Summary
Live Cell Imaging ist ein mächtiges Werkzeug, um dynamische Prozesse zu visualisieren. Die Prüfung der fixen Zellen bietet nur statische Bilder, was zu Fehlinterpretationen und Verwirrung über den Prozess führen kann. Dieses Werk stellt eine Methode zur Aufnahme, Wirkstofffreisetzung und intrazelluläre Lokalisation der liposomalen Nanopartikel in lebenden Zellen zu studieren.
Abstract
Konventionelle bildgebende Verfahren bieten detaillierte Informationen über zelluläre Prozesse. Jedoch diese Angabe beruht auf statischen Bildern in einem ansonsten dynamischen System, und aufeinanderfolgende Phasen leicht übersehen oder falsch interpretiert. Live Cell Imaging und Zeitraffer-Mikroskopie, in denen lebende Zellen für Stunden oder sogar Tage in einer mehr oder weniger kontinuierliche Weise verfolgt werden können, sind daher sehr informativ. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Untersuchung des Schicksals der chemotherapeutischen Nanopartikel nach der Lieferung von Doxorubicin (Dox) in lebenden Zellen. DOX ist ein intercalating Mittel, das aus seiner Nanocarrier biologisch aktiv freigegeben werden muss. Trotz ihrer klinischen Eintragung für mehr als zwei Jahrzehnten sind seinen Aufnahme, Verteilung und Wirkstofffreisetzung noch nicht vollständig verstanden. Dieser Artikel untersucht die Hypothese, die dass die Lipid-basierte Nanopartikel werden von den Tumorzellen aufgenommen und langsam abgebaut. Freigegebene Dox ist dann in den Zellkern umgesiedelt. Um die Fixierung Artefakte zu vermeiden, können live Cell Imaging und Zeitraffer-Mikroskopie, beschrieben in diesem experimentellen Verfahren angewendet werden.
Introduction
Die Fähigkeit, einen biologischen Prozess, z. B. Zell-Zell-Interaktionen, folgen inter- und intrazellulären Transport, zytotoxische zusammengesetzte Aufnahme und Protein-Protein Interaktion der einzelnen Moleküle in lebenden Zellen und Geweben, hat großes Interesse in den letzten gewonnen zehn Jahren bietet die zusätzliche Dimension der "Real Time". In diesem Manuskript ist eine Methode, um den intrazellulären Schicksal frei Dox und Dox gegründet Nanopartikel (Dox-NP) beschrieben.
Nanopartikel haben seit Jahrzehnten zur Behandlung von bestimmten Krebsarten. DOX-NP ist zugelassen für die Behandlung von AIDS-assoziiertes Kaposi-Sarkom, fortgeschrittene Eierstock- und Brustkrebs, und Multiples Myelom1. Es war eines der ersten liposomalen Nanopartikeln entwickelt und eingeführt in der klinischen Einstellung. Die freie Form, Dox, wird erheblich auf die Durchblutung, Begrenzung die Tumor-Website in ausreichender Menge erreichen gelöscht. Darüber hinaus wird von schweren und Begrenzung der Dosis Nebenwirkungen, wie Stomatitis und Herzinsuffizienz Behandlung begleitet. Wenn in pegyliertem liposomalen Nanopartikel verkapselt erhöht die Zirkulation Zeit von Minuten an Tag2. Diese Art von Cholesterin-haltigen Liposomen ist recht stabil und diese Stabilität bestimmt die Pharmakokinetik von gekapselten Droge.
Diese Steifigkeit hat jedoch einen Nachteil. Die zytotoxische Fähigkeit eines Stoffes gegen Tumorzellen ist ersten ausgewerteten in-vitro-, und es hat sich gezeigt, dass die Dox ist stärker als Dox-NP in zytotoxischen3,4 Proben. Es wurde vermutet, dass die Stabilität des Trägers die Freisetzung und zelluläre Aufnahme des Medikaments verhindert, und es lohnt sich, dieses Phänomen weiter zu untersuchen. Liposomalen Eigenschaften, gebaut um die aggressiven Elemente in die Blutbahn zu dauern und die Tumor-Website erhalten, zu erreichen führte die beeinträchtigt Bioverfügbarkeit der zytotoxische Komponente (d. h. Dox) an die Ziel-Site (d. h. der tumor Zellkern). Dox-NP verwegen die Antwort im Vergleich zu der freien Form verbessert, war es noch der klinische Wert wie Kapselung kardiotoxische Effekte5deutlich reduziert. In den folgenden Jahren wurden weitere Verbindungen in Nano-Carrier6gekapselt. Außerdem ändern die Träger ausgelöste Wirkstofffreisetzung (z.B. bei der Tumor-Website) ergab aber Stabilität in die Blut-Zirkulation7,8erhalten. Trotz jahrelanger Untersuchungen und klinische Anwendung sind die intratumorale Schicksale der darin wie Dox-NP noch nicht ganz klar. In einer kürzlich erschienenen Publikation zeigte sich, dass die Nanopartikel als Ganzes aufgegriffen wird, während die Dox in den Lysosomen9gefangen bleibt.
Zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln und Drug Release sind dynamische Prozesse, die am besten mit live Cell Imaging überwacht werden können. Darüber hinaus klassische Histologie, in denen Zellen inkubiert werden und danach fixiert, können falsche Ergebnisse geben, wenn die Fixierung den liposomalen Träger zerstört und Artefakten führt. Die wichtigste Voraussetzung für das live Cell Imaging ist die Visualisierung, vorzugsweise durch Fluoreszenz, der den gewünschten Prozess. Bestimmte Verbindungen, wie Dox, haben eine intrinsische rote Fluoreszenz. Fluoreszierende Markierungen in die Halterung eingeführt werden können, auch Zellorganellen mit live-Zell-Markern visualisiert werden können. Auf diese Weise kann ein Array von Parametern, wie Aufnahme des Trägers, Wirkstofffreisetzung und zellulären Lokalisation des Trägers und Droge, abgebildet und analysiert werden. Hier wird ein Verfahren beschrieben, in denen das interzelluläre Schicksal der Dox und Dox-NP in mehrere Tumorzellen in Echtzeit gefolgt ist. Auch diese Methode kann leicht an die idealen Bedingungen zu schaffen, für (z. B. Nanopartikel10in Rechnung gestellt gezielte) und ausgelöst (z.B. Hyperthermie7) Wirkstofffreisetzung.
Protocol
1. Vorbereitung
- montieren die bildgebende Kammer, die aus zwei Teilen besteht.
- Ein 25-mm-Deckglas ( Abbildung 1A -1) im Unterteil der Kammer ( Abbildung 1A-2) und verschrauben den oberen Teil in den Unterteil ( Abbildung 1A-3). Ziehen Sie nicht zu hart, wie das Glas zerbrechen kann. Autoklaven die ganze Kammer ( Abbildung 1A -4).
- Bereiten Zellkulturmedium durch Ergänzung Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) ohne Phenol rot mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen Kälberserum (FCS) und 1 mM L-Glutamin unter sterilen Bedingungen. Shop bei 4 ° C und Warm auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
- Halten die Zellen mit Zellkulturmedium in Fläschchen mit Standardzellen Kulturtechniken Kultivierung.
Hinweis: Hier zwei Maus-Zelllinien, Melanom B16BL6 11 und Lewis Lunge Karzinom (LLC) und zwei menschliche Melanome, BLM und 1F6 12 dienten. - Machen 0,1 % Gelatine durch Wiegen und Auflösen von Gelatine in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C über Nacht. Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,22-µm-Filter filtern und speichern Sie es auf 4 ° c
2. Platte Zellen
- Sterilisationsbeutel in eine laminare Strömung Kabinett die bildgebende Kammer entfernen, sorgfältig anziehen die Kammer, und legen Sie sie in eine Petrischale.
Hinweis: Zur Vermeidung von Kontamination halten die bildgebende Kammer in einer Petrischale bis die Kammer unter dem Mikroskop platziert werden kann. - Mantel des Glases der bildgebenden Kammer mit 1 mL 0,1 % sterile Gelatine für 20 min bei 37 ° C und 5 % CO 2.
Hinweis: Dies ermöglicht bessere Zellhaftung. - Entfernen Sie das Medium aus dem Zellkulturflaschen (siehe Schritte 1.2 und 1.3), einmal mit 1 X PBS waschen und lösen die Zellen mittels Trypsin 0,25 %. Inaktivieren die Trypsin durch Zugabe von Zellkulturmedium, sammeln die Zellen sie spin-down bei 1.100 x g für 5 min und das Pellet in 5 mL Zellkulturmedium Aufschwemmen.
- Verdünnen 20 µL Zellsuspension mit 20 µL Trypan blau (die von toten Zellen aufgenommen wird). Die Anzahl der lebenden und toten Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer; die Zahl der toten Zellen soll 10 % nicht überschreiten.
- Aspirieren Sie die Gelatine und Platte Zellen in einer Verdünnung, die für ein Maximum von 70 % innerhalb von 24 h ermöglicht. Z. B. eine Verdünnung von 5 x 10 4 oder 10 x 10 4 Zellen in 1 mL. Können die Zellen bei 5 % CO 2 und 37 ° C für 24 h halten
3. Zeitraffer-Mikroskopie ( Abbildung 2)
Hinweis: hier ein confocal Mikroskop mit einem maßgeschneiderten Bühne Halter verwendet wurde, obwohl die meisten Hersteller eine Palette von Inkubatoren bieten für live Cell imaging, die sind auch geeignet, um Nanoparticulated-Drug-Delivery untersuchen.
- Bewerten die Zellen unter dem Mikroskop auf Konfluenz, zellulären Morphologie und Verschmutzung. Legen Sie die Kammer zurück in den CO-2-Inkubator.
Hinweis: Die Konfluenz sollte 70 % nicht überschreiten. Wenn die zelluläre Morphologie ist inkonsistent (d. h. die Zellen nicht haften) oder Kontamination festgestellt, verwerfen die bildgebende Kammer. - Schalten die confocal Mikroskop ( Abb. 1E -1), fluoreszierendes Licht ( Abbildung 1E -2) und Computer ( Abb. 1E-3).
