Summary
Canlı hücre görüntüleme dinamik süreçler görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Sabit hücrelerin incelenmesi yanlış yorumlama ve süreci hakkında kafa karışıklığı yol açabilir yalnızca statik resimler sağlar. Bu eser alımı, uyuşturucu yayın ve hücre içi canlı hücrelerdeki liposomal nano tanecikleri yerelleştirilmesini çalışmak için bir yöntem sunar.
Abstract
Konvansiyonel görüntüleme teknikleri hücresel süreçler hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Ancak, bu bilgiler üzerinde statik resimler yoksa dinamik bir sisteme dayanır ve art arda gelen aşamalarını kolayca gözden kaçan veya yanlış yorumlanabilir. Canlı hücre görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskobu içinde canlı hücreler için saatler ya da günler az ya da sürekli bir biçimde takip edilebilir, bu nedenle çok bilgilendirici. Burada açıklanan protokol ilaçlar nano tanecikleri kaderi araştırmaların ardından doksorubisin (dox) canlı hücrelerdeki teslimini sağlar. Dox onun nanocarrier biyolojik olarak aktif olmak için serbest bırakılması gereken intercalating bir ajandır. Fazla iki yıl için klinik kayıt rağmen alımı, arıza ve uyuşturucu yayın hala tam anlaşılır. Bu makalede lipid tabanlı nano tanecikleri tümör hücreleri tarafından alınır ve yavaş yavaş bozulmuş hipotezini araştırıyor. Yayımlanan dox sonra çekirdeğine translocated. Fiksasyon eserler önlemek için canlı hücre görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskobu, deneysel bu yordamda açıklanan uygulanabilir.
Introduction
Hücre-hücre arasındaki etkileşimleri gibi biyolojik bir süreci takip yeteneği Inter- ve hücre içi ulaşım, sitotoksik bileşik alımı ve canlı hücreler ve dokular, tek moleküllerin protein-protein etkileşim büyük ilgi son kazanmıştır on yıl, "gerçek zamanlı" ekstra boyut sağladığından Bu makale, ücretsiz dox ve nano tanecikleri (Dox-NP) dahil dox hücre içi kaderi takip için bir yöntem tanımlanır.
Nano tanecikleri yıllardır bazı kanserlerin tedavisinde kullanılmaktadır. AIDS ile ilgili Kaposi sarkomu, tedavisi ve yumurtalık gelişmiş meme kanseri ve Multipl Miyelom1Dox-NP onaylandı. Geliştirilen ve klinik ortamda tanıttı ilk liposomal nano tanecikleri biriydi. Serbest form, dox, büyük ölçüde yeterli miktarda tümör sitesine ulaşmak için kapasitesini sınırlama kan dolaşımını üzerinden temizlenir. Ayrıca, tedavi şiddetli ve doz sınırlama yan etkiler, Stomatit ve kalp yetmezliği gibi eşlik ediyor. Pegile liposomal nano tanecikleri saklanmış zaman dolaşım süresi dakika mesafede gün2' ye artar. Kolesterol içeren bu tür lipozom oldukça kararlı ve bu istikrar kapsüllenmiş ilaç dozları belirler.
Ancak, bu sertlik bir dezavantajı vardır. İlk Değerlendirilmiş vitrositotoksik bir bileşik tümör hücrelerinin doğru özelliğidir ve o dox Dox-NP sitotoksik içinde3,4deneyleri daha güçlü gösterilmiştir. Taşıyıcı kararlılığını yayın ve hücresel ilaç alımını engeller ve bu olay daha fazla araştırmak için faydalıdır onaylanmadığına karar. Sitotoksik bileşeninin (Yani, dox) hedef site (Yani, tümör, Engelli bioavailability kanda agresif elemanları sürmesi ve bozulmamış, tümör sitesine ulaşmak için inşa iç liposomal özellikleri sonuçlandı hücre çekirdeği). Dox-NP hardily serbest forma göre yanıt gelişmiş olsa da, kapsülleme Kardiyotoksik efektleri5azaltılacağını hala klinik değeri, öyleydi. Ertesi yıl, diğer bileşikler nano-taşıyıcılar6' kapsüllü. Ayrıca, taşıyıcılar değiştirme harekete geçirilen uyuşturucu yayın (Yani, tümör sitesinde) sonuçlandı ama istikrar kan dolaşımını7,8yapılmaktadır. Araştırma ve klinik kullanım yaşında olmasına rağmen nanocarriers Dox-NP gibi intratumoral kaderi hala tam olarak belli değildir. Son bir yayında dox organellerin9' kapana kısılmış kalırken nanopartikül bir bütün olarak alınır gösterildi.
