Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bruke In Vitro Live-celle Imaging for å utforske Chemotherapeutics levert av Lipid-baserte nanopartikler

Published: November 1, 2017 doi: 10.3791/55405
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus MC

Summary

Live-celle bildebehandling er et kraftig verktøy for å visualisere dynamisk prosesser. Undersøkelse av fast celler inneholder bare statiske bilder, som kan føre til feiltolkning og forvirring om prosessen. Dette arbeidet gir en metode for å studere opptak, narkotika utgivelsen og intracellulær lokalisering av liposomal nanopartikler i levende celler.

Abstract

Konvensjonelle Bildeteknikker kan gi detaljert informasjon om cellulære prosesser. Men denne informasjonen er basert på statiske bilder i en ellers dynamisk system, og etterfølgende produksjonsfaser er lett oversett eller misforstått. Live-celle bildebehandling og time-lapse mikroskopi, der levende celler kan følges for timer eller dager i en mer eller mindre sammenhengende måte, er derfor meget informativ. Protokollen beskrevet her gir etterforskningen av skjebnen til chemotherapeutic nanopartikler etter levering av doksorubicin (dox) i levende celler. Dox er en intercalating agent som må bli løst fra sin nanocarrier å bli biologisk aktive. Til tross for sin kliniske registrering for mer enn to tiår, er sine opptak, sammenbrudd og narkotika utgivelsen fortsatt ikke fullt ut forstått. Denne artikkelen Utforsker hypotesen at lipid-baserte nanopartikler tas av kreftceller og sakte er degradert. Utgitt dox er deretter translocated til kjernen. For å hindre fiksering gjenstander, kan live-celle bildebehandling og time-lapse mikroskopi, beskrevet i denne eksperimentelle prosedyren brukes.

Introduction

Muligheten til å følge en biologisk prosess, for eksempel celle-celle interaksjoner, inter- og intracellulær transport, cytotoksiske sammensatte opptak og protein-protein samspill enkelt molekyler i levende celler og vev, har fått stor interesse siste tiår, som det gir den ekstra dimensjonen i "sanntid." I dette manuskriptet er en metode å følge intracellulær skjebnen til gratis dox og dox i nanopartikler (Dox-NP) beskrevet.

Nanopartikler har blitt brukt i flere tiår til å behandle visse kreftformer. Dox-NP er godkjent for behandling av AIDS-relaterte Kaposis sarkom avansert eggstokkene og bryst kreft, og multippel myelom1. Det var en av de første liposomal nanopartikler utviklet og introdusert i klinisk setting. Den frie form, dox, tømmes langt fra blodsirkulasjonen, begrenser kapasiteten på svulst nettstedet i tilstrekkelige mengder. Videre er behandling ledsaget av alvorlige og dose begrensende bivirkninger, som stomatitt og hjertesvikt. Når innkapslet i pegylert liposomal nanopartikler øker sirkulasjon tiden fra minutter til dager2. Denne typen kolesterol inneholder liposome er ganske stabil og stabilitet bestemmer farmakokinetikken av innkapslede narkotika.

Dette stivhet har imidlertid en ulempe. Cytotoksiske evnen til et stoff mot kreftceller er første evaluert i vitro, og det har vist at dox er mer potent enn Dox-NP i cytotoksiske søk3,4. Var hypotesen at stabiliteten av transportøren hindrer utgivelsen og mobilnettet opptak av stoffet, og det er verdt å undersøke dette fenomenet ytterligere. De iboende liposomal egenskapene, bygget for aggressiv elementer i blodet og på svulst nettstedet intakt, resulterte i svekket biotilgjengeligheten av cytotoksiske komponenten (dvs. dox) på webområdet (dvs. svulst cellekjernen). Selv om Dox-NP hardily bedret svaret sammenlignet med den frie form, var det fortsatt av klinisk verdi, som innkapsling betydelig redusert cardiotoxic effekter5. I årene etter var andre forbindelser innkapslet i nano-bærere6. Også endre bærere resulterte i utløste narkotika utgivelsen (dvs. på svulst området) men opprettholdt stabilitet i blod sirkulasjon7,8. Til tross for år med etterforskning og klinisk bruk er intratumoral skjebnen til nanocarriers som Dox-NP fortsatt ikke helt klart. I en fersk publikasjon, ble det vist at hydrogenion er tatt opp som en helhet mens dox er fanget i lysosomer9.