- Verbinden die Objektiv-Heizung zum Ziel und setzen Sie ihn auf 35 ° C (-4 Figur 1E + einfügen).
- Bereiten die Inkubation Einheit, wie in Abbildung 1 b gezeigt.
Hinweis: Dieses Gerät besteht aus einem beheizten Objekttisch ( Abbildung 1 b -1), eine Fluss-Bühne mit einem Stecker für die CO 2 Röhren ( Abbildung 1 b -2) und CO-2-Sonde ( Abbildung 1 b -3), und einen roten schließen Patch ( Abbildung 1 b -4). Dieser Patch wird verwendet, um das Gerät vorübergehend zu schließen, bis die bildgebende Kammer platziert ist. - Stellen die Inkubation Gerät auf den Mikroskoptisch und dem in - und out - flow CO 2 Schläuche anschließen ( Abb. 1E-5). CO 2 Hauptventil ( Abb. 1E-6) zu öffnen und den CO 2 Controller ( Abb. 1E-7) einschalten. Prüfen, ob der Controller ist mit 5 % CO 2.
Hinweis: Für feuchte, CO 2 verläuft durch einen Luftbefeuchter ( Abb. 1E-8). Für Hypoxie Experimente, ein separater O 2 Regler ( Abb. 1E-9) ist im Setup enthalten. - Stellen Sie die Bühne Temperatur auf 37 ° C ( Abb. 1E -10). Für Hyperthermie Experimente, stellen Sie die Temperatur auf 42 ° c erlauben die Inkubation Einheit um die gewählte Temperatur und CO 2 Prozent erreichen.
- Nehmen die bildgebenden Kammer aus den wichtigsten CO 2 Inkubator und transportieren die Kammer in einer Petrischale auf die Mikroskopie Zimmer.
- Die bildgebende Kammer ( Abbildung 1A-4) in eine maßgeschneiderte, 35 mm Durchmesser inszenieren Halter ( Abbildung 1A -5) und die Kammer mit einem maßgeschneiderten Dichtung Deckel schließen ( Abbildung 1A-6).
Hinweis: Der Deckel kann CO 2 übergeben und verhindert Verdunstung und Kontamination.- Inkubation Gerät öffnen, ersetzen Sie den roten Patch mit der bildgebenden Kammer und schließen Sie das Gerät ( Abbildung 1). Tun Sie dies so schnell wie möglich zu verhindern, dass die Abkühlung der Zellen. Stellen Sie sicher, dass keine Kabel zwischen Bühne und das Mikroskop stecken.
- Lassen Sie das Gerät für 30 min. akklimatisieren
- Öffnen Sie die Software und die Laser einschalten.
Hinweis: Hier, 488 nm Argon, 543 nm Helium-Neon und 633 nm Helium-Neon Laser dienten. - Eine neue Datenbank zu machen, indem Sie auf " New " unter die Registerkarte "Datei" Namen und speichern Sie die Datenbank.
- Die Konfiguration festlegen, indem Sie auf " Config " unter die Registerkarte "Acquire" Select " Kanalmodus " und " eingleisig ", ein einzelnes Fluorophore zu bewerten oder " Multi-Track " für mehrere Fluorophore. Wählen Sie die entsprechende Bandpass-Filter entsprechen der Fluorophor (z. B. 560 bis 615 nm Bandpass-Filter für Dox und Dox-NP; siehe die Ergebnisse repräsentativ für weitere Beispiele). Wählen Sie den Hellfeld Kanal in einem der Tracks.
- Stellen Sie den Scan-Regler durch Klicken auf " Scan " unter die Registerkarte "Acquire" Set die Rahmengröße (1.024 x 1.024), Scan-Geschwindigkeit (optimal), Richtung (8-Bit, Single) scannen, und Scannen Sie Durchschnitt (4) durch Klicken auf " Modus. " setzen die Lochkamera (200 µm), gewinnen und ausgeglichen () z.B., 580, 700 und 835; (siehe Abbildung 3), und Laserleistung (488 = 10 543 = 100 % %, 633 = 100 %) durch Klicken auf " Kanäle. "
- Speichern Sie diese Einstellungen durch Klicken auf " Config " in der Konfiguration Registerkarte, und speichern Sie sie in der Konfigurationsdatenbank.
- Legen Sie durch Klicken auf den Zeitraffer " Multi Time X " ( Abbildung 1) in die Registerkarte "Makro" Klick " Single Lage ".