Hücresel bir nanopartikül ve uyuşturucu yayın alımını en iyi canlı hücre Imaging'i kullanma izlenebilir dinamik süreçler vardır. Ayrıca, hangi hücrelerin içinde klasik Histoloji inkübe ve fiksasyon liposomal taşıyıcı yok eder ve eserler tanıttı bundan sonra sabit, yanlış sonuçlar verebilir. Ana canlı hücre görüntüleme için görselleştirme, Floresan, tercihen tarafından istenen işlem gereklidir. Dox gibi bazı bileşikler içsel bir kırmızı Floresans var. Ayrıca, floresan işaretleri taşıyıcı tanıtıldı ve hücre organelleri canlı hücre işaretçileri kullanarak görüntülenir. Bu şekilde, taşıyıcı, uyuşturucu yayın ve taşıyıcı ve uyuşturucu, hücrede yerleşimi alımını gibi parametreleri bir dizi görüntüsü ve analiz. Burada, bir yöntem dox ve Dox-NP birkaç tümör hücrelerindeki hücreler arası kaderi gerçek zamanlı olarak izlenir açıklanmıştır. Ayrıca, bu yöntem (nano tanecikleri10ücretmesela ) hedef ve tetikleyen için ideal koşulları oluşturmak için kolayca adapte edilebilir (Örneğin, Hipertermi7) uyuşturucu serbest bırakmak.
Protocol
1. hazırlık
- iki parçadan oluşur görüntüleme odası montajı.
- Yer Odası ( şekil 1A -2) alt kısmı ve vida üst kısmı alt kısmı ( şekil 1A -3) içine 25 mm kapak cam ( şekil 1A -1). Cama zarar verebilir gibi çok sert sıkın değil. Otoklav tüm Odası ( şekil 1A -4).
- Dulbecco ilave tarafından hücre kültür ortamı hazırlamak ' modifiye kartal s ' s orta (DMEM) fenol red % 10 fetal buzağı ısı inaktive serum (FCS) ile ve steril koşullarda 1 mM L-glutamin olmadan. 4 ° C ve kullanımdan önce 37 ° c sıcak mağaza.
- Korumak hücre kültür Standart hücre kültürü teknikleri kullanarak şişeler kültür içinde orta hücrelerle.
Not: Burada, iki fare hücre hatları, Melanom B16BL6 11 ve Lewis akciğer Karsinomu (LLC) ve iki insan melanomlar, BLM ve 1F6 12, kullanıldı. - Tartım ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 37 ° C'de içinde jelatin eriterek olun % 0,1 jelatin bir gecede. 0,22-µm filtreden süzerek çözüm sterilize ve 4'te saklayın ° C.
2. Plaka hücreleri
- görüntüleme odası dolap laminar akışı sterilizasyon çantasından çıkarın, dikkatle odası sıkın ve bir kabında yerleştirin.
Not: odası-ebilmek var olmak konulmak mikroskop altında kadar kirlenmesini önlemek için görüntüleme odası bir kabında tutun. - Kat görüntüleme odası cam ile 1 mL %0.1 20 dk 37 ° C ve % 5 CO 2 için steril jelatin.
Not: Bu daha iyi hücre eki sağlayacaktır. - Orta (1.2 ve 1.3 adımlara bakın) hücre kültür şişeler kaldırmak, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve % 0.25 tripsin kullanarak hücre bağlantısını kesin. Tripsin hücre kültür orta ekleyerek devre dışı bırakın, hücreleri toplamak, onları vasıl 1100 x g 5 min için spin aşağı ve Pelet hücre kültür orta 5 mL resuspend. (Hangi ölü hücreleri tarafından alınan) trypan mavi
- seyreltik 20 µL hücre süspansiyon 20 µL. Bir hemasitometre kullanarak canlı ve ölü hücreleri saydırmak; ölü hücre sayısı % 10 geçmemelidir.
- Jelatin Aspire edin ve en fazla 24 saat içinde % 70 kapsamı için izin veren bir seyreltme hücrelerde plakası. Örneğin, 5 x 10 4 veya 10 x 10 4 hücreleri 1 ml seyreltme kullanın. Hücreleri % 5 CO 2 ve 37 ° C 24 h için bağlı kalmak izin
3. Hızlandırılmış mikroskobu ( Şekil 2)
Not: canlı hücre bu görüntüleme için çoğu üretmektedir İnkübatörler sunmaktadır, ancak burada, bir ısmarlama sahne alanı sahibi confocal mikroskop, kullanılan nanoparticulated ilaç dağıtım araştırmak de uygundur.
- Confluency, hücresel morfoloji ve kirlenme mikroskopla hücre değerlendirmek. Odaya geri CO 2 kuluçka makinesine koyun.
Not: Confluency % 70 aşmaması gerekir. Hücresel Morfoloji (hücreleri uygun değil tutarsız Yani) bir ya da bulaşma algılandı, atmak görüntüleme odası. - Confocal mikroskop ( şekil 1E -1), geçiş Floresan ışık ( şekil 1E -2) ve bilgisayar ( şekil 1E -3).
