2. Questo tipo di colesterolo-contenere liposoma è abbastanza stabile e questa stabilità determina la farmacocinetica del farmaco incapsulato.
Tuttavia, questa rigidità ha un lato negativo. La capacità citotossica di un composto verso le cellule del tumore è prima valutato in vitro, ed è stato dimostrato che dox è più potente di Dox-NP in citotossici dosaggi3,4. È stato supposto che la stabilità del vettore previene il rilascio e l'assorbimento cellulare del farmaco, e vale la pena di indagare ulteriormente questo fenomeno. Le proprietà intrinseche liposomiale, costruite per durare gli elementi aggressivi nel flusso sanguigno e raggiungere il luogo del tumore intatto, ha provocato la biodisponibilità alterata del componente citotossico (cioè, dox) presso il sito di destinazione (cioè, il tumore nucleo cellulare). Anche se Dox-NP arditamente migliorato la risposta rispetto a forma libera, era ancora di valore clinico, come incapsulamento ha ridotto significativamente gli effetti cardiotossici5. Negli anni successivi, altri composti sono stati incapsulati in nano-vettori6. Inoltre, modificando gli elementi portanti ha provocato il rilascio di farmaci innescata (cioè, al luogo del tumore), ma mantenuto la stabilità nel sangue circolazione7,8. Nonostante anni di indagine ed uso clinico, i destini di intratumoral di nanovettori come Dox-NP non sono ancora del tutto chiaro. In una recente pubblicazione, è stato dimostrato che le nanoparticelle sono preso nel suo complesso mentre il dox rimane intrappolato nei lisosomi9.
L'assorbimento cellulare di un rilascio di nanoparticelle e droga sono processi dinamici che meglio possono essere monitorati usando la formazione immagine di cellule vive. Inoltre, l'istologia classica, in cui le cellule vengono incubate e successivamente fissato, può dare risultati falsi se la fissazione distrugge il carrier liposomiale e introduce artefatti. Il requisito principale per l'imaging di vivere-cella è visualizzazione, preferibilmente mediante fluorescenza, del processo desiderato. Alcuni composti, come dox, hanno un'intrinseca fluorescenza rossa. Inoltre, marcatori fluorescenti possono essere introdotti nel vettore e organelli delle cellule possono essere visualizzati utilizzando marcatori di cellule vive. In questo modo, una matrice di parametri, come l'assorbimento del vettore, rilascio di farmaci e localizzazione cellulare di droga e il vettore può essere imaged e analizzata. Qui, un metodo è descritto in cui il destino intercellulare di dox e Dox-NP in diverse cellule del tumore è seguito in tempo reale. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato per creare le condizioni ideali per mirati (ad esempio, le nanoparticelle10a carico) e attivato (ad es., ipertermia7) rilascio di farmaci.
Protocol
1. preparazione
- montare la camera imaging, che consiste di due parti.
- Mettere un vetro di copertura di 25 mm ( fig. 1A -1) nella parte inferiore dell'alloggiamento ( fig. 1A -2) e avvitare la parte superiore nella parte inferiore ( fig. 1A -3). Non serrare troppo duro, come il vetro può rompersi. Autoclave l'intera camera ( Figura 1A -4).
- Preparare il terreno di coltura cellulare completando Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) senza rosso fenolo con 10% di siero fetale di vitello inattivato per calore (FCS) e 1 mM L-Glutammina in condizioni sterili. Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
- Mantenere le cellule con terreno di coltura di cellule in coltura boccette utilizzando tecniche di coltura cellulare standard.
Nota: Qui, due linee di cellule di topo, melanoma B16BL6 11 e Lewis lung carcinoma (LLC) e due melanomi umani, BLM e 1F6 12, sono state usate. - Marca 0,1% gelatina pesando e sciogliere la gelatina in tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C durante la notte. Sterilizzare la soluzione filtrandola attraverso un filtro da 0,22 µm e conservare a 4 ° C.
2. Piastra di cellule
- rimuovere la camera imaging dal sacchetto di sterilizzazione in un flusso laminare, attentamente stringere la camera e metterlo in una capsula Petri.