- Zu den Zellen im Fokus, den automatische Fokus in das Makro durch Klicken auswählen " Auto Focus. "
Hinweis: Autofokus wird mit dem 633-nm-Laser mit der Reflexion des Glases als Referenzpunkt erreicht. - Gelten die gespeicherte Konfiguration durch Klicken auf " eingleisig " oder " Multi Track " Scrollen auf die erforderliche Konfiguration in der Konfigurationsdatenbank, Einstellung des Zeitintervalls (z. B. 15 min), Anzahl der Scans (z.B. 97) und Klicken " Load Config. "
Hinweis: mit diesen Einstellungen, eine Zeitreihe von 97 x 15 min = 24 h vorgenommen werden. - Nennen den Zeitraffer in die " Basis Dateinamen " und wählen Sie die Datenbank (hergestellt in Schritt 3.11) durch Klicken auf " Bilddatenbank " um den Zeitraffer zu retten. Legen Sie einen temporären Ordner durch Klicken auf " Tmp Image Ordner. "
Hinweis: Wenn das System stoppt oder aus irgendeinem Grund abstürzt, befinden sich die Bilder in diesem Ordner. - Inkubation Gerät öffnen, heben Sie den bildgebenden Ring, einen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel, und schließen Sie das Gerät so schnell wie möglich. Konzentrieren und wählen Sie eine Position in der bildgebenden Kammer.
Hinweis: Diese Position enthält Zellen in einem monomolekularen Film, mit einem Minimum von 70 % Konfluenz, so dass für die Darstellung der einzelnen Zellen. - Die Konfigurationseinstellungen für den Hintergrund zu überprüfen und ggf. korrigieren.
Hinweis: Der Hintergrund kann durch Verringerung der Gewinn oder Laser macht korrigiert werden. Jede Änderung in der Konfiguration muss gespeichert werden (siehe Schritt 3.17) und geladen (siehe Schritt 3.18) wieder in das Makro. - In der laminaren Strömung Kabinett, verdünnen, freie Medikament oder Nanopartikel in einer Konzentration von 5 µg/mL Medikament oder 0,05 µmol der Lipide im Zellkulturmedium. Durch einen 0,22-µm-Spritze-Filter filtern, wenn die Droge/Nanopartikel nicht steril sind.
- Die Inkubation Kammer zu öffnen, heben Sie den Dichtringen Deckel das Medium aus den Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL der verdünnten Medikament/Nanopartikel und schließen Sie das Gerät so schnell wie möglich.
- Konzentrieren sich auf die Zellen und beginnen den Zeitraffer durch Klicken auf " Startzeit " im Makro Multi Time X.
- Überprüfen Sie regelmäßig, ob die Zellen noch im Fokus oder verwenden Sie den Autofokus (siehe Schritt 3.16). Das Programm speichert automatisch in der Datenbank den Zeitraffer; Schließen Sie die Datenbank nicht, während das Programm ausgeführt wird.
4. Analyse der Daten
- abhängig von der ursprünglichen Fragestellung verwenden Software-Programme wie ImageJ zur Datenanalyse (siehe Abschnitt Ergebnisse für Beispiele).
Representative Results
Kennzeichnung von liposomalen Träger mit verschiedenen Markern wurde zuvor beschriebenen9. Träger, beschriftet mit dunkelrote Dioctadecyl Tetramethylindotricarbocyanine Perchlorat (habe; Ex = 644 nm; EM = 665 nm) oder grüne 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; EM = 515 nm) sind in diesem Manuskript vorgestellt. Interzellulären Ähnlichkeiten und Unterschiede in liposomalen Aufnahme, Entlassung und intrazelluläre Lokalisation, zeigen mehrere Tumorarten untersucht wurden. Dazu gehören zwei Mauslinien, B16BL6 Melanom11 und Lewis Lungenkarzinom (LLC), und zwei menschliche Melanome, ein hoch metastatischen (BLM) und ein nicht-metastasierten (1F6) Melanom12,13. Alle Experimente wurden mit lebenden Zellen durchgeführt. In allen versuchen eine Konzentration von 5 µg/mL Dox, 5 µg/mL Dox-NP oder 0,05 µmol von Nanopartikeln wurden verabreicht, für 3 oder 24 h. gemessen und analysiert Dox (im Freien, freigegeben, gekapselten, abgesonderten oder eingefügten Form) als DXR bezeichnet wurden. Eine 40 X (numerische Apertur: 1.3) Öl-Objektiv verwendet wurde, und Bildgebung erfolgte mit einem 488 nm Argonlaser (10 % / 0,2 mW Leistung) und 505 bis 550 nm Bandpass-Filter für CF-PE und lysosomalen Marker (LM)-grün. 543 nm Helium-Neon Laser (100 % / 0,2 mW Leistung) und 560, 615 nm Bandpass-Filter wurde für Dox, Dox-NP und lysosomalen Marker-rot verwendet. Ein 633 nm-Helium-Neon-Laser (100 % / 0.5 mW Leistung) und einer 640 nm lang-Pass-Filter wurde für verwendet haben.