Mobilnettet opptak av en hydrogenion og narkotika utgivelse er dynamisk prosesser som kan best bli overvåket med live-celle imaging. Videre klassisk histology, i hvilke celler er ruges og deretter fast, kan gi falske resultater hvis fiksering ødelegger liposomal bærer og introduserer gjenstander. Det viktigste kravet for live-celle imaging er visualisering, fortrinnsvis med fluorescens, av ønsket prosessen. Visse stoffer, som dox, har en iboende røde fluorescens. Også fluorescerende markører kan bli introdusert i transportøren, og cellen organeller kan visualiseres ved hjelp av live-celle markører. På denne måten kan en rekke parametre, som opptak av transportør, narkotika utgivelsen og mobilnettet lokalisering av operatør og narkotika, fotografert og analyseres. Her er en metode beskrevet som etterfølges intercellulære skjebnen til dox og Dox-NP i flere kreftceller i sanntid. Også denne metoden kan være enkelt tilpasses til å skape de ideelle forholdene for målrettet (f.eks belastet nanopartikler10) og utløst (f.eks hypertermi7) stoffet utgivelsen.

Protocol

1. forberedelse

  1. montere tenkelig kammeret, som består av to deler som.
    1. Plasser et 25 mm cover glass ( figur 1A -1) i den nederste delen av kammer ( figur 1A -2) og skru den øverste delen i den nederste delen ( figur 1A -3). Ikke trekk for hardt som glasset kan bryte. Autoclave kammeret ( figur 1A -4).
  2. Forberede celle kultur medium ved supplere Dulbecco ' s endret Eagle ' s Medium (DMEM) uten fenol røde med 10% inaktivert fosterets kalv serum (FCS) og 1 mM L-glutamin under sterile forhold. Butikken på 4 ° C og varmt 37 ° c før bruk.
  3. Opprettholde cellene med celle kultur medium i dyrking flasker med standard celle kultur teknikker.
    Merk: Her to mus linjer, melanom B16BL6 11 og Lewis lunge karsinom (LLC) og to menneskelige melanomer, BLM og 1F6 12, ble brukt.
  4. Lag 0,1% gelatin av veier og oppløse gelatin i fosfat-bufret saltvann (PBS) på 37 ° C over natten. Sterilisere løsningen ved å filtrere det gjennom en 0.22-µm og lagre den på 4 ° C.

2. Plate celler

  1. fjerne tenkelig kammeret av sterilisering posen i en laminær strømning skap, nøye stramme kammeret og plasserer den i en Petriskål.
    Merk: For å unngå forurensning, holde tenkelig kammeret i en Petriskål til kammeret kan plasseres under mikroskopet.
  2. Coat glass tenkelig kammeret med 1 mL av 0,1% sterile etter 20 min på 37 ° C og 5% CO 2.
    Merk: Dette vil gi bedre celle vedlegg.
  3. Fjerne mediet fra celle kultur flasker (se trinnene 1.2 og 1.3), vask en gang med 1 x PBS og koble celler med 0,25% trypsin. Deaktiver trypsin ved å legge til celle kultur medium, samle cellene, Nedspinning dem 1100 x g i 5 min og resuspend pellet i 5 mL av celle kultur medium.
  4. Fortynne 20 µL av cellen suspensjon med 20 µL av trypan blå (som vil bli tatt av død celler). Antallet levende og døde celler ved hjelp av en hemocytometer; Antall døde celler må ikke overstige 10%.
  5. Sug opp gelatin og tallerkenen cellene i en fortynning som gir opptil 70% dekning innen 24 timer. For eksempel bruke en fortynning av 5 x 10 4 eller 10 x 10 4 celler i 1 mL. At cellene å forholde seg til 5% CO 2 og 37 ° C for 24 h.

3. Time-lapse mikroskopi ( figur 2)

Merk: her, AC confocal mikroskop med en skreddersydd scenen holder ble brukt, selv om de fleste produserer tilbyr en rekke inkubatorer for live-celle imaging som er passer også undersøke nanoparticulated narkotika-leveranser.