Nota: Per evitare contaminazioni, tenere la camera di imaging in una capsula Petri fino a quando la camera può essere posta sotto il microscopio. - Cappotto il vetro della camera imaging con 1 mL di 0,1% gelatina sterile per 20 min a 37 ° C e 5% CO 2.
Nota: Questo permetterà il migliore collegamento delle cellule. - Rimuovere il mezzo dai palloni coltura delle cellule (Vedi punti 1.2 e 1.3), lavare una volta con PBS 1X e staccare le celle utilizzando 0,25% tripsina. Inattivare la tripsina aggiungendo mezzo di coltura cellulare, raccogliere le cellule, li spin giù a 1.100 x g per 5 min e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura cellulare.
- Diluire 20 µ l di sospensione cellulare con 20 µ l di trypan blu (che sarà ripreso dalle cellule morte). Contare il numero di cellule vive e morte utilizzando un emocitometro; il numero di cellule morte non dovrebbe superare il 10%.
- Aspirare la gelatina e piastra le cellule in una diluizione che consente un massimo di 70% di copertura entro 24 h. Ad esempio, utilizzare una diluizione di 5 x 10 4 o 10 x 10 4 cellule in 1 mL. Permettono alle cellule di aderire alle 5% CO 2 e 37 ° C per 24 h.
3. Time-lapse microscopia ( Figura 2)
Nota: qui, è stato utilizzato un microscopio confocale con un supporto su misura di fase, anche se la maggior parte dei produttori offrono una gamma di incubatrici per vivere-cella di imaging che è adatto anche per indagare la consegna della droga nanoparticulated.
- Valutare le cellule al microscopio per confluency, morfologia cellulare e contaminazione. Posizionare la camera torna in incubatrice 2 CO.
Nota: Il confluency non deve superare il 70%. Se la morfologia cellulare è incoerente (cioè, le cellule non aderiscono) o contaminazione viene rilevato, scartare la camera imaging. - Accendere il microscopio confocale ( Figura 1E -1), luce fluorescente ( Figura 1E -2) e computer ( Figura 1E -3).
- Collegare il riscaldatore lente dell'obiettivo e impostarlo a 35 ° C ( Figura 1E -4 + inserto).
- Preparare l'unità di incubazione, come mostrato in Figura 1B.
Nota: Questa unità consiste di un piatto riscaldato ( Figura 1B -1), una fase di flusso con un connettore per i tubi di 2 ( Figura 1B -2) di CO e CO 2 sonda ( Figura 1B -3) e una macchia di rosso chiusura ( Figura 1B -4). Questa patch viene utilizzata per chiudere temporaneamente l'unità fino a quando la camera di formazione immagine è posta. - Posizionare l'unità di incubazione sul tavolino del microscopio e collegare i in - e out - flow CO 2 tubi ( Figura 1E -5). Aprire la valvola principale di 2 CO ( Figura 1E -6) e accendete il regolatore di CO 2 ( Figura 1E -7). Verificare che il controller è impostato su 5% CO 2.
Nota: Per l'umidità, CO 2 passa attraverso un umidificatore ( Figura 1E -8). Per esperimenti di ipossia, un regolatore di 2 O separato ( Figura 1E -9) è incluso nel setup. - Impostare la temperatura di fase a 37 ° C ( Figura 1E -10). Per gli esperimenti di ipertermia, regolare la temperatura di 42 ° C. Consenti all'unità di incubazione di raggiungere la temperatura selezionata e la CO 2 percentuale.
- Prendere la camera imaging dal principale CO 2 incubator e trasporti della camera in una capsula Petri per la camera di microscopia.
- Posizionare la camera di formazione immagine ( Figura 1A -4) in un su misura, 35 mm-diametro tappa titolare ( Figura 1A -5) e chiudere la camera con un coperchio di tenuta su misura ( Figura 1A -6).
Nota: Il coperchio permette di CO 2 passare ed evita l'evaporazione e contaminazione.- Aprire l'unità di incubazione, sostituire la macchia rossa con la camera di imaging e chiudere l'unità ( Figura 1). Farlo più velocemente possibile per evitare il raffreddamento delle cellule. Assicurarsi che i cavi non sono bloccati fra la fase e il microscopio.