Wegen seiner Kapselung waren die in-vitro- Zytotoxizität, Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik von Dox signifikant veränderten3,9,14. Der Unterschied zwischen die Bioverfügbarkeit des Medikaments in freien und gekapselten Form verabreicht wird in Abbildung 3gezeigt. DOX ist ein intercalating Wirkstoff und muss den Zellkern zu zytotoxischen eingeben. Abbildung 3 und verwandte Filme 1 und 2 zeigen einen 3 h Zeitraffer der BLM Zellen mit Dox oder Dox-NP unter identischen Bedingungen behandelt. Innerhalb weniger Minuten Dox Exposition nukleare DXR beobachtet werden (Abb. 3A, Film 1) und mit einem niedrigeren gewinnen (einfügen), im Zellkern verschuppen gesehen werden kann. Im Gegensatz dazu ist bei Dox-NP, intrazellulären DXR kaum sichtbar innerhalb dieses Zeitrahmens (Abb. 3 b, Movie 2). Nur durch eine Erhöhung der Photomultiplier Gain, DXR im Zytoplasma beobachtet werden (insert). Verwendung von ImageJ, wurden die Pixel-Dichte der zytoplasmatischen und nukleare DXR analysiert. Wie Zellen im Zeitraffer Bewertung in Bewegung sind, ist es wichtig, Leuchtstofflampen mit Hellfeld Bildern kombinieren. Dies bietet die Möglichkeit der Verfolgung einzelner Zellen und stabilisieren die XY-Drift mit speziellen Plugins in ImageJ. In der in Abbildung 3dargestellten Analyse diente das Hellfeld Bild eine Region of Interest (ROI) um das Zytoplasma (durchgezogene Linie) und Kern (gepunktete Linie) zu zeichnen. Der ROI-Manager in ImageJ finden Sie unter dem Menüpunkt Analyze > Tools > ROI-Manager. Diese ROIs in das fluoreszierende Bild verwendet, um die Pixeldichte zu analysieren, indem Sie über den Menüpunkt Analyze > Maßnahme. Der Unterschied zwischen der Pixeldichte im Zellkern (Abbildung 3) und Zytoplasma (Abbildung 3D) der Dox - oder Dox-NP-behandelten Zellen bestätigt, was in den Bildern zu sehen ist. Darüber hinaus wurden Zellen inkubiert, für 24 h mit Dox oder Dox-NP, nach dem die Verbindung durch Medium ersetzt wurde und sofort mit erhöhter Empfindlichkeit der Photomultiplier Gain (Abbildung 4) abgebildet. Andere Einstellungen, wie z. B. Laserleistung, Offset, Lochkamera und Bildanzeige, waren identisch. Das niedrige DXR-Signal im Dox-NP-behandelten gegenüber Dox-behandelten Zellen fällt. Mit einem Gewinn von 700, wird DXR in den Dox-NP-behandelten Zellen sichtbar, während das Bild der Dox bereits überbelichtet ist. Diese einfachen in Vitro Experiment visualisiert einen signifikanten Unterschied in die Bioverfügbarkeit von versus gekapselte Droge frei.
Wenn Zellen kontinuierlich Dox-NP 24 Stunden ausgesetzt werden, baut DXR sich im Laufe der Zeit wie in Abbildung 5A und Filme 3 und 4 dargestellt. Das Signal erhöht im Zytoplasma, und später, DXR findet sich auch im Zellkern eingelagert. Diese Beobachtungen werden durch die Pixel-Dichte-Diagramme (Abb. 5 b) bestätigt. Die gemessenen zytoplasmatischen Pixeldichte ist niedriger bei BLM im Vergleich zu 1F6 Zellen aufgrund der Unterschiede in intrazelluläre Verteilung. Während DXR in 1F6 Zellen in der Zelle verteilt wird, konzentriert sich DXR in BLM Zellen mehr in ein Organell in der Nähe der Kern (Abbildung 5).
Daher war die Lokalisierung der Droge und Träger in verschiedenen Zelllinien (Abbildung 6) untersucht. Zellen wurden 24 Stunden mit Dox-NP/Tat und abgebildeten inkubiert. Mit dem Hellfeld Bild, war eine Überlagerung der Zellmembran (durchgezogene Linie) und Kern (gepunktete Linie) in das fluoreszierende Bild von drei verschiedenen Zelllinien gezogen. Es wird hier deutlich, dass die Träger, die mit beschriftet, folgt dem gleichen zytoplasmatischen Muster als DXR: in ein Organell in der Nähe der Kern im BLM, um den gesamten Kern in LLC, konzentriert und zufällig in das Zytoplasma in B16BL6 Zellen verteilt. Im Zellkern nur DXR und Nein gesehen werden kann, zeigt Dox veröffentlicht. Durch die Reduzierung der Photomultiplier Gain, einzelner zellulärer Vesikel mit DXR und Träger, beschriftet mit haben, sowie mit CF-PE (Zahlen 6 b und 6 C), gesehen werden können.