  1. Vurdere cellene under et mikroskop for confluency, mobilnettet morfologi og forurensning. Plasser kammeret tilbake i CO 2 inkubator.
    Merk: Confluency må ikke overstige 70%. Hvis mobilnettet morfologi er inkonsekvent (dvs. cellene ikke holder seg) eller forurensning oppdages, forkaste tenkelig kammeret.
  2. Bytte på AC confocal mikroskopet ( figur 1E -1), fluorescerende lys ( figur 1E -2), og datamaskinen ( figur 1E -3).
  3. Koble linsen ovnen til målet og sett den til 35 ° C ( figur 1E -4 + insert).
  4. Forberede inkubasjon enheten, som vist i figur 1B.
    Merk: Denne enheten består av et oppvarmet Stadium ( figur 1B -1), en flyt scene med en kobling for CO 2 rør ( figur 1B -2) og CO 2 probe ( figur 1B -3), og en rød avsluttende patch ( figur 1B -4). Denne oppdateringen brukes midlertidig lukke enheten til tenkelig kammeret er plassert.
  5. Plasser inkubasjon enheten på mikroskopet scenen og koble i - og post-ut - flow CO 2 rør ( figur 1E-5). Åpne CO 2 hovedkranen ( figur 1E -6), og slå på CO 2 kontrolleren ( figur 1E -7). Kontroller at kontrolleren er satt til 5% CO 2.
    Merk: For fuktighet, CO 2 passerer gjennom en luftfukter ( figur 1E-8). For hypoksi eksperimenter, en separat O 2 regulator ( figur 1E-9) er inkludert i installasjonsprogrammet.
  6. Setter scenen temperaturen til 37 ° C ( figur 1E -10). Hypertermi eksperimenter, satt temperaturen til 42 ° C. Tillat inkubasjon enheten til valgte temperaturen og CO 2 prosent.
  7. Ta tenkelig kammeret fra viktigste CO 2 inkubator og transportere kammeret i en Petriskål mikroskopi rommet.
  8. Plass tenkelig kammeret ( figur 1A -4) i en skreddersydd, 35 mm-diameter scenen holderen ( figur 1A-5) og tett kammeret med skreddersydde tetting lokk ( Figur 1A -6).
    Merk: Lokket lar CO 2 skjedde og forhindrer fordampning og forurensning.
    1. Åpne inkubasjon enheten, erstatte røde oppdateringen med imaging kammeret og lukke enheten ( figur 1 c). Gjør dette mulig å hindre nedkjøling av cellene. Kontroller at ingen kabler sitter fast mellom scenen og mikroskopet.
  9. La enheten akklimatisere seg i 30 min.
  10. Åpne programvare og slå på lasere.
    Merk: Her, 488 nm argon 543 nm helium-neon og 633-nm helium-neon lasere ble brukt.
  11. Lage en ny database ved å klikke " New " under kategorien navn og lagre databasen.
  12. Angir konfigurasjonen ved å klikke " Config " under kategorien anskaffe Velg " kanaler " og " enkelt spor " å vurdere en enkelt fluorophore eller " flere spor " for flere fluorophores. Velg passende båndpass filtrene matchende fluorophore (f.eks 560 til 615 nm bånd-pass filter for dox og Dox-NP, se representant resultatene flere eksempler). Velg kanalen som lyse-feltet i ett av sporene.
  13. Angi kontrollen skanning ved å klikke " skanne " under kategorien anskaffe sette bildestørrelsen (1024 x 1024), skannehastighet (optimalt), skanne retning (8-bits, single), og Skann gjennomsnitt (4) ved å klikke " modus. " sette hullet (200 µm), få og forskyvning () f.eks, 580 700 og 835; se Figur 3), og laser makt (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) ved å klikke " kanaler. "
  14. lagre disse innstillingene ved å klikke " Config " i konfigurasjonen tab og lagre dem i konfigurasjonsdatabasen.
  15. Angi den time-lapse ved å klikke " Multi tid X " ( figur 1 d) i kategorien makro Klikk " enkelt sted ".
  16. å holde cellene i fokus, Velg automatisert fokuset i makroen ved å klikke " Auto fokus. "
    Merk: autofokus oppnås med 633-nm laseren bruker refleksjon av glasset som et referansepunkt.
  17. Bruke den lagrede konfigurasjonen ved å klikke " enkelt spor " eller " flere spor, " rulle til konfigurasjonen i konfigurasjonsdatabasen, Angi tidsintervallet (f.eks 15 min), antall skanninger (f.eks 97) og klikke " laste Config. "
    Merk: bruker disse innstillingene, vil det bli gjort en gang-serie 97 x 15 min = 24 h.
  18. Navn time-lapse i den " Base navnet ", og velge databasen (laget i trinn 3.11) ved å klikke " Image Data Base " lagre den time-lapse. Angi en midlertidig mappe ved å klikke " Tmp bilde mappen. "
    Merk: Hvis systemet stopper eller krasjer grunn, bildene ligger i denne mappen.
  19. Åpne incubating enheten, løft tenkelig ringen, legge en dråpe neddyppingsolje til målet, og lukke enheten så fort som mulig. Fokus og velge en posisjon i tenkelig kammeret.
    Merk: Denne posisjonen inneholder celler i en monolayer, med minst 70% confluency, slik at for avbilding av enkeltceller.
  20. Kontroller konfigurasjonsinnstillingene for bakgrunnen og korriger om nødvendig.
    Merk: Bakgrunnen kan korrigeres ved å redusere gevinst eller laser makt. Endringer i konfigurasjonen må lagres (se trinn 3.17) og lastet (se trinn 3,18) igjen i makroen.
  21. i laminær strømning skap, fortynne gratis narkotika eller nanopartikler en konsentrasjon av 5 µg/mL-drug eller 0,05 µmol av lipider i celle kultur medium. Filtrere gjennom filtere 0.22-µm sprøyte Hvis stoffet/nanopartikler ikke sterilt.
  22. Åpne incubating kammeret, løfte tetting lokket, fjerne mediet fra cellene, Legg 1 mL av utvannet stoffet/nanopartikler og lukke enheten mulig.
  23. Fokuserer på celler og start den time-lapse ved " Start Time " i makroen Multi tid X.
  24. Sjekk regelmessig om cellene er fortsatt i fokus eller bruk autofokus (se trinn 3.16). Programmet lagrer automatisk den time-lapse i databasen. ikke lukk databasen mens programmet kjører.