- Amacı objektif ısıtıcı bağlanmak ve 35 ° C (-4 rakam 1E + sokmak) için ayarlayın.
- Hazırlamak kuluçka birimi şekil 1B adımında gösterildiği gibi.
Not: Bu bir ısıtmalı aşaması ( şekil 1B -1), bir akış sahne CO 2 tüpler ( şekil 1B -2) için bir bağlantı ve CO 2 sonda ile oluşur ( şekil 1B -3) ve bir kırmızı kapanış yama ( şekil 1B -4). Bu düzeltme eki birim görüntüleme odası yerleştirilir kadar geçici olarak kapatmak için kullanılır. - Kuluçka birimi mikroskop sahnesinde yerini ve içinde - ve çıkış - flow CO 2 tüpler ( şekil 1E -5) bağlanın. Ana CO 2 Vana ( şekil 1E -6) açın ve CO 2 denetleyicisinde ( şekil 1E -7) geçin. Denetleyicisi % 5 CO 2 ' ye ayarla onay.
Not: nem için CO 2 bir nemlendirici ( şekil 1E -8) geçer. Hipoksi deneyler için ayrı bir O 2 regülatörü ( şekil 1E -9) kurulumunda eklenir. - Sahne sıcaklık 37 ° C ( şekil 1E -10) ayarlayın. Hipertermi deneyler için sıcaklığı 42'ye ayarlamak ° C. izin ver seçili sıcaklık ve CO 2 yüzde ulaşmak için kuluçka birimi.
- Ana CO görüntüleme odasından 2 kuluçka makinesi almak ve bir petri mikroskobu odasına odasında taşıma.
- Görüntüleme Odası ( şekil 1A -4) özel bir yer, 35 mm çaplı sahne tutucu ( şekil 1A -5) ve özel yapım bir mühürleme kapaklı odası kapatın ( Şekil 1A -6).
Not: Kapağı geçmek CO 2 sağlar ve buharlaşma ve diğer yabancı maddelerden engeller.- Kuluçka ünitesini açın, kırmızı düzeltme eki ile görüntüleme odası yerine ve ( şekil 1 c) birimini kapatın. Bunu aşağı hücreleri soğutma önlemek için mümkün olduğunca hızlı. Kablo sahne ve mikroskop arasında sıkışmış olduğundan emin olun.
- İçin 30 dk. parkenizin birimi bırak
- Yazılımını açın ve lazerler üzerinde geçiş.
Not: Burada, 488 nm argon, 543 nm helyum-neon ve 633 nm helyum-neon lazer kullanıldı. - Yeni bir veritabanı yapabilirsiniz " New " Dosya sekmesini adı altında ve kurtarmak belgili tanımlık database.
- Yanında tıkırtı yapılandırma ayarla " Config " da ele geçirme sekmesini altında " kanal modu " ve " tek parça " tek bir fluorophore değerlendirmek için veya " çoklu parça " birkaç fluorophores için. Fluorophore (Örneğin, 560-615 nm bant geçiren Filtre dox ve Dox-NP; bkz: daha fazla örnek için temsilcisi sonuçları) eşleşen uygun bant geçiren filtre seçin. Parlak alan kanal içinde bir-in belgili tanımlık iz seçin.
- Ayarla tarama denetimi tıklatarak " tarama " yön (8-bit, tek) ele geçirme sekmesini (1024 x 1024), çerçeve boyutunu ayarlama tarama hızı (en uygun), altında tarayın ve tarama ortalama (4) tıklatarak " modu. " iğne deliği ve sondaj (200 µm) ayarla, kazanmak ve ofset () Örneğin, 580, 700 ve 835; bkz. şekil 3) ve lazer güç (488 = %10, 543 = %100, 633 = %100) tıklayarak " kanalları. "
- tıklatarak bu ayarları Kaydet " Config " Yapılandırma sekmesini ve yapılandırma veritabanında saklayabilirsiniz.
- Hızlandırılmış tıklatarak ayarlayın " çok zaman X " ( şekil 1 d) makro sekmesini içinde " tek yer ".
- Hücreleri odak içinde tutmak için Otomatik odak tıklatarak makroyu seçin " Auto odak. "
Not: otomatik odaklama cam yansıması bir referans noktası olarak kullanarak 633 nm lazer ile elde edilir. - Tıklayarak kaydedilmiş olan yapılandırmayı uygulamak " tek parça " veya " çoklu parça, " zaman aralığı (örneğin, 15 dk), (örneğin, 97) tarama sayısı ayarını yapılandırma veritabanında gerekli yapılandırma için kaydırma ve tıklayarak " yük Config. "
Not: Bu ayarları kullanarak, bir saat serisi 97 x 15 dk = 24 h yapılacaktır. - Hızlandırılmış olarak isim " Bankası dosya adı " ve veritabanı (Adım 3,11 oldu) tıklatarak seçin " görüntü veri tabanı " hızlandırılmış kaydetmek için. Tıklatarak bir geçici klasör ayarlayın " Tmp görüntü klasör. "
Not: sistem durur veya herhangi bir nedenle çöküyor, görüntüleri bu klasöründe yer alır. - İncubating ünitesini açın, görüntüleme yüzük kaldırın, amaca bir damla daldırma yağı ekleyin ve olabildiğince çabuk birimini kapatın. Odak ve görüntüleme odasında bir konum seçin.