Zytoplasmatischen DXR Sequester in kleine Bläschen, und Zellen wurden mit einer live-lysosomale Zellmarkierung in grün oder rot gekennzeichnet. Die Bewegung dieser Lysosomen kann in den Zellen (Movie 5) verfolgt werden. Zytoplasmatischen DXR und die Nanocarrier colocalize innerhalb dieser Strukturen und der interzelluläre Unterschied in der DXR-Muster, wie in Abbildung 6zu sehen ist hier erklärt. Lysosomen sind zufällig verteilt Zytoplasma in B16BL6 und befinden sich neben den Zellkern im BLM Zellen (Abb. 7A). Mit ImageJ, NS1 zwischen DXR und Träger in den Lysosomen berechnet wurde (Abb. 7 b). Die Farbbilder wurden binäre (Prozess > binäre > stellen binäre) und mit dem NS1-Plug-in (Analyze > ns1), eine NS1 Bild setzte sich aus DXR mit haben. Dadurch entsteht ein Farbbild von grün-rot-weiß mit weißen Pixel, colocalized Pixel beider Bilder. Über das Menü Punkt Prozess > binäre > machen Binär, die weißen Pixel werden getrennt und zu schwarzen Pixel, aus denen die Pixeldichte gemessen (Analyze > Maßnahme). Danach erfolgte eine NS1 Bild zwischen diesem DXR-habe Bild und binäre Bild der lysosomalen Marker (LM) und Pixeldichte gemessen. Die NS1-Daten ist der Prozentsatz der Pixel positiv für DXR-Tat und DXR-Tat/lysosomalen Marker (Abbildung 7). Abbildung 7zeigt auch, dass die Träger, beschriftet mit CF-PE sowie wie in den Lysosomen befindet.
Abbildung 1: Instrumente und Ausrüstung Setup. (A) imaging Kammer + Notwendigkeiten. 25 mm #1 Deckglas (1), Unterteil der Kammer (2), top Teil der Kammer (Platzd auf den Kopf nach unten) und o-Ring (3), Bühne Halter (4) und Dichtung Deckel (5). Maßstabsleiste: 2 cm. B) Inkubation Einheit. Beheizte Mikroskop Phase (1), fließen mit in - und out - flow für CO2 (2), eine CO-2 -Sonde (3) und ein Abschluss-Patch (4). Maßstabsleiste: 2 cm. C) Imaging Kammer in den Inkubator-Einheit, wie unter dem Mikroskop zu sehen. (D) Multi-Zeitreihen Makro. (E) Ausrüstung für die Bildgebung. Inverted Mikroskop (1), fluoreszierendes Licht (2), Computer (3), Ring-Heizung (4, einfügen) und Controller (4, Hauptfigur), CO2 Strömung Schläuche (5), CO2 -Wegeventil (6), CO2 Controller (7), CO2 Luftbefeuchter (8), O2 Ventil und Controller (9) und Bühne Temperaturregler (10). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: der Mikroskop-Parameter im Protokoll Abschnitt 3 detaillierte schematische. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: die kurzfristige Aufnahme von Dox und Dox-NP zu untersuchen. BLM Zellen wurden kontinuierlich ausgesetzt Dox oder Dox-NP für 3 h und ein Zeitraffer aufgenommen. (A) noch Bilder von den Zeitraffer von Zellen mit Dox inkubiert. (B) noch Bilder von den Zeitraffer Zellen inkubiert mit Dox-NP. Maßstabsleiste = 50 µm (C) Pixel Dichte erhöhen der nuklearen DXR im Dox und Dox-NP-behandelten Zellen. (D) Pixel-Dichte-Erhöhung der zytoplasmatischen DXR im Dox und Dox-NP-behandelten Zellen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD 3 Zellen pro Feld. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Untersuchung der langfristigen Aufnahme von Dox und Dox-NP in verschiedenen Zelllinien. Zellen wurden ausgesetzt Dox oder Dox-NP und 24 h später abgebildet. Bilder wurden sofort nach dem Entfernen der Drogen, mit 3 verschiedenen Gewinne. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Untersuchung der zelluläre Aufnahme und Veröffentlichung von liposomalen Agenten. Zellen kontinuierlich Dox-NP 24 Stunden ausgesetzt waren, und ein Zeitraffer erfolgte. (A) noch Bilder von den Zeitraffer. Maßstabsleiste = 50 µm (B) Pixel Dichte erhöhen der DXR in den Zellkern und Zytoplasma. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD 3 Zellen pro Feld. (C) Bilder zeigen die Lokalisierung von DXR innerhalb der Zelle. Durchgezogene Linie: Zellmembran, gepunktete Linie: Kern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Untersuchung der Lokalisierung von Drogen- und Träger in verschiedenen Zelllinien. (A) Zellen ausgesetzt Dox-NP/hat für 24 h und abgebildet wurden. Maßstabsleiste = 50 µm. (B) Zellen wurden 24 h Dox-NP/haben/CF-PE ausgesetzt und abgebildet mit niedriger Intensität, einzelne Vesikel zu unterscheiden. (C) Bright-Feld und DXR überlagern zeigt DXR in zytoplasmatischen Vesikeln (Pfeil). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Untersuchung der die intrazelluläre Lokalisation der Drogen- und Träger. Zellen wurden ausgesetzt Dox-NP/hast oder CF-PE/hat für 24 h und Lysosomen werden visualisiert, mit dem Leben-Zelle lysosomalen Marker (LM) in grün oder rot. (A) intrazelluläre Lokalisation der DXR und der Träger (Tat). Die Pfeile sind 3 Beispiele von DXR und hat in den Lysosomen lokalisiert. Maßstabsleiste = 50 µm. (B) Co Lokalisierung Analyse der DXR und der Träger (Tat) in Lysosomen (LM) mit ImageJ. (C) Anteil an Co Lokalisierung von DXR und der Träger in Lysosomen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM 3 Versuche. (D) lysosomale Sequestrierung des Trägers visualisiert mit zwei verschiedenen Markern. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Film 1: im Zusammenhang mit Abbildung 3 : BLM-Zellen inkubiert mit Dox für 3 h. Zeitraffer: 19 Bilder mit einem Intervall von 10 min. Framerate: 3 fps. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
Film 2: im Zusammenhang mit Abbildung 3 : BLM-Zellen inkubiert mit Dox-NP für 3 h. Zeitraffer: 19 Bilder mit einem Intervall von 10 min. Framerate: 3 fps. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
Film 3: im Zusammenhang mit Abbildung 5 : BLM-Zellen inkubiert mit Dox-NP für 24 h. Zeitraffer: 96 Bilder, mit einem Abstand von 15 min. Framerate: 8 Bilder pro Sekunde. Maßstabsleiste = 50 µm. klicken Sie bitte hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download).