- Lasciare l'unità acclimatare per 30 min.
- Aprire il software e accendere il laser.
Nota: Qui, servivano 488 nm argon, 543 nm elio-neon e laser elio-neon di 633 nm. - Fare un nuovo database facendo clic su " New " sotto la scheda File nome e salvare il database.
- Impostare la configurazione facendo clic " Config " sotto la scheda di acquisizione, selezionare " modalità canale " e " singola traccia " per valutare un fluoroforo singolo o " Multi traccia " per diversi fluorofori. Selezionare i filtri passa-banda adeguata corrispondenza il fluoroforo (ad es., 560 a 615 nm filtro passa-banda per dox e Dox-NP; si veda i risultati rappresentante per ulteriori esempi). Selezionare il canale luminoso-campo in uno dei brani.
- Impostare il controllo di scansione facendo clic su " Scan " sotto la scheda di acquisizione impostare le dimensioni della cornice (1.024 x 1.024), velocità di scansione (ottimale), scansione direzione (8-bit, single) e media (4) la scansione facendo clic " modalità. " impostare il foro stenopeico (200 µm), guadagno e offset ( ad esempio, 580, 700 e 835; vedere la Figura 3) e potenza del laser (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) cliccando " canali. "
- salvare queste impostazioni facendo clic su " Config " nella configurazione scheda e salvarli nel database di configurazione.
- Impostare il time-lapse facendo " Multi tempo X " ( Figura 1) nella scheda Macro fare clic " singola posizione ".
- Di mantenere le cellule in stato attivo, selezionare la messa a fuoco automatica nella macro facendo " Auto Focus. "
Nota: Autofocus è realizzato con il laser di 633 nm utilizzando il riflesso del vetro come punto di riferimento. - Applica la configurazione salvata cliccando " singola traccia " o " Multi traccia, " lo scorrimento per la configurazione necessaria nel database di configurazione, impostare l'intervallo di tempo (ad es., 15 min), numero di scansioni (ad es., 97) e cliccando " Load Config. "
Nota: utilizzando queste impostazioni, vengono effettuata una serie temporale di 97 x 15 min = 24 h. - Nome del time-lapse nel " Nome File Base " e selezionare il database (fatto al punto 3.11) facendo clic su " Base di dati di immagine " per salvare il time-lapse. Impostare una cartella temporanea facendo " Tmp immagine cartella. "
Nota: se il sistema si arresta o si blocca per qualsiasi motivo, le immagini si trovano in questa cartella. - Aprire l'unità di incubazione, sollevare l'anello imaging, aggiungere una goccia di olio per immersione all'obiettivo e chiudere l'unità più velocemente possibile. Concentrarsi e selezionare una posizione nella camera imaging.
Nota: Questa posizione contiene cellule in monostrato, con un minimo di 70% confluency, consentendo per l'imaging delle singole celle. - Controllare le impostazioni di configurazione per lo sfondo e correggere se necessario.
Nota: Lo sfondo può essere corretto riducendo la potenza di guadagno o laser. Qualsiasi cambiamento nella configurazione deve essere salvato (Vedi punto 3.17) e caricato (vedere passaggio 3.18) nuovamente nella macro. - Nel flusso laminare, diluire il farmaco libero o nanoparticelle a una concentrazione di 5 µ g/mL droga o 0,05 µmol di lipidi nel mezzo di coltura cellulare. Filtrare attraverso un filtro per siringa da 0,22 µm se la droga/nanoparticelle non sono sterili.
- Aprire la camera di incubazione, sollevare il coperchio di tenuta, rimuovere il supporto dalle cellule, aggiungere 1 mL di farmaco diluite/nanoparticelle e chiudere l'unità più velocemente possibile.
- Concentrarsi sulle cellule e inizio il time-lapse cliccando " Start Time " nella macro Multi tempo X.
- Controllare regolarmente per vedere se le cellule sono ancora a fuoco o utilizzare l'autofocus (Vedi punto 3.16). Il programma salva automaticamente il time-lapse nel database; non chiudere il database mentre è in esecuzione il programma.