Not: Bu pozisyon ile % 70 confluency, tek tek hücreleri görüntüleme için izin en az bir monolayer hücrelerde içerir. - Arka planı için yapılandırma ayarlarını denetleyin ve gerekirse düzeltin.
Not: Arka plan kazanç veya lazer güç azaltarak düzeltilebilir. Yapılandırmasında herhangi bir değişiklik (bkz. Adım 3,17) kaydedilmiş olması gerekir ve (bkz. Adım 3.18) yüklü tekrar makroda. - Laminar akış kabine, ücretsiz ilaç ya da 5 µg/mL ilaç bir konsantrasyon veya hücre kültürü ortamında lipidler 0,05 µmol nano tanecikleri sulandırmak. Filtre bir 0,22-µm şırınga filtreden uyuşturucu/nano tanecikleri steril değildir.
- İncubating odası açmak, mühürleme kapağı kaldırın, orta hücrelerden kaldırma, seyreltilmiş uyuşturucu/nano tanecikleri 1 mL ekleyin ve kısa sürede birimini kapatın.
- Odak üstünde belgili tanımlık hücre ve başlangıç hızlandırılmış tıklatarak " başlattığınızda " çok zaman X makroda.
- Hücreleri hala odakta olup olmadığını görmek için düzenli olarak kontrol edin veya (bkz. Adım 3,16) otomatik netleme işlemi kullanın. Program veritabanında otomatik olarak hızlandırılmış kaydeder; program çalışırken veritabanı kapatmayın.
4. Veri analizi
- Orijinal Araştırma soru bağlı olarak, ImageJ gibi yazılım programlarının veri analizi için kullanın (örnekler için sonuçlar bölümüne bakın).
Representative Results
Liposomal taşıyıcıları farklı işaretleri ile etiketleme yukarıda açıklanan9oldu. Taşıyıcılar (yaptım; far-red dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine perklorat ile Etiketlenmiş Eski 644 = nm; Em 665 = nm) veya yeşil 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Eski 490 = nm; Em 515 = nm) bu el yazması sunulmaktadır. Hücreler arası benzerlikler ve farklar liposomal alımı, yayın ve hücre içi yerelleştirme göstermek için birçok tümör tipi incelenmiştir. Bu iki fare çizgi, B16BL6 Melanom11 ve Lewis akciğer Karsinomu (LLC) ve iki insan melanomlar, son derece metastatik (BLM) ve sigara-metastatik (1F6) Melanom12,13içerir. Tüm deneyler canlı hücreler kullanılarak yapıldı. Tüm deneylerde bir konsantrasyon 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP veya nano tanecikleri 0,05 µmol yönetilen için 3 veya 24 h. ölçülür ve ücretsiz, serbest, kapsüllenmiş, münzevi veya ara formu) (olarak analiz dox DXR anılacaktır. 40 X (sayısal Diyafram: 1.3) petrol objektif lens kullanıldı ve görüntüleme gerçekleştirilen bir 488 nm argon lazer (% 10/0.2 mW güç) ve 505-550 nm bant geçiren filtre ile CF-PE ve lizozomal marker (LM) için-yeşil. 543 nm helyum-neon lazer (% 100 / 0.2 mW güç) ve 560-615 nm bant geçiren Filtre dox, Dox-NP ve lizozomal marker-kırmızı için kullanıldı. 633 nm helyum-neon lazer (% 100/0,5 mW güç) ve 640 nm uzun geçiren Filtre kullanılan için yaptım.