Film 4: im Zusammenhang mit Abbildung 5 : 1F6 Zellen inkubiert mit Dox-NP für 24 h Zeitraffer: 96 Bilder, mit einem Abstand von 15 min. Framerate: 8 Bilder pro Sekunde. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
Film 5: im Zusammenhang mit Abbildung 7 : Lysosomen von B16BL6 Zellen waren voller Flecken mit einem Leben Zellmarkierung. Zeitraffer: 10 Bilder mit einem Intervall von 10 s. Frame-Rate: 3fps. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
Discussion
Wie in der Vergangenheit beobachtet, kann Fixierung liposomale darin fast sofort zerstören und DXR veröffentlicht Form dieser zerstörten Liposomen noch die Zeit hatte, um den Kern, so dass die Interpretation der Daten sehr schwierig und sogar irreführend. Mit einigen mikroskopisch kleine Anpassungen kann der chemotherapeutische Schicksal in lebenden Zellen und Geweben routinemäßig untersucht werden, zu bestätigen oder histologische Beobachtungen zu stürzen. Eine neuere Arbeit zeigte die Aufnahme, Entlassung und Lokalisierung von DXR in Zellen mit freien und gekapselte Dox mit Leben-Zelle Zeitraffer bildgebenden9behandelt. Diese Arbeit beschreibt den Versuchsaufbau im Detail. Mit diesem Modell ist es möglich, visualisieren die unmittelbare Beförderung von Dox in den Zellkern, wo sammelt es kontinuierlich, bis die Zelle schließlich stirbt. Im Gegensatz dazu wenn Dox-NP verwendet wird, werden nur geringe Mengen an freigegebenen Dox im Kern gefunden. Obwohl Dauerbelastung kontinuierliche DXR Aufbau ergibt, das Fluoreszenzsignal ist viel niedriger im Dox-NP-versus Dox-behandelten Zellen, die einen Unterschied in zellulären Konzentration und anschließende Zytotoxizität. Darüber hinaus zeigte sich mithilfe von live-Zell-Marker, dass, wenn Zellen Dox-NP auszusetzen, DXR und die Nanocarrier in den Lysosomen befinden. Dies bedeutet, dass die komplette Liposomen von der Zelle aufgenommen wird und die Beteiligung von einem endocytic Weg während der Aufnahme von diesen Nanopartikeln zeigt. Die DXR im Zellkern ist eindeutig von freigegebenen Dox. Allerdings ist mit dieser Methode, wie die DXR und Träger Co lokalisieren und scheinen in Lysosomen gefangen werden, es immer noch nicht schlüssig ob dies ist gekapselt oder Dox veröffentlicht. Es ist möglich, dass die innere Stabilität der Nanopartikel verhindert Dox loslassen in den Lysosomen lokalisiert.
In diesem Protokoll zeigt live Cell Imaging über eine bestimmte mikroskopische Setup mit einem maßgeschneiderten Bühne Halter (die Spezifikationen auf Anfrage ausgehändigt). Confocal Mikroskop-Hersteller bieten jedoch eine Reihe von Inkubatoren, die live Cell Imaging durchführen. Erhaltung der Zelle Kulturbedingungen (d. h. Temperatur, CO2, pH-Wert, Feuchtigkeit und Sterilität) ist das wichtigste Kriterium für diese Inkubatoren und erfordert einige vorläufige Tests, um die richtigen Bedingungen festzulegen, die weiter erklärt. Automatisierte Übernahme Programme können auch von den gleichen Herstellern geliefert werden. Ein "Multi" Positionswahl macht es möglich, mehrere Positionen in der gleichen Kammer Bild verfeinern statistische Analyse. Allerdings erfordert diese Option in das Makro in diesem Manuskript erwähnt feste XYZ Positionen, mit denen die Möglichkeit, für Z-Drift korrigieren verloren geht. Scannen die Z-Dimension kann in diesem Makro und verwendet ein Schwerpunkt Flugzeug für die Analyse einbezogen werden. Dies erfordert jedoch zusätzliche scannen, wodurch die Möglichkeit der Phototoxizität und bleichen.