4. Dataanalyse

  1. avhengig av opprinnelige problemstillingen, bruker programmer som ImageJ for dataanalyse (se resultatinndelingen eksempler).

Representative Results

Merking liposomal operatører med forskjellige indikatorer har vært beskrevet tidligere9. Bærere merket med langt rødt dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine-perklorat (gjorde; Ex = 644 nm; EM = 665 nm) eller grønn 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; EM = 515 nm) presenteres i dette manuskriptet. Viser intercellulære likheter og forskjeller i liposomal opptak, utgivelse og intracellulær lokalisering, forskjellige svulst ble studert. Disse inkluderer to mus linjer, B16BL6 melanom11 og Lewis lunge karsinom (LLC), og to menneskelig melanomer, en svært metastatisk (BLM) og en ikke-metastatisk (1F6) melanom12,13. Alle eksperimenter som ble utført med levende celler. Alle eksperimenter, en konsentrasjon av 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP eller 0,05 µmol av nanopartikler ble administrert for 3 eller 24 h. målte og analysert dox (i gratis, utgitt, innkapslede, sequestered eller under Sommer form) ble referert til som DXR. En 40 X (numerisk aperture: 1,3) olje linsen ble brukt, og bildebehandling ble utført med en 488 nm argon laser (10% / 0,2 mW strøm) og en 505 til 550 nm bånd-pass filter for CF-PE og lysosomale markør (LM)-grønn. En 543 nm helium-neon laser (100% / 0,2 mW strøm) og filtere 560 til 615 nm båndpass ble brukt for dox Dox-NP og lysosomale markør-rød. En 633 nm helium-neon laser (100% / 0,5 mW strøm) og et 640 nm lang-pass filter ble brukt for gjorde.

På grunn av sin innkapsling var den i vitro cytotoksisitet AC, biotilgjengelighet og farmakokinetikken av dox betydelig endret3,9,14. Forskjellen mellom biotilgjengeligheten av stoffet når det gis gratis og innkapslet er vist i Figur 3. Dox er en intercalating agent og må angi cellekjernen bli cytotoksisk. Figur 3 og relaterte filmer 1 og 2 viser en 3t time-lapse BLM celler behandlet med dox eller Dox-NP under like. Innen minutter dox eksponering, kjernefysiske DXR kan observeres (figur 3A, film 1) og bruke en lavere få (sett), ses intercalating i kjernen. I kontrast, når utsatt for Dox-NP, er intracellulær DXR knapt synlig innenfor denne tidsrammen (figur 3B, Movie 2). Bare ved å øke photomultiplier gevinst, DXR i cytoplasma kan observeres (Sett inn). Bruker ImageJ, ble pixel tettheten av cytoplasmatiske og kjernefysiske DXR analysert. Som cellene er i bevegelse under time-lapse evaluering, er det viktig å kombinere fluorescerende med lyse-feltet bilder. Dette gir mulighet for sporing enkeltceller og stabilisere XY-drift ved hjelp av bestemte plugins i ImageJ. I analyse presentert i Figur 3, ble lyse-feltet bildet brukt for et område av interesse (ROI) rundt cytoplasma (heltrukket linje) og kjernen (stiplet linje). Den avkastning manager i ImageJ kan finnes i menypunktet analyser > verktøy > ROI manager. Disse ROIs brukes i fluorescerende bildet for å analysere tettheten ved hjelp av menyelementet analyser > mål. Forskjellen mellom tettheten i kjernen (Figur 3 c) og cytoplasma (figur 3D) av dox eller Dox-NP-behandlet celler bekrefter hva er sett i bilder. Også ble celler inkubert 24 h dox eller Dox-NP, hvoretter sammensatt var erstattet av middels og umiddelbart fotografert med økt følsomhet på photomultiplier gevinst (Figur 4). Andre innstillinger, for eksempel laser makt, forskyvning, pinhole og bildevisning, var identiske. Lav DXR signalet i Dox-NP-behandlet sammenlignet dox-behandlet celler er slående. Bruker en gevinst på 700, blir DXR i Dox-NP-behandlet cellene synlige, mens bildet av dox allerede er overexposed. Denne enkle i vitro eksperimentet visualiserer en betydelig forskjell i biotilgjengeligheten av gratis versus innkapslede narkotika.