Onun kapsülleme nedeniyle vitro sitotoksisite, bioavailability ve dox farmakokinetik önemli ölçüde değişmiş3,9,14idi. Ne zaman özgür ve kapsüllenmiş formunda yönetilen uyuşturucu bioavailability arasındaki farkı şekil 3' te gösterilmiştir. Dox intercalating bir ajandır ve sitotoksik olmak için hücre çekirdeği girmeniz gerekir. Şekil 3 ve ilgili filmler 1 ve 2 3 h dox veya Dox-NP ile aynı koşullarda tedavi BLM hücre zaman hata gösterir. Dakika içinde dox maruz kalma nükleer DXR (şekil 3A, film 1) görülebilir ve, daha düşük bir kullanarak (INSERT) kazanç, çekirdeğinde enterkalasyon görülebilir. Buna ek olarak, Dox-NP isteyeceksiniz maruz kaldığında, hücre içi DXR bu zaman çerçevesi içinde (şekil 3B, film 2) zor görünür. Sadece photomultiplier kazanç artırarak, DXR sitoplazmada görülebilmektedir (Ekle). ImageJ kullanarak, sitoplazmik ve nükleer DXR piksel yoğunluğu analiz edildi. Hücreleri hızlandırılmış değerlendirme sırasında hareket halinde olduğundan, floresan alan parlak görüntülerle birleştirmek önemlidir. Bu tek tek hücreleri izleme ve ImageJ içinde belirli eklentileri kullanarak XY-drift sabitleme imkanı sunar. Şekil 3' te sunulan analiz, alan parlak görüntü bir bölge sitoplazma (düz çizgi) ve çekirdek (noktalı çizgi) etrafında (ROI) ilgi çekmek için kullanıldı. ImageJ yatırım Getirisi Manager'da Çözümle menü öğesinde bulunabilir > araçlar > ROI Yöneticisi. Bu ROIs floresan görüntü piksel yoğunluğu Çözümle menü öğesini kullanarak çözümlemek için kullanılır > ölçü birimi. Çekirdek (şekil 3 c) piksel yoğunluğu ve dox veya Dox-NP-tedavi edilen hücre sitoplazma (şekil 3D) arasındaki fark ne görüntüleri görülür onaylar. Ayrıca, hücreleri için dox veya Dox-NP, sonra bahçedeki orta yerine ve hemen photomultiplier kazanç (şekil 4) artan duyarlılığı ile görüntüsü ile 24 saat inkübe. Lazer güç, ofset, iğne deliği ve resim görüntüleme, gibi diğer ayarları aynıydı. Düşük DXR sinyal Dox-NP-tedavi dox tedavi ile karşılaştırıldığında hücrelerdeki dikkat çekicidir. Dox görüntüsünü zaten pozlanmış ise 700 bir kazanç kullanarak, DXR Dox-NP-tedavi hücrelerdeki görünür, hale gelir. Bu basit vitro deney bioavailability ücretsiz saklanmış uyuşturucu karşı önemli bir fark görüntüler.
Hücreler sürekli Dox-NP için 24 saat maruz kaldığında, DXR zamanla şekil 5A ve filmler 3 ve 4 gösterildiği gibi kurar. Sinyal içinde sitoplazma artırır ve daha sonra DXR Ayrıca çekirdeğinde ara bulunur. Bu gözlemler piksel yoğunluğu grafikler (şekil 5B) tarafından onaylanır. Hücre içi dağıtım farklılığı nedeniyle 1F6 hücrelere kıyasla BLM ölçülen sitoplazmik piksel yoğunluğu düşüktür. DXR 1F6 hücrelerde hücre dağıtılır ise BLM hücrelerdeki DXR daha çekirdeği (şekil 5C) yakın bir organel içinde yoğunlaşmıştır.
Bu nedenle, uyuşturucu ve farklı hücre hatları (şekil 6) taşıyıcıya lokalizasyonu araştırılmıştır. Hücreler için Dox-NP/yaptım ve görüntülü ile 24 saat inkübe. Alan parlak görüntü kullanarak, bir bindirme hücre zarı (düz çizgi) ve çekirdek (noktalı çizgi) üç farklı hücre satır floresan görüntü çizilmiştir. Burada taşıyıcı ile etiketli, aynı sitoplazmik desen DXR olarak izler gösterilmiştir: bir organel yakın BLM, çekirdeğinde LLC, tüm çekirdek çevresinde yoğunlaştı ve rasgele B16BL6 hücrelerin sitoplazma boyunca dağınık. Çekirdeğinde, tek DXR ve hayır görülebilir, gösteren dox yayımladı. Photomultiplier kazanç azaltarak, bireysel hücresel veziküller DXR ve taşıyıcı ile etiketli, içeren, yaptım yanı sıra CF-PE ile (rakamlar 6B ve 6 C), görülebilir.