Wie bei alle fluoreszierenden Messungen, ist Überbelichtung ein Problem, vor allem, wenn zwei Verbindungen mit einer verschiedene zelluläre Aufnahme vergleichen. Die fluoreszente Intensität hängt nicht nur von der intrinsischen Signal der Verbindung, sondern auch auf die Geschwindigkeit der Aufnahme, die Konzentration und die Droge-Belichtungszeit. Wie in Abbildung 3 dargestellt, ist die nukleare DXR-Inhalt der Dox-behandelten Zellen bereits sichtbar, während kein Signal bei Dox-NP-behandelten Zellen vorkommt. Nur durch eine Erhöhung der Verstärkung kann die DXR im Dox-NP-behandelten Zellen visualisiert werden, führt zu Überbelichtung im Dox-behandelten Zellen. Darüber hinaus auch intrazellulär Dox-NP ist heterogen verteilt, was unvermeidlich unter führen kann- oder Überbelichtung. Vor allem bei der Untersuchung der zellulären DXR Verlockende Falle wurde der Gewinn deutlich reduziert, um einzelnen Organellen (zahlen 5 b und 5 C) zu unterscheiden. So sind die Messungen von Pixeldichte vertreten die repräsentative Bilder für die richtige Interpretation der Ergebnisse beizufügen.
Phototoxizität, Bleichen und ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis sind ebenfalls wichtige Themen in der Fluoreszenz-Mikroskopie und ein Kompromiss zwischen der Qualität des Bildes und die Bildaufnahme muss festgelegt werden. Auch wenn das Mikroskop-Setup optimal ist, wird die Bildqualität jedoch auch weitgehend durch die Qualität der Zellen und der zusätzlichen Verbindung bestimmt. DXR gibt ein starkes Signal, und mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen Bleichen wurde nicht beobachtet, auch nach längerer Zeit (bis zu 72 h). Die Reduzierung der das Fluoreszenzsignal kann jedoch auch eine Folge der Fluth. Ausfluss ist ein wichtiges Phänomen in der Droge Widerstand15 und tritt auf, wenn die Droge aus den intrazellulären Ort des Geschehens Zellen abzupumpen. Eine Abnahme der das Fluoreszenzsignal im Laufe der Zeit kann daher auch ein Ergebnis von Dox Efflux9sein. Vergleicht man das Fluoreszenzsignal nicht gescannt Lage am Ende des Experiments mit das letzte Bild aus der Time-Lapse-Serie zeigen, Bleichen (d.h. das Signal wird höher sein an der Stelle nicht gescannt) oder Efflux (d. h., beide Signale werden identisch sein). In Programmen wie ImageJ16gibt es verschiedene Justizvollzugsanstalten Möglichkeiten (z. B. Hintergrund, Drift, Bleichen, etc.). Auch wenn die fluoreszente Intensität im Laufe der Zeit zunimmt, kann die Konfigurationseinstellungen vorab bewertet in einem Pilotversuch Überbelichtung zum Jahresende im Zeitraffer (Schritt 3.21) zu minimieren. Alternativ kann eine bildgebende Kammer mit Zellen bereits, das Medikament für den gewünschten Zeitraum verwendet werden, um die Einstellungen zu initialisieren. Schließlich für diese Art von Analyse, giftige Droge Konzentrationen (Schritt 3.22) sollte vermieden werden und vordefinierte mit konventionellen Bio-Assays.
Zellen sind ständig kultiviert und gepflegt im Medium ohne Phenol rot. Phenol rot fluoresziert im roten Teil des Spektrums und zellulare Organellen, am ehesten Lysosomen, Darstellung von falsch-positiven Informationen (Schritt 1.2) beobachtet werden. Damit kann für die Überwachung der einzelnen Zellen, sollten Zelle Zusammenfluss 70 % (Schritt 3.1.) nicht überschreiten. Die CO2 -Strömungsgeschwindigkeit (Schritt 3.5) muss geregelt werden, in einem Experiment Validierung, wenn die Ausrüstung gekauft wird oder nach der Wartung. Wenn die Geschwindigkeit zu hoch ist, wird Medium verdampfen. Wenn die Drehzahl zu niedrig ist, steigt der pH-Wert des Mediums, die beeinflussen Zellwachstum. Als das Medium ohne das Phenol rot pH Indikator Veränderung des pH-Wertes können nicht beobachtet werden und sind daher leicht zu übersehen. Nachdem die CO2 Strömung validiert wurde, können diese Einstellungen in allen zukünftigen versuchen verwendet werden.
Mit der beschriebenen Methode hier, kann das Schicksal von Nanopartikeln einfach untersucht werden mit live Cell Imaging und Zeitraffer-Mikroskopie. In diesem Verfahren wurden im Handel erhältlichen Nanopartikel eingesetzt. Aber das Schicksal von wärmeempfindlichen17, kationische Liposomen10; Liposomen angereichert mit kurzkettigen Shingolipids18; und Nanopartikel Kapselung von anderen Drogen,8,19 wurden auf diese Weise im Tumor und normale Zellen untersucht.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Mikroskopie Einrichtungen verwendet, sind Teil des Erasmus Optical Imaging Center und möchten wir den Mitarbeitern der Organisation der Islamischen Konferenz für ihre Dienste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