Når cellene er kontinuerlig utsatt for Dox-NP 24 h, bygger DXR opp over tid, som vist i figur 5A og filmer 3 og 4. Signalet øker i cytoplasma og senere DXR finnes også under Sommer i kjernen. Disse observasjonene er bekreftet av pixel tettheten grafene (figur 5B). Den målte cytoplasmatiske tettheten er lavere i BLM sammenlignet 1F6 celler på grunn av forskjellen i intracellulær distribusjon. Mens DXR i 1F6 celler er distribuert over hele cellen, er DXR i BLM celler mer konsentrert i en organelle nær kjernen (figur 5C).

Derfor ble lokalisering av narkotika og bærer ulike linjer (figur 6) undersøkt. Cellene ble inkubert 24 h med Dox-NP/gjorde og fotografert. Ved hjelp av lys-feltet bilde, ble et overlegg av cellemembranen (heltrukket linje) og kjernen (stiplet linje) trukket i fluorescerende bildet av tre forskjellige linjer. Det er vist her at transportøren, merket med gjorde, følger det samme cytoplasmatiske mønsteret som DXR: konsentrert i en organelle nær kjernen i BLM, rundt hele kjernen i LLC, og tilfeldig spredt over hele cytoplasma i B16BL6 celler. I kjernen, bare DXR og ingen kan sees, som angir utgitt dox. Ved å redusere photomultiplier gevinst, personlige mobilnettet blemmer som inneholder DXR og bærer, merket med gjorde, samt med CF-PE (tall 6B og 6 C), kan sees.

Cytoplasmatiske DXR sequesters i små blemmer, og cellene som ble merket med en live-celle lysosomale markør i grønt eller rødt. Flytting av disse lysosomer kan følges i cellene (film 5). Cytoplasmatiske DXR og nanocarrier colocalize i disse strukturene, og intercellulære forskjellen i DXR mønster, som vist i figur 6, er forklart her. Lysosomer distribueres tilfeldig i cytoplasma i B16BL6 og er plassert ved kjernen i BLM celler (figur 7A). Bruker ImageJ, colocalization mellom DXR og bærer lysosome ble beregnet (figur 7B). Fargebilder laget binære (prosess > binære > gjøre binær) og bruker colocalization plug-in (analyser > Colocalization), et colocalization bilde var laget av DXR med gjorde. Dette skaper en grønn-rød-hvitt farget bilde, med hvite piksler som representerer colocalized pikslene i både bilder. Via menyen artikkel prosessen > binære > gjøre binær, hvite bildepunktene atskilt, og vil konverteres til svart piksler, som tettheten måles (analyser > mål). Etter en colocalization bildet ble laget mellom denne DXR-bildet og binære bildet lysosomale markør (LM) og tettheten målt. Colocalization dataene er prosentandelen av piksler positivt for DXR-gjorde og DXR-gjorde/lysosomale markør (figur 7C). At transportøren, merket med CF-PE også som gjorde, er plassert i lysosome er også vist i figur 7 d.