4. Analisi dei dati
- a seconda della domanda di ricerca originale, utilizzare programmi software come ImageJ per analisi dei dati (vedere la sezione risultati per esempi).
Representative Results
Etichettatura vettori liposomiali con differenti marcatori è stato descritto in precedenza9. Vettori etichettati con Diottadecilbis da' tetramethylindotricarbocyanine perclorato (fatto; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) o verde 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm) sono presentati in questo manoscritto. Per visualizzare intercellulare analogie e differenze nell'assorbimento liposomiale, rilascio e localizzazione intracellulare, sono stati studiati diversi tipi di tumore. Questi includono due righe del mouse, il melanoma B16BL611 e il carcinoma del polmone di Lewis (LLC) e due melanomi umani, un altamente metastatico (BLM) e un non-metastatico (1F6) melanoma12,13. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando le cellule viventi. In tutti gli esperimenti, una concentrazione di 5 µ g/mL dox, 5 µ g/mL Dox-NP o 0,05 µmol di nanoparticelle sono stati amministrati ai 3 o 24 h. misurato e analizzato dox (in forma gratuita, rilasciata, incapsulato, sequestrato o intercalata) sono stati denominati DXR. Un 40x (apertura numerica: 1.3) obiettivo di olio è stato usato, e imaging è stata eseguita con un laser di argon 488 nm (10% / 0,2 mW di potenza) e un filtro passa-banda di 505 a 550 nm per CF-PE e marcatore lisosomiale (LM)-verde. Un laser a elio-neon 543 nm (100% / 0,2 mW di potenza) e un filtro passa-banda di 560 ÷ 615 nm è stato utilizzato per dox, Dox-NP e lysosomal marcatore rosso. Un laser a elio-neon 633 nm (100% / 0,5 mW di potenza) e un filtro di passa-lungo 640 nm è stato utilizzato per fatto.
A causa del suo incapsulamento, la citotossicità in vitro , la biodisponibilità e la farmacocinetica di dox erano significativamente alterata3,9,14. La differenza tra la biodisponibilità del farmaco quando somministrata in forma libera e incapsulata è illustrata nella Figura 3. DOX è un agente intercalante e deve entrare nel nucleo delle cellule a diventare citotossico. Figura 3 e relative al film 1 e 2 mostrano un 3h time-lapse di BLM cellule trattate con dox o Dox-NP in condizioni identiche. In pochi minuti di esposizione di dox, DXR nucleare può essere osservato (Figura 3A, Movie 1) e, utilizzando un basso guadagno (inserto), può essere visto intercalanti nel nucleo. Al contrario, quando esposto al Dox-NP, DXR intracellulare è difficilmente visibile entro questo lasso di tempo (Figura 3B, Movie 2). Solo aumentando il guadagno di fotomoltiplicatore, può essere osservato DXR nel citoplasma (inserire). Usando ImageJ, la densità di pixel di DXR citoplasmatici e nucleari sono stati analizzati. Come le cellule sono in movimento durante la valutazione di time-lapse, è importante combinare fluorescenti con immagini luminose del campo. Questo presenta la possibilità di monitoraggio delle singole celle e di stabilizzare la XY-deriva utilizzando plugin specifici in ImageJ. Nell'analisi presentata nella Figura 3, l'immagine di campo chiaro è stata utilizzata per disegnare un'area di interesse (ROI) intorno al citoplasma (linea continua) e nucleo (linea tratteggiata). Il direttore di ROI in ImageJ può essere trovato nella voce di menu Analyze > strumenti > manager di ROI. Questi ROIs vengono utilizzati nell'immagine fluorescente per analizzare la densità di pixel utilizzando la voce di menu Analyze > misura. La differenza tra la densità di pixel nel nucleo (Figura 3) e citoplasma (Figura 3D) delle cellule dox o Dox-NP-trattate conferma ciò che si vede nelle immagini. Inoltre, le cellule sono state incubate per 24 h con dox o Dox-NP, dopo che il composto è stato sostituito dal mezzo e immediatamente imaged con sensibilità aumentata del guadagno fotomoltiplicatore (Figura 4). Altre impostazioni, quali il potere del laser, offset, pinhole e visualizzazione delle immagini, erano identici. Il segnale basso DXR in cellule rispetto ai trattati con dox Dox-NP-trattate è impressionante. Utilizzando un guadagno del ' 700, DXR nelle cellule Dox-NP-trattate diventa visibile, mentre l'immagine di dox è già sovraesposta. Questo esperimento semplice in vitro Visualizza una differenza significativa nella biodisponibilità di libero contro droga incapsulato.