Sitoplazmik DXR küçük veziküller içinde tüketiyor ve hücreleri bir canlı hücre lizozomal işaretleyicisinde yeşil ya da kırmızı etiketli. Bu organellerin hareketi hücrelerde (film 5) izlenebilir. Sitoplazmik DXR ve nanocarrier bu yapılar içinde colocalize ve hücreler arası fark DXR desen, şekil 6' da görüldüğü gibi burada açıklanmıştır. Organellerin rastgele B16BL6 içinde sitoplazma boyunca dağıtılır ve BLM hücreleri (şekil 7A) çekirdeğinde yanında yer alır. ImageJ kullanarak, colocalization lysosome taşıyıcıya arasındaki DXR hesaplanmıştır (şekil 7B). Renkli görüntüler ikili yapılmıştır (işlem > ikili > yapmak ikili) ve colocalization eklentisi kullanarak (Analiz > Colocalization), colocalization görüntü DXR ile yapılmış yaptı. Bu her iki görüntülerin colocalized piksel temsil eden beyaz piksellerle yeşil-kırmızı-beyaz renkli görüntü oluşturur. Menü aracılığı ile işlem madde > ikili > ikili, yapmak beyaz piksel ayrılmış ve piksel yoğunluğu ölçülür siyah piksel olarak dönüştürülür (Analyze > ölçü birimi). Bundan sonra bir colocalization görüntüsü arasında bu DXR was-den yapılmış-resim ve ikili resim lizozomal marker (LM) ve piksel yoğunluğu ölçülür. Colocalization veri piksel DXR için olumlu yüzdesidir-yaptım ve DXR-mi/lizozomal marker (şekil 7C). CF-PE ile de etiketli taşıyıcı, yaptığı gibi lysosome içinde yer aldığını da Şekil 7 diçinde görüntülenir.
Şekil 1: Kur donatım ve aygıtlar. A) görüntüleme odası + ihtiyaçlar. 25 mm #1 cam (1), alt kısmı Odası (2), top Odası (yer parçasıaşağı ters d) ve O-ring (3), sahne alanı sahibi (4) ve mühürleme kapak (5). Ölçek çubuğu: 2 cm. B) kuluçka birimi. Isıtmalı mikroskop sahne (1), akış sahne ile içinde - ve çıkış - flow CO2 (2), bir CO2 sonda (3) ve bir kapanış yama (4). Ölçek çubuğu: 2 cm. C) mikroskop altında görülen odası kuluçka birimi görüntüleme. D) çok zaman serisi makro. E) görüntüleme için ekipman. O2 Vana ters mikroskop (1), Floresan ışık (2), bilgisayar (3), yüzük ısıtıcı (4, INSERT) ve denetleyicisi (4, ana şekil), CO2 akışı boru (5), CO2 Vana (6), CO2 denetleyicisi (7), CO2 nemlendirici (8), ve denetleyicisi (9) ve sahne sıcaklık denetleyicisi (10). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Bölüm 3 iletişim kuralında ayrıntılı mikroskop parametrelerinin şematik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: dox ve Dox-NP kısa vadeli alımını araştırıyor. BLM hücreleri sürekli maruz dox veya Dox-NP 3 h ve hızlandırılmış bir alınmıştır. (A)hala resimleri hızlandırılmış dox ile inkübe hücre. (B) hala resimlerini hızlandırılmış hücre Dox-NP ile inkübe. Ölçek çubuğu 50 µm. (C) piksel yoğunluğu artış dox-Dox-NP-tedavi ve hücrelerdeki nükleer DXR =. (D) piksel yoğunluğu artış dox ve Dox-NP-tedavi edilen hücrelerde sitoplazmik DXR. Verileri 3 hücre başına ortalama ± SD temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: dox ve Dox-NP uzun vadeli alımını farklı hücre hatlarında soruşturma. Hücreleri dox veya Dox-NP maruz kaldılar ve 24 saat sonra görüntüsü. Görüntüleri 3 farklı kazançlar ile uyuşturucu çıkarıldıktan hemen sonra alındı. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: hücresel alımı ve yayın liposomal ajanların soruşturma. Hücreler sürekli olarak 24 saat Dox-NP isteyeceksiniz maruz bırakıldı ve bir zaman hata yapıldı. (A)hala resimleri hızlandırılmış. Ölçek çubuğu 50 µm. (B) piksel yoğunluğu artış DXR çekirdeği ve sitoplazma =. Verileri 3 hücre başına ortalama ± SD temsil eder. (C) görüntüleri DXR yerelleştirme hücre içinde gösteren. Düz çizgi: hücre zarı, noktalı çizgi: çekirdek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: uyuşturucu ve taşıyıcı farklı hücre hatlarında lokalizasyonu soruşturma. (A)hücreleri Dox-NP/mi 24 h için maruz ve görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) hücreleri Dox-NP/mi/CF-PE için 24 saat maruz ve bireysel veziküller ayırt etmek için daha düşük bir yoğunluk kazanç ile görüntüsü. (C) parlak-alan ve DXR DXR sitoplazmik veziküller (ok) gösterilen yerleşimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: hücre içi yerelleştirme ilaç ve taşıyıcı soruşturma. Hücreleri Dox-NP/mi CF-PE/24 h için sinin ve organellerin yeşil ya da kırmızı canlı hücre lizozomal işaretçisi (LM) kullanarak görüntülenir. (A)hücre içi yerelleştirme DXR ve taşıyıcı (yaptım). Okları DXR 3 örnekleri temsil ve lysosome yerelleştirilmiş yaptı. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) Co yerelleştirme analizini DXR ve ImageJ kullanarak organellerin (LM) taşıyıcıya (yaptım). (C) Co DXR lokalizasyonu ve organellerin taşıyıcıya yüzdesi. Verileri 3 bireysel deneyler ortalama ± SEM temsil eder. (D) taşıyıcı lizozomal iyon iki farklı işaretçileri kullanarak görüntülenir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: ile ilgili Şekil 3 : BLM hücreleri dox için 3 h. ile inkübe Hızlandırılmış: 10 dk. kare hızı aralığı 19 resim: saniyede 3 kare. Ölçek çubuğu 50 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 2: ile ilgili Şekil 3 : BLM hücreleri Dox-NP için 3 h. ile inkübe Hızlandırılmış: 10 dk. kare hızı aralığı 19 resim: saniyede 3 kare. Ölçek çubuğu 50 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 3: ile ilgili Şekil 5 : BLM hücreleri Dox-NP için 24 h ile inkübe Hızlandırılmış: 96 görüntülerle, 15 dk. kare hızı aralığı: 8 fps. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu videoyu izlemek için buraya tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 4: ile ilgili Şekil 5 : 1F6 hücreleri için 24 h Dox-NP ile inkübe Hızlandırılmış: 96 görüntülerle, 15 dk. kare hızı aralığı: 8 fps. Ölçek çubuğu 50 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 5: ile ilgili Şekil 7 : B16BL6 organellerin hücre bir canlı hücre marker ile lekeli. Hızlandırılmış: 10 aralığının 10 resim s. kare hızı: saniyede 3 kare. Ölçek çubuğu 50 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Discussion
Geçmişte gözlemlediği gibi liposomal nanocarriers hemen fiksasyon yok edebilir ve veri yorumlanması yapım çok zor ve hatta yanıltıcı formu yok edilen bu lipozomlar hala çekirdek, girmek için zaman vardı DXR serbest. Mikroskobik bazı ayarlamalar ile canlı hücreler ve dokuların kemoterapötik kadere onaylamak veya histolojik gözlemler devirmek için rutin olarak araştırılması. Son bir kağıt alımı, yayın ve yerelleştirme DXR ücretsiz ve kapsüllenmiş dox canlı hücre zaman hata görüntüleme9kullanılarak tedavi hücreleri gösterdi. Bu eser deneysel kurulumu daha ayrıntılı olarak açıklar. Bu modeli kullanarak, bu hücre sonunda ölene kadar o sürekli birikir nerede dox çekirdeği için acil ulaşım görselleştirmek mümkündür. Buna ek olarak, Dox-NP kullanıldığında, sadece küçük miktarlarda yayımlanan dox çekirdeğinde bulunur. Cildin sürekli nikele maruz sürekli DXR birikimini içinde sonuç, floresan sinyal Dox içinde çok daha düşük olsa da-dox tedavi hücreleri karşı NP-hücresel konsantrasyon ve sonraki sitotoksisite bir fark gösteren. Ayrıca, canlı hücre işaretçileri kullanarak, bu hücrelere Dox-NP açığa zaman DXR ve nanocarrier lysosome içinde bulunduğu, gösterilmiştir. Bu tam lipozom hücre tarafından alınır ve endositik bir yolu da katılımı sırasında bu nano tanecikleri alımını gösterir gösterir. Çekirdek DXR yayımlanan dox olduğu açık. Ancak, DXR ve taşıyıcı co yerelleştirilmesine ve organellerin içinde entrapped gibi görünüyor gibi bu yöntemi kullanarak, ister bu kapsüllenir veya dox piyasaya hala sonuçsuz 's. Nanopartikül içsel kararlılığını ne zaman lysosome içinde lokalize dox yayın engeller mümkündür.
Bu protokol için canlı hücre görüntüleme (teknik özellikleri istek üzerine verilebilir) bir ısmarlama sahne alanı sahibi ile belirli bir mikroskobik Kurulumu kullanarak gösterilmiştir. Ancak, en confocal mikroskop üretmektedir canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek İnkübatörler sunmaktadır. Hücre kültür koşulları (Yani, sıcaklık, CO2, pH, nem ve kısırlık) koruyarak bu İnkübatörler ana kriterdir ve uygun koşulları belirlemek için bazı ön test gerektirir hangi daha da açıklanmıştır. Otomatik veri toplama programları de aynı üretici tarafından teslim edilebilir. "Çok yeri" seçeneği, istatistiksel analiz rafine aynı odasında çeşitli kademelerde görüntü olanak verir. Ancak, bu seçenek, bu el yazması belirtilen makro tarafından Z-drift için düzeltmek için olasılık kayıp olduğu sabit XYZ pozisyonlarda gerektirir. Z-boyut tarama bu makro ve bir odak uçak analizi için eklenebilir. Ancak, bu ilave tarama, fototoksisite olasılığı artan ve ağartma gerektirir.