Figure 1
Figur 1: instrumenter og utstyr oppsett. A) imaging kammer + nødvendigheter. 25 mm #1 dekke glass (1), nederst i kammeret (2), topp del av kammeret (stedd opp ned) og O-ring (3), scenen holderen (4) og tetting lokk (5). Skala bar: 2 cm. B) inkubasjon enhet. Oppvarmet microscope trinn (1), flyt scenen med i - og post-ut - flow for CO2 (2), en CO2 sonde (3), og en avsluttende patch (4). Skala bar: 2 cm. C) tenkelig kammer i inkubator enheten, som sett under microscope. D) multi-tid serien makro. E) utstyr for bildebehandling. Invertert mikroskopet (1), fluorescerende lys (2), datamaskinen (3), ring varmeapparatet (4 sett) og controller (4 viktigste figur), CO2 flyt rør (5), CO2 ventilen (6), CO2 -kontroller (7), CO2 luftfukter (8), O2 ventil og kontrolleren (9), og scenen temperatur kontrolleren (10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk av mikroskopet parameterne i protokollen avsnitt 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: undersøker kortsiktige opptaket av dox og Dox-NP.  BLM celler ble kontinuerlig utsatt for dox eller Dox-NP for 3t, og en time-lapse ble tatt. (A) fremdeles bilder av den time-lapse celleområde inkubert med dox. (B) fremdeles bilder av den time-lapse celleområde inkubert med Dox-NP. Skala bar = 50 µm. (C) Pixel tettheten økning av kjernefysiske DXR i dox og Dox-NP-behandlet celler. (D) Pixel tettheten økning av cytoplasmatiske DXR i dox og Dox-NP-behandlet celler. Dataene representerer den gjennomsnittlig ± SD på 3 celler per felt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: undersøker langsiktige opptaket av dox og Dox-NP i forskjellige cellelinjer. Cellene ble utsatt for dox eller Dox-NP og fotografert 24 timer senere. Bildene ble tatt umiddelbart etter fjerning av narkotika, med 3 forskjellige gevinster. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: undersøke mobilnettet opptak og utgivelsen av liposomal agenter. Cellene ble kontinuerlig utsatt for Dox-NP 24 h, og en time-lapse ble gjort. (A) fremdeles bilder av den time-lapse. Skala bar = 50 µm. (B) Pixel tettheten økning av DXR i kjernen og cytoplasma. Dataene representerer den gjennomsnittlig ± SD på 3 celler per felt. (C) bilder viser lokaliseringen av DXR i cellen. Heltrukket linje: cellemembranen, prikket linje: kjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: undersøker lokalisering av narkotika og bærer ulike cellelinjer. (A) celler ble utsatt for Dox-NP/gjorde for 24t og fotografert. Skala bar = 50 µm. (B) celler ble utsatt for Dox-NP/gjorde/CF-PE for 24t og fotografert med en lavere intensitet gevinst å skille personlige blemmer. (C) Bright-feltet og DXR overlegg viser DXR cytoplasmatiske blemmer (pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: undersøkelse av den intracellulære lokaliseringen av stoffet, og bærer. Cellene ble utsatt for Dox-NP/gjorde eller CF-PE/hadde 24 h, og lysosomer er visualisert ved å bruke live-celle lysosomale markøren (LM) i grønt eller rødt. (A) intracellulær lokalisering av DXR og bærer (gjorde). Pilene representerer 3 eksempler på DXR og gjorde lokalisert i lysosome. Skala bar = 50 µm. (B) co lokalisering analyse av DXR og bærer (gjorde) i lysosomer (LM) bruker ImageJ. (C) prosent av co lokalisering av DXR og bærer i lysosomer. Dataene representerer den gjennomsnittlig ± SEM 3 personlige eksperimenter. (D) lysosomale fremdeles bærer visualisert ved hjelp av to forskjellige markører. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: relatert til Figur 3 : BLM celler ble inkubert med dox for 3 h. Time-lapse: 19 bilder, med et intervall på 10 min. bildefrekvens: 3 fps. Skala bar = 50 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 2
Film 2: relatert til Figur 3 : BLM celler ble inkubert med Dox-NP for 3 h. Time-lapse: 19 bilder, med et intervall på 10 min. bildefrekvens: 3 fps. Skala bar = 50 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 3
Filmen 3: relatert til Figur 5 : BLM celler ble inkubert med Dox-NP for 24 h. Time-lapse: 96 bilder, med et intervall på 15 min. bildefrekvens: 8 fps. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 4
Film 4: relatert til Figur 5 : 1F6 celler ble inkubert med Dox-NP for 24 h. Time-lapse: 96 bilder, med et intervall på 15 min. bildefrekvens: 8 fps. Skala bar = 50 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 5
Film 5: relatert til Figur 7 : Lysosomer av B16BL6 celler var farget med en live-celle markør. Time-lapse: 10 bilder, med et intervall på 10 s. bildefrekvens: 3fps. Skala bar = 50 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Som observert i siste, fiksering kan ødelegge liposomal nanocarriers nesten umiddelbart og DXR utgitt form disse ødelagt liposomer fortsatt hadde tid til å angi kjernen, gjør tolkningen av data svært vanskelig og selv misvisende. Med justeringer mikroskopiske kan chemotherapeutic skjebne i levende celler og vev bli rutinemessig undersøkt for å bekrefte eller styrte histologiske observasjoner. En fersk papir viste opptak, release, og lokalisering av DXR-cellene behandlet med gratis og innkapslet dox bruker live-celle time-lapse tenkelig9. Dette verket beskriver oppsettet av eksperimentelle nærmere. Bruker denne modellen, er det mulig å visualisere umiddelbar transport av dox til kjernen, hvor det kontinuerlig akkumuleres inntil cellen til slutt dør. I kontrast, når Dox-NP, finnes bare små mengder av utgitt dox i kjernen. Selv om kontinuerlig eksponering resulterer i kontinuerlig DXR buildup, fluorescerende signalet er mye lavere i Dox-NP-kontra dox-behandlet celler, som indikerer en forskjell i mobilnettet konsentrasjon og påfølgende cytotoksisitet. Videre bruker live-celle markører, ble det vist at når utsette cellene Dox-NP, DXR og nanocarrier ligger i lysosome. Dette angir at fullstendig liposome er tatt opp av cellen og demonstrerer involvering av en endocytic veien under opptaket av disse nanopartikler. DXR i kjernen er tydelig fra utgitt dox. Imidlertid er bruker denne metoden, som både DXR og bærer co lokalisere og synes å være fanget i lysosomer, det fortsatt usikker om dette er innkapslet eller utgitt dox. Det er mulig at indre stabilitet i hydrogenion hindrer dox utgivelsen når lokalisert i lysosome.