Quando le cellule sono continuamente esposte a Dox-NP per 24 h, DXR accumula nel tempo, come mostrato in Figura 5A e filmati 3 e 4. Il segnale aumenta nel citoplasma, e più tardi, DXR trova anche intercalate nel nucleo. Queste osservazioni sono confermate nei grafici di densità di pixel (figura 5B). La densità di pixel citoplasmico misurato è inferiore in BLM confrontato alle cellule di 1F6 a causa della differenza nella distribuzione intracellulare. Mentre DXR in cellule 1F6 è distribuita in tutta la cellula, DXR in cellule di BLM è più concentrato in un organello vicino al nucleo (Figura 5).
Di conseguenza, è stata studiata la localizzazione di droga e carrier in differenti linee cellulari (Figura 6). Le cellule sono state incubate per 24 h con Dox-NP/fatto e imaged. Usando l'immagine di campo chiaro, una sovrapposizione della membrana cellulare (linea continua) e nucleo (linea tratteggiata) è stata disegnata nell'immagine fluorescente di tre linee cellulari differenti. È dimostrato qui che il vettore, etichettato con, segue lo stesso schema citoplasmatico come DXR: concentrato in un organello vicino al nucleo BLM, intorno al nucleo intero in LLC e casualmente sparsi in tutto il citoplasma in cellule di B16BL6. Nel nucleo, solo DXR e nessun può essere visto, che indica rilasciato dox. Riducendo il guadagno di fotomoltiplicatore, vescicole cellulari individuali contenenti DXR e carrier, etichettati con hanno, come pure con CF-PE (figure 6B e 6C), possono essere visto.
DXR citoplasmico sequestra in piccole vescicole, e le cellule sono state etichettate con un pennarello lisosomiale di cellule vive in verde o rosso. Il movimento di questi lisosomi possa essere seguito nelle cellule (5 film). DXR citoplasmici e la nanocarrier colocalize all'interno di queste strutture, e la differenza intercellulare nel modello DXR, come illustrato nella Figura 6, è spiegata qui. I lisosomi sono distribuiti in modo casuale durante il citoplasma in B16BL6 e si trovano accanto al nucleo in cellule di BLM (figura 7A). Utilizzando ImageJ, la colocalizzazione tra DXR e vettore nel lisosoma è stato calcolato (figura 7B). Le immagini a colori sono state fatte binarie (processo > binario > rendere binario) e, usando la colocalizzazione plug-in (Analyze > Colocalization), un'immagine di colocalizzazione era fatta di DXR con fatto. Questo crea un'immagine colorata di verde-rosso-bianco, con pixel bianchi che rappresentano i pixel colocalized di entrambe le immagini. Tramite il menu articolo processo > binario > rendere binario, i pixel bianchi saranno separati e convertiti in pixel neri, da cui viene misurata la densità di pixel (Analyze > misura). Da allora in poi, è stata effettuata un'immagine di colocalizzazione tra questo DXR-fatto l'immagine e l'immagine binaria del marcatore lisosomiale (LM) e densità di pixel misurati. I dati di colocalizzazione sono la percentuale di pixel positivo per DXR-fatto e DXR-fatto/lisosomiale indicatore (Figura 7). Che il vettore, etichettato con CF-PE pure come ha fatto, si trova nel lisosoma è anche illustrata nella Figura 7.
Figura 1: strumenti e attrezzature setup. A) imaging camera + necessità. top 25 mm #1 coperchio vetro (1), parte inferiore dell'alloggiamento (2), parte della camera (posto did testa in giù) e o-ring (3), titolare di fase (4) e tenuta coperchio (5). Barra della scala: 2 cm. B) unità di incubazione. Fase di microscopio riscaldata (1), fase portata con in - e out - flow per CO2 (2), una sonda di CO2 (3) e una patch di chiusura (4). Barra della scala: 2 cm. C) Imaging camera nell'unità incubatrice, come si è visto al microscopio. D) serie multi-time macro. E) apparecchiature per l'imaging. Invertito microscopio (1), luce fluorescente (2), computer (3), riscaldatore anello (4, inserto) e controller (4, figura principale), tubo antischiacciamento di CO2 (5), valvola di CO2 (6), regolatore di CO2 (7), CO2 umidificatore (8), O2 valvola e controller (9) e regolatore di temperatura di fase (10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schematica dei parametri microscopio dettagliati nel protocollo sezione 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: indagando l'assorbimento a breve termine di dox e Dox-NP. BLM cellule sono state esposte continuamente al dox o Dox-NP per 3 h, e un time-lapse è stato preso. (A) immagini fisse di time-lapse di cellule incubate con dox. (B) immagini fisse di time-lapse delle cellule incubate con Dox-NP. Barra della scala = 50 µm. (C) Pixel aumento di densità di DXR nucleare in cellule dox e Dox-NP-trattate. (D) aumento di densità di Pixel di citoplasmico DXR in cellule dox e Dox-NP-trattate. I dati rappresentano la media ± SD di 3 cellule per campo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: indagando l'assorbimento a lungo termine di dox e Dox-NP in differenti linee cellulari. Cellule sono state esposte al dox o Dox-NP ed imaged 24 h più tardi. Immagini sono state scattate subito dopo la rimozione delle droghe, con 3 diversi guadagni. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: studiando l'assorbimento cellulare e il rilascio di agenti liposomiali. Le cellule erano continuamente esposte a Dox-NP per 24 h, e un time-lapse è stata effettuata. (A) immagini fisse del time-lapse. Barra della scala = 50 µm. (B) Pixel aumento di densità di DXR nel nucleo e nel citoplasma. I dati rappresentano la media ± SD di 3 cellule per campo. (C) immagini che dimostrano la localizzazione di DXR all'interno della cellula. Linea continua: membrana cellulare, linea tratteggiata: nucleo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: indagando la localizzazione di droga e carrier in differenti linee cellulari. (A) cellule erano esposti al Dox-NP/fatto per 24 h ed imaged. Barra della scala = 50 µm. (B) le cellule sono stati esposti al Dox-NP/fatto/CF-PE per 24 h ed imaged con un guadagno di intensità inferiore a distinguere singole vescicole. (C) Bright-field e DXR sovrapposizione risultati DXR in vescicole citoplasmatiche (freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: analisi della localizzazione intracellulare del farmaco e l'elemento portante. Le cellule sono state esposte a Dox-NP/fatto o CF-PE/fatto per 24 h, e i lisosomi sono visualizzati utilizzando il marcatore lisosomiale di cellule vive (LM) in verde o rosso. (A) localizzazione intracellulare di DXR e il vettore (fatto). Le frecce rappresentano 3 esempi di DXR e hanno localizzate nel lisosoma. Barra della scala = 50 µm. (B) analisi co-localizzazione di DXR e il vettore (fatto) nei lisosomi (LM) usando ImageJ. (C) percentuale di co-localizzazione di DXR e il vettore nei lisosomi. I dati rappresentano la media ± SEM di 3 singoli esperimenti. (D) Lysosomal sequestrante del vettore visualizzato usando due differenti marcatori. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: Related to Figura 3 : BLM cellule sono state incubate con dox per 3 h. Time-lapse: 19 immagini, con un intervallo di 10 min. Frame rate: 3 fps. Barra della scala = 50 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Film 2: Related to Figura 3 : BLM cellule sono state incubate con Dox-NP per 3 h. Time-lapse: 19 immagini, con un intervallo di 10 min. Frame rate: 3 fps. Barra della scala = 50 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Movie 3: Related to Figura 5 : BLM cellule sono state incubate con Dox-NP per 24 h. Time-lapse: 96 immagini, con un intervallo di 15 min. Frame rate: 8 fps. Barra della scala = 50 µm.
Film 4: Related to Figura 5 : 1F6 cellule sono state incubate con Dox-NP per 24 h. Time-lapse: 96 immagini, con un intervallo di 15 min. Frame rate: 8 fps. Barra della scala = 50 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Movie 5: Related to Figura 7 : Cellule lisosomi di B16BL6 sono state macchiate con un marcatore di cellule vive. Time-lapse: 10 immagini, con un intervallo di 10 s. Frame rate: 3fps. Barra della scala = 50 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Discussion
Come osservato in passato, la fissazione può distruggere liposomiale nanovettori quasi immediatamente e DXR rilasciato forma questi liposomi distrutti ancora avevano il tempo di entrare nel nucleo, rendendo l'interpretazione dei dati molto difficile e addirittura fuorvianti. Con alcuni aggiustamenti al microscopio, il destino di chemioterapico in cellule viventi e tessuti possa essere investigato ordinariamente per confermare o rovesciare le osservazioni istologiche. Una carta recente ha mostrato l'assorbimento, il rilascio e la localizzazione di DXR in cellule trattate con dox gratis e incapsulato utilizzando cellule vive time-lapse imaging9. Questo lavoro descrive la messa a punto sperimentale più dettagliatamente. Utilizzando questo modello, è possibile visualizzare il trasporto immediato di dox al nucleo, dove si accumula continuamente fino a quando la cellula muore alla fine. Al contrario, quando viene utilizzato Dox-NP, solo piccole quantità di dox rilasciato si trovano nel nucleo. Anche se l'esposizione continua risultati in continuo accumulo di DXR, il segnale fluorescente è molto inferiore nel Dox-NP-contro cellule trattate con dox, che indica una differenza nella concentrazione cellulare e citotossicità successive. Inoltre, utilizzando marcatori di cellule vive, è stato dimostrato che, quando esponendo le cellule a Dox-NP, DXR e il nanocarrier si trovano nel lisosoma. Questo indica che il liposoma completa è preso dalla cella e dimostra il coinvolgimento di un pathway endocitico durante l'assorbimento di queste nanoparticelle. Il DXR nel nucleo è chiaramente da dox rilasciato. Tuttavia, utilizzando questo metodo, come vettore sia il DXR co-localizzano e sembrano essere intrappolate nei lisosomi, è ancora inconcludenti se questo è incapsulato o rilasciato dox. È possibile che la stabilità intrinseca della nanoparticella impedisce il rilascio di dox quando localizzata nel lisosoma.
In questo protocollo, formazione immagine della vivere-cella è dimostrata utilizzando una configurazione specifica al microscopio, con un supporto su misura fase (le specifiche possono essere dato su richiesta). Tuttavia, più manufatti di microscopio confocale offrono una gamma di incubatrici che eseguire imaging di cellule vive. Preservare le condizioni di coltura delle cellule (cioè, temperatura, CO2, pH, umidità e sterilità) è il criterio principale di questi incubatori e richiede alcune prove preliminari per determinare le condizioni adeguate, che è stato approfondito. Programmi di acquisizione automatica dei dati possono anche essere consegnati dalla fabbrica stessa. Un'opzione "Multi posizione" rende possibile all'immagine diverse posizioni nella stessa camera, analisi statistica di raffinazione. Tuttavia, questa opzione nella macro citata in questo manoscritto richiede posizioni fisse di XYZ, da cui si perde la possibilità di correggere per Z-drift. La Z-dimensione di scansione possono essere inclusi in questa macro e usi un fuoco aereo per l'analisi. Tuttavia, questo richiede analisi supplementare, aumentando la possibilità di fototossicità e candeggio.
Come con tutte le misurazioni fluorescente, la sovraesposizione è un problema, soprattutto quando si confrontano due composti con un diverso assorbimento cellulare. L'intensità di fluorescenza non è solo dipendente il segnale intrinseco del composto, ma anche il tasso di assorbimento, la concentrazione e il tempo di esposizione della droga. Come mostrato nella figura 3, il contenuto DXR nucleare di cellule trattate con dox è già visibile, mentre nessun segnale è veduto in cellule Dox-NP-trattate. Solo aumentando il guadagno il DXR in cellule Dox-NP-trattate sono visualizzabili, che conduce alla sovraesposizione in cellule trattate con dox. Inoltre, anche intracellulare, Dox-NP è eterogeneo, che può provocare inevitabile sotto- o sovraesposizione. Soprattutto quando si esamina l'allettamento DXR cellulare, il guadagno è stato ridotto significativamente per distinguere singoli organelli (figure 5B e 5C). Così, le misurazioni rappresentate dalla densità di pixel devono essere corredate di immagini rappresentative per la corretta interpretazione dei risultati.
Fototossicità, sbianca e un rapporto segnale-rumore basso sono anche questioni importanti in microscopia fluorescente, e deve essere stabilito un compromesso tra la qualità dell'immagine e l'acquisizione dell'immagine. Tuttavia, anche quando il programma di installazione di microscopio è ottima, la qualità dell'immagine anche in gran parte è determinata dalla qualità delle cellule e il composto aggiunto. DXR dà un segnale forte e, con le dovute precauzioni, lo sbiancamento non è stato osservato, anche dopo periodi più lunghi (fino a 72 h). Tuttavia, la riduzione del segnale fluorescente può anche essere un risultato di efflusso. Efflusso è un fenomeno importante nella droga resistenza15 e si verifica quando le cellule pompano fuori il farmaco dal sito intracellulare dell'azione. Una diminuzione del segnale fluorescente nel tempo quindi può anche essere un risultato di dox efflusso9. Confrontando il segnale fluorescente di una posizione non analizzati alla fine dell'esperimento con l'ultima immagine della serie time-lapse dimostrerà candeggio (cioè, il segnale sarà più alto in una posizione non analizzati) o efflusso (cioè, entrambi i segnali saranno identici). Sono disponibili in programmi come ImageJ16diverse opzioni correttive (ad es., sfondo, drift, candeggio, ecc.). Inoltre, come l'intensità di fluorescenza aumenta nel tempo, le impostazioni di configurazione possono essere pre-valutate in un esperimento pilota per ridurre la sovraesposizione alla fine del time-lapse (passo 3,21). In alternativa, una camera di imaging con cellule già esposti alla droga per il periodo di tempo desiderato può essere utilizzata per inizializzare le impostazioni. Infine, per questo tipo di analisi, concentrazioni di droga tossica (passo 3,22) dovrebbero essere evitate e prestabiliti utilizzando bio-dosaggi convenzionali.
Le cellule sono continuamente coltivate e mantenute in medium senza rosso fenolo. Rosso fenolo reagisce in parte rossa dello spettro e può essere osservata in organelli cellulari, probabilmente lysosomes, presentando informazioni falsi positivi (punto 1.2). Per consentire il monitoraggio delle singole celle, confluenza di cella non deve superare il 70% (punto 3.1.). La CO2 flusso-velocità (passo 3.5) deve essere regolata in un esperimento di convalida quando si è acquistato l'apparecchio o dopo la manutenzione. Quando la velocità è troppo alta, medio evaporerà. Quando la velocità è troppo bassa, il pH del terreno aumenta, che può influenzare la crescita delle cellule. Come il mezzo è senza le modifiche di indicatore di pH rosso fenolo pH non possono essere osservate e pertanto sono facilmente trascurate. Una volta convalidato il flusso di CO2 , queste impostazioni possono essere utilizzate in tutti gli esperimenti futuri.
Utilizzando il metodo descritto qui, il destino delle nanoparticelle possa facilmente essere studiato usando la formazione immagine della vivere-cella e microscopia time-lapse. In questa procedura, sono state utilizzate commercialmente disponibili nanoparticelle. Tuttavia, il destino di termosensibile17, liposomi cationici10; liposomi arricchiti con catena corta shingolipids18; e nanoparticelle incapsulare altre droghe8,19 inoltre sono stati studiati in questo modo in cellule normali e tumorali.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Le strutture di microscopia utilizzate sono parte del centro di Imaging ottico di Erasmus, e vorremmo ringraziare il personale dell'OIC per i loro servizi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