İle tüm floresan ölçümleri gibi dozun bir sorun ne zaman özellikle iki bileşikler farklı bir hücresel alımı ile karşılaştırma. Floresan yoğunluğu sadece bahçedeki içsel sinyal üzerine, aynı zamanda alımını, konsantrasyon ve uyuşturucu çekim hızı oranı üzerine bağımlı değildir. Sinyal yok Dox NP tedavi edilen hücrelerde görülür, ancak Şekil 3'te gösterildiği gibi nükleer DXR dox tedavi hücre zaten görünür, içeriğidir. Sadece kazanç artırarak Dox-NP-tedavi hücrelerdeki DXR, dozun dox tedavi hücrelerdeki önde gelen görüntülenmeyecektir. Ayrıca, hatta intracellularly Dox-NP heterogeneously, hangi altında kaçınılmaz neden olabilir dağıtılır- veya dozun. Özellikle hücresel DXR tuzak soruşturma zaman kazanç bireysel organelleri (rakamlar 5B ve 5 C) ayırt etmek için önemli ölçüde azaldı. Böylece, piksel yoğunluğu tarafından temsil edilen ölçümlerin sonuçları doğru biçimde yorumlayabilmek için temsil edici görüntüleri eşlik etmelidir.
Fototoksisite, ağartma ve düşük sinyal-gürültü oranı da önemli sorunlar floresan mikroskopi ve görüntü kalitesi ve resim alma arasında bir uzlaşma oluşturulmalıdır. Ancak, mikroskop kurulum en uygun olsa bile, görüntü kalitesi de büyük ölçüde hücreleri ve eklenen bileşik kalitesi ile belirlenir. DXR güçlü bir sinyal verir ve uygun önlemler ile ağartma, (en fazla 72 s) daha uzun süre sonra bile gözlendi değil. Ancak, floresan sinyal azalması da sızma bir sonucu olabilir. Sızma ilaç direnci15 önemli bir olgudur ve hücreleri uyuşturucu eylem hücre içi sitesinden dışarı pompa oluşur. Floresan sinyal bir azalma zaman içinde bu nedenle de dox sızma9bir sonucu olabilir. Floresan sinyal hızlandırılmış serisinin son görüntü ile deneme sonunda sigara inceden inceye gözden geçirmek konumunun karşılaştırma göstermek ağartma (Yani, sinyal-ecek var olmak yüksek taranan olmayan konumda) veya (Yani, her iki sızma sinyalleri aynı olacaktır). Birkaç ıslah seçenekleri (Örneğin, arka plan, drift, ağartma, vb) ImageJ16gibi programlarda kullanılabilir. Ayrıca, floresan yoğunluğu zamanla artar, yapılandırma ayarlarını dozun hızlandırılmış (Adım 3,21) sonunda en aza indirmek için pilot bir deneyde önceden değerlendirilmiş olabilir. Alternatif olarak, bir görüntüleme odası zaten istediğiniz zaman dönemi için ilaç maruz hücrelerle ayarları başlatmak için kullanılabilir. Son olarak, bu tür bir çözümleme, toksik ilaç konsantrasyonları (Adım 3,22) kaçınılmalıdır ve geleneksel biyo-deneyleri kullanarak önceden kurulmuş.
Hücreler sürekli kültürlü ve orta fenol red olmadan saklanır. Fenol red spektrumunun kırmızı bölümünde fluoresces ve hücre organelleri, büyük olasılıkla organellerin, yanlış bilgi (Adım 1.2) görülebilir. Bireysel hücrelerin izlemek için izin vermek için hücre izdiham % 70 (Adım 3.1.) geçmemelidir. CO2 akış-hızı (Adım 3.5) bir doğrulama deneme ekipman satın aldığınızda veya sonrası bakım düzenlenmiş olması gerekir. Hızı çok yüksek olduğunda, orta buharlaşır gider. Hızı çok düşük olduğunda, hangi-ebilmek tesir etmek hücre büyümesini ortamın pH artacaktır. Orta olmadan olduğu gibi pH fenol red pH göstergesi değişimler dikkat edilmesi ve bu nedenle kolayca göz ardı edilir. CO2 akışı doğrulandıktan sonra bu ayarları olarak tüm gelecekteki deneyler kullanılabilir.
Burada açıklanan yöntemi kullanarak, nano tanecikleri kaderi kolayca canlı hücre görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskobu kullanarak araştırılması. Bu yordam, piyasada bulunan nano tanecikleri kullanılmıştır. Ancak, kader thermosensitive17, Katyonik lipozomlar10; kısa Zincirli shingolipids18ile zenginleştirilmiş lipozomlar; ve8,19 da tümör ve normal hücrelerin bu şekilde soruşturma diğer ilaçlar nano tanecikleri Kapsüllenen.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Kullanılan mikroskobu İmkanları, Erasmus optik görüntüleme Merkezi parçasıdır ve personel İKT kendi hizmetleri için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