I denne protokollen, er live-celle imaging vist med en bestemt mikroskopiske oppsett, med en skreddersydd scenen holder (spesifikasjonene kan gis på forespørsel). Men tilbyr mest AC confocal mikroskop produserer en rekke inkubatorer som utfører live-celle bildebehandling. Bevare celle oppdrettsforholdene (dvs. temperatur, CO2, pH, fuktighet og sterilitet) er Hovedkriteriet for disse inkubatorer og krever noen foreløpige tester for å finne de riktige forholdene, som er nærmere forklart. Automatisert oppkjøpet programmer kan også leveres av samme produserer. En "Multi" alternativet gjør det mulig å image flere posisjoner i samme kammeret, raffinering statistisk analyse. Dette alternativet i makroen nevnt i dette manuskriptet krever imidlertid fast XYZ posisjoner, som muligheten til å korrigere Z-drift er tapt. Skanning Z-dimensjonen kan inkluderes i denne makroen og bruker fokus flyet for analyse. Dette krever imidlertid ekstra skanning, øker muligheten for phototoxicity og bleking.

Som med alle fluorescerende målinger, er overeksponering et problem, spesielt når man sammenligner to forbindelser med en annen mobilnettet opptak. Fluorescerende intensiteten er ikke bare avhengig på iboende signalet av sammensatt, men også på frekvensen av opptak, konsentrasjonen og narkotika eksponeringstid. Som vist i figur 3, er kjernefysiske DXR innholdet av dox-behandlet celler allerede synlige, mens noe signal er sett i Dox-NP-behandlet celler. Bare ved å øke gevinsten kan DXR i Dox-NP-behandlet celler visualiseres, fører til overeksponering i dox-behandlet celler. Dessuten, selv intracellulært Dox-NP heterogeneously distribueres, noe som kan resultere i uunngåelig under- eller overeksponering. Spesielt når undersøke mobilnettet DXR entrapment, redusert gevinst betydelig skille personlige organeller (tall 5B og 5 C). Dermed må målingene representert ved pikseltetthet ledsages av representant bildene for riktig tolkning av resultatene.

Phototoksisitet, bleking og en lav signal-til-støy-forhold er også viktige saker i fluorescerende mikroskopi, og et kompromiss mellom kvaliteten på bildet og det bilde må opprettes. Imidlertid selv når mikroskopet er optimal, avhenger bildekvaliteten også i stor grad av kvaliteten på cellene og ekstra sammensatte. DXR gir et kraftig signal og, med de riktige forholdsreglene, bleking ble ikke observert, selv etter lengre perioder (opptil 72 h). Imidlertid kan reduksjon av fluorescerende signalet også være et resultat av middelklasseinnbyggere. Middelklasseinnbyggere er et viktig fenomen i stoffet motstand15 og oppstår når cellene pumpe ut stoffet intracellulær området av handlingen. En nedgang på fluorescerende signalet over tid kan derfor også være et resultat av dox middelklasseinnbyggere9. Sammenligne fluorescerende signalet fra en ikke-skannet plassering på slutten av eksperimentet med det siste bildet fra time-lapse serien vil demonstrere bleking (dvs. signalet vil være høyere i den ikke-skannet plasseringen) eller middelklasseinnbyggere (dvs. begge signalene blir identiske). Flere kriminalomsorgen alternativer (f.eks bakgrunn, drift, bleking, etc.) er tilgjengelige i programmer som ImageJ16. Også som fluorescerende intensiteten øker over tid, kan konfigurasjonen innfatningene være pre evaluert i et pilotprosjekt å minimere overeksponering på slutten av det time-lapse (trinnet 3,21). Alternativt kan en tenkelig kammer med celler allerede utsatt for stoffet for den ønskede tidsperioden brukes til å initialisere innstillingene. Endelig for denne typen analyse, giftige stoffet konsentrasjoner (trinn 3,22) bør unngås og pre opprettet ved hjelp av konvensjonelle bio-analyser.

Celler er kontinuerlig kultivert og vedlikeholdes i medium uten fenol red. Fenol rødt fluoresces i den røde delen av spekteret og kan observeres i mobilnettet organeller, mest sannsynlig lysosomer, presentere falske positive informasjon (trinn 1.2). For å tillate overvåking av enkelte cellene, bør cellen samløpet ikke overstige 70% (trinn 3.1.). CO2 flyt-hastigheten (trinn 3,5) må reguleres en validering eksperiment når utstyret kjøpes eller vedlikehold. Når hastigheten er for høy, vil middels fordampe. Når hastigheten er for lav, øker pH i medium, som kan påvirke cellevekst. Mediet er uten fenol red pH indikator endringer i pH kan observeres og er derfor lett oversett. Når CO2 flyten er validert, brukes disse innstillingene i alle senere eksperimenter.

Med metoden beskrevet her kan skjebnen til nanopartikler lett undersøkes med live-celle bildebehandling og time-lapse mikroskopi. I denne fremgangsmåten ble kommersielt tilgjengelig nanopartikler brukt. Men skjebnen til thermosensitive17, kationisk liposomer10; liposomer beriket med kort-kjeden shingolipids18; og nanopartikler innkapsle andre rusmidler8,19 ble også undersøkt på denne måten i svulsten og normale celler.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Mikroskopi fasilitetene brukes er en del av Erasmus optisk Imaging Center, og vi ønsker å takke ansatte på OIC for sine tjenester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (no phenol-red) Sigma D1145 Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS
Trypsin-versene (EDTA) Lonza BE17-161E
Fetal calf serum Sigma F7524 Heat inactivate for 30 min at 55 ºC
L-Glutamin Lonza BE17-605E
Gelatin from bovine skin Sigma G9391 Make a 0,1% solution in PBS, sterile
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Stericup 0,22 µm filter - 500 ml  Millipore SCGPU05RE
Trypan-blue Sigma T8154
Cells: Lewis lung carcimoma ATCC CRL-1642
Cells: B16BL6 Dr. P. Brouckaert, Ghent University donated Ref.10
Cells: BLM and 1F6 Dr. van Muijen, University of Nijmegen donated Ref.11
Petri dish Greiner 664160
Doxorubicin Actavis  mentioned as dox in the manuscript
Doxil/Caelyx Janssen-Cilag mentioned as Dox-NP in the manuscript
Syringe filter 0.2 µm VWR international 10462200
Lysotracker-green DND-26 Invitrogen L7526 mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript
Lysotracker-red DND-99 Invitrogen L7528 mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript
Attofluor cell ring Invitrogen A7816
Cover glass 25 mm #1 Thermo scientific CB00250RA1
Stage holder + sealing lid Custom made
ZEISS LSM 510 microscope Zeiss
Software LSM 510 version 3.2 SP2 Zeiss
Image J NIH https://imagej.nih.gov/ij/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
  2. Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
  3. Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
  4. Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
  5. Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
  6. Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
  7. Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
  8. Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
  9. Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
  10. Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
  11. Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
  12. Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
  13. Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
  14. Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
  15. Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
  16. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  17. Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
  18. Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
  19. Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).

Tags

Medisin problemet 129 levende celle tenkelig time-lapse mikroskopi nanopartikler lysosomer celler fluorescens
Bruke <em>In Vitro</em> Live-celle Imaging for å utforske Chemotherapeutics levert av Lipid-baserte nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T.… More

Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T. L. M. Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles. J. Vis. Exp. (129), e55405, doi:10.3791/55405 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter