Summary
Клеток является мощным инструментом для визуализации динамических процессов. Изучение основных клеток обеспечивает только статические изображения, которые могут привести к неправильному толкованию и путаницы о процессе. Эта работа представляет метод для изучения поглощения, релиз наркотиков и внутриклеточной локализации липосомальных наночастиц в живых клетках.
Abstract
Обычные методы визуализации могут предоставить подробную информацию о клеточных процессах. Однако эта информация основана на статических изображений в противном случае динамической системы, и последовательных этапов легко забывают или неправильно. Клеток и покадровой микроскопии, в котором живые клетки может следовать за несколько часов или даже дней в более или менее постоянной моды, поэтому очень информативный. Протокол, описанные здесь позволяет для расследования судьбы химиотерапевтических наночастиц после доставки доксорубицин (dox) в живых клетках. DOX является интеркалирующего агента, который должен быть освобожден от его nanocarrier, чтобы стать биологически активных. Несмотря на его клинической регистрации для более чем двух десятилетий еще не полностью понимаются его поглощения, разбивка и выпуска препарата. Эта статья исследует гипотезу, что наночастиц на основе липидов, принимаются опухолевых клеток и медленно деградируют. Выпущенные dox затем перемещен в ядро. Чтобы предотвратить фиксации артефакты, клеток и time-lapse микроскопии, описанные в этой экспериментальной процедуре, могут применяться.
Introduction
Способность следовать биологического процесса, например взаимодействия ячеек, Интер- и внутриклеточного транспорта, цитотоксических составные поглощения и взаимодействия протеин протеина одного молекул в живых клеток и тканей, приобрела большой интерес в последние десятилетие, поскольку она обеспечивает дополнительное измерение «реального времени». В этой рукописи описан метод следовать внутриклеточных судьбы бесплатно dox и dox включены в наночастиц (Dox-НП).
Наночастицы использовали на протяжении десятилетий для лечения некоторых видов рака. DOX-NP был одобрен для лечения связанных со СПИДом саркома Капоши, расширенный яичников и рак молочной железы и множественной миеломы1. Это был один из первых липосомальных наночастиц разработаны и внедрены в клинических условиях. В свободной форме, dox, значительно очищается от циркуляции крови, ограничивая свою способность достичь опухоли в достаточных количествах. Кроме того лечение сопровождается тяжелой и доза ограничение побочных эффектов, например, стоматит и сердечной недостаточности. Когда инкапсулированные в Пегилированный липосомальных наночастиц циркуляции время увеличивается от минут до2дней. Этот тип холестерина содержащих липосом является довольно стабильным, и эта стабильность определяет фармакокинетики инкапсулированные наркотиков.
Однако это жесткость имеет оборотную сторону. Цитотоксическую способность соединения к опухолевых клеток является первая оценка в пробирке, и было доказано, что dox является более мощным, чем Dox-NP в цитотоксических assays3,4. Было предположить, что стабильность перевозчика предотвращает выпуска и клеточного поглощения препарата, и это стоит исследовать это явление далее. Липосомальный свойств, построен к последнему агрессивные элементы в поток крови и достичь опухоли нетронутыми, привели к ослабленным биодоступность цитотоксических компонента (т.е. dox) на целевом сайте (например, опухоль клеточное ядро). Хотя Dox-NP смело улучшились по сравнению с свободной форме ответ, он по-прежнему клинического значения, как инкапсуляция значительно уменьшить кардиотоксический эффект5. В последующие годы другие соединения были инкапсулированы в нано перевозчиков6. Кроме того изменения несущих привело вызвали наркотиков выпуска (т.е., на участке опухоли), но сохраняет стабильность в циркуляции крови,7,,8. Несмотря на годы расследований и клинического применения внутриопухолевых судьбы nanocarriers как Dox-NP по-прежнему не совсем ясны. В недавней публикации было показано, что наночастицы занимает в целом dox остается в ловушке в лизосомы9.
Клеточного поглощения наночастиц и наркотиков выпуска являются динамические процессы, которые лучше всего могут контролироваться с использованием клеток. Кроме того классическая гистология, в котором клетки инкубируют и впоследствии исправлены, может дать ложные результаты, если фиксация разрушает липосомальных перевозчика и вводит артефактов. Основным требованием для клеток является визуализация, предпочтительно к флуоресцирование, желаемого процесса. Некоторые соединения, как dox, имеют встроенные красной флуоресценцией. Кроме того флуоресцентные маркеры могут быть введены в перевозчика, и органеллы клетки могут быть визуализированы с помощью маркеров клеток. Таким образом массив параметров, как усвоение перевозчика, релиз наркотиков и клеточной локализации перевозчика и наркотиков, может отражаться и проанализированы. Здесь метод описан в которой следуют межклеточных судьба dox и Dox-NP в ряде опухолевых клеток в режиме реального времени. Кроме того, этот метод может быть легко адаптирована к создать идеальные условия для целевых (например, взимается наночастиц10) и вызвали выпуска препарата (например, гипертермия7).
Protocol
1. Подготовка
- собрать тепловизионной камеры, которая состоит из двух частей.
- Место 25-мм крышка стекла ( рис. 1а -1) в нижней части камеры ( рис. 1A -2) и винт верхней части в нижней части ( рис. 1A -3). Не затягивайте слишком сильно, как стекло может разбиться. Автоклав всю камеру ( рис. 1A -4).
- Подготовить клеток питательной среды, дополняя Дульбекко ' s Modified Eagle ' s среднего (DMEM) без фенола красного с 10% тепло инактивированная плода теленка сыворотки (FCS) и 1 мм L-глютамина в стерильных условиях. Хранить при 4 ° C и тепло до 37 ° C перед использованием.
- Сохранить клетки с среднего культуры клеток в колбы с использованием стандартной ячейки культуры методов культивирования.
Примечание: Здесь, две мыши клеточных линий меланомы B16BL6 11 Льюис легких рак (ООО) и два человека меланомы, BLM и 1F6 12, были использованы и. - Сделать 0,1% желатина путем взвешивания и растворения желатина в фосфат амортизированное saline (PBS) при 37 ° C ночь. Стерилизовать решение путем фильтрации через фильтр 0,22 мкм и хранить его на 4 ° C.
2. Пластина клетки
- Удалить тепловизионные камеры из мешка стерилизации в поток Ламинарный шкаф, тщательно затяните палата и поместите его в чашку Петри.
Примечание: Чтобы избежать загрязнения, держать тепловизионные камеры в чашке Петри до тех пор, пока Камера может быть помещена под микроскопом. - Слой стекла тепловизионные камеры с 1 мл 0,1% стерильный желатина для 20 минут при 37 ° C и 5% CO 2.
Примечание: Это позволит лучше клеток вложение. - Удалить носитель из колбы культуры клеток (см. шаги 1.2 и 1.3), мыть раз с ПБС и отсоединить клетки с помощью трипсин 0.25%. Инактивирует трипсина, добавив клеток питательной среды, собирать клетки, спина их вниз на 1100 x g 5 мин и Ресуспензируйте гранулы в 5 мл среды культуры клеток.
- Развести 20 мкл суспензии клеток с 20 мкл Трипановый синий (который будет поглощаться мертвых клеток). Подсчитать количество живых и мертвых клеток, используя Горяева; количество мертвых клеток не должна превышать 10%.
- Аспирационная желатин и плиты клетки в разведении, что позволяет для максимального охвата 70% в течение 24 ч. Например используйте разрежения 5 x 10-4 или 10 х 10 4 клеток в 1 мл. Позволяют клеткам присоединиться в 5% CO 2 и 37 ° C в течение 24 ч.
3. Покадровой микроскопии ( рис. 2)
Примечание: здесь, был использован Конфокальный микроскоп с держателем по индивидуальному заказу стадии, хотя большинство производителей предлагают широкий спектр инкубаторы-клетка изображений, также подходит для расследования доставки лекарств nanoparticulated.
- Оценить клетки под микроскопом для confluency, клеточной морфологии и загрязнения. Поместите камеру обратно в инкубаторе CO 2.
Примечание: Confluency не должна превышать 70%. Если клеточной морфологии является несовместимым (т.е. клетки не придерживаются) или обнаружено загрязнение, отбросить тепловизионные камеры. - Переключиться на confocal микроскопа ( Рисунок 1E -1), флуоресцентный свет ( Рисунок 1E -2) и компьютер ( Рисунок 1E -3).
- Подключите нагреватель объектив к цели и установить его на 35 ° C ( Рисунок 1E -4 + Вставка).
- Подготовить инкубационный блок, как показано на рисунке 1B.
Примечание: Этот блок состоит из Подогреваемый столик ( рис. 1B -1), этап потока с разъемом для CO 2 трубы ( рис. 1B -2) и CO 2 зонд ( Рисунок 1B -3) и красный закрытия патч ( рис. 1B -4). Этот патч используется временно закрыть блок до тех пор, пока тепловизионная камера помещается. - Место инкубационный блок на микроскопа и подключить в - и вне - flow CO 2 труб ( фигуры 1E -5). Откройте главный клапан CO 2 ( Рисунок 1E -6) и переключитесь на контроллере CO 2 ( Рисунок 1E -7). Проверьте, что контроллер установлен в 5% CO 2.
Примечание: Для влажности, CO 2 проходит через увлажнитель ( Рисунок 1E -8). Для экспериментов гипоксии, отдельный регулятор 2 O ( Рисунок 1E -9) включен в установку. - Установите температуру стадии до 37 ° C ( Рисунок 1E -10). Для гипертермии экспериментов, установите температуру 42 ° C. разрешить инкубационный блок для достижения заданной температуры и CO 2 процент.
- Взять тепловизионные камеры от основной CO 2 инкубатора и транспорт в камеру в чашке Петри в микроскопии комнату.
- Место тепловизионные камеры ( рис. 1A -4) в заказ, 35 мм в диаметре ступень держатель ( Рисунок 1A -5) и закрыть камеру с заказной уплотнение крышки ( Рисунок 1A -6).
Примечание: Крышка позволяет CO 2 пройти и предотвращает испарение и загрязнения.- Откройте инкубационный блок, заменить красный патч с тепловизионной камерой и закройте прибор ( рис. 1 c). Сделать это как можно быстрее, чтобы предотвратить охлаждение клетки. Убедитесь, что кабели не застряли между стадии и микроскопом.
- Оставить блок акклиматизироваться на 30 мин
- Открытое программное обеспечение и включить лазеры.
Примечание: Здесь, 488 нм аргон 543 Нм гелий неоновых, Лазеры гелий неоновые 633 нм были использованы и. - Сделать новую базу данных, нажав " новой " под вкладку файл имя и сохранить базу данных.
- Задать конфигурацию, нажав " Config " под приобретать tab. Выберите " режим канала " и " один трек " для оценки одного Флюорофор или " мульти трек " для нескольких флуорофоров. Выберите соответствующий полосовые фильтры, соответствующие Флюорофор (например, 560 до 615 Нм полосовой фильтр для dox и Dox-NP; см. Представитель результаты для больше примеров). Выберите канал, ярко поля в одной из композиций.
- Регулятор сканирования, нажав " сканирования " под вкладку приобрести набор размер кадра (1024 x 1024), скорость сканирования (оптимальная), проверять направление (8-бит, один) и проверять среднее (4), нажав " режим. " задать обскуры (200 мкм), получить и смещение () например, 580, 700 и 835; Смотрите Рисунок 3) и мощность лазера (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%), нажав " каналы. "
- сохранить эти настройки, нажав " Config " в конфигурации вкладки и сохранить их в базе данных конфигурации.
- Задать промежуток времени, нажав " Multi время X " ( рис. 1 d) в закладке макрос Click " одно местоположение ".
- Сохранить клетки в фокусе, выберите автоматизированных фокус в макрос, щелкнув " Auto Focus. "
Примечание: автофокус достигается с 633 нм лазер, с использованием отражения стекла в качестве точки отсчета. - Применить сохраненную конфигурацию, нажав " один трек " или " мульти трек, " прокрутка до требуемой конфигурации в базе данных конфигурации, установив интервал времени (например, 15 мин), количество проверок (например, 97) и нажав " нагрузки Config. "
Примечание: с помощью этих параметров, будет производиться раз серии 97 x 15 мин = 24 ч. - Имя промежуток времени в " имя файла базы " и выберите базу данных (сделано в шаге 3.11), нажав " база данных изображений " сохранить промежуток времени. Установить во временную папку, нажав " Tmp изображения папки. "
Примечание: Если система останавливается или по любой причине, изображения расположены в этой папке. - Открыть инкубирования единица, поднимите изображений кольцо, добавить каплю масла погружения в цель и закройте блок как можно быстрее. Фокус и выберите позицию в тепловизионной камере.
Примечание: Эта позиция содержит клетки в монослое, с минимум 70% confluency, позволяя для визуализации отдельных клеток. - Проверить параметры конфигурации для фона и при необходимости исправьте.
Примечание: Фон может быть исправлена путем уменьшения прибыли или лазерной энергии. Любые изменения в конфигурации необходимо сохранить (см. шаг 3.17) и загрузки (см. шаг 3.18) снова в макросе. - В Шкаф ламинарный поток, разбавить бесплатные наркотиков или наночастиц в концентрации 5 мкг/мл препарата или 0,05 мкмоль липидов в среде культуры клеток. Фильтр через фильтр шприц 0,22 мкм, если наночастиц наркотиков не стерильных.
- Открыть инкубирования палата, поднимите крышку уплотнения, удалить носитель из клеток, добавляют 1 мл разбавленного наркотиков/наночастиц и как можно быстрее закрыть блок.
- Сосредоточиться на клетки и начать покадровой, нажав " время начала " в Multi время X макро.
- Регулярно проверять, чтобы увидеть, если клетки находятся до сих пор в центре внимания или использовать автофокусировки (см. шаг 3.16). Программа автоматически сохраняет промежуток времени в базе данных; не закрыть базу данных, в то время как программа выполняется.
4. Анализ данных
- в зависимости от первоначального исследования вопрос, использовать программное обеспечение программы, такие как ImageJ для анализа данных (см. раздел результаты для примеров).
Representative Results
Маркировка липосомальных перевозчиков с различными маркерами был ранее описанных9. Перевозчиков, с far-red dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine перхлорат (сделал; Ex = 644 Нм; Ет = 665 нм) или Зеленая 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 Нм; Ет = 515 нм) представлены в этой рукописи. Чтобы показать межклеточных сходства и различия в липосомальных поглощения, выпуска и внутриклеточной локализации, были изучены несколько типов опухолей. К ним относятся две мыши линии, B16BL6 меланомы11 и карциномой легкого Льюис (ООО) и два человека меланомы, высоко метастатического (БЛМ) и меланома не метастатическим (1F6)12,13. Все эксперименты проводились с использованием живых клеток. В всех экспериментов концентрация dox 5 мкг/мл, 5 мкг/мл Dox-NP или 0,05 мкмоль наночастиц были administered для 3 или 24 h. измеренных, так и проанализированы dox (в форме бесплатно, выпущенные, инкапсулированные, арестованной или вставными) назывались DXR. 40 X (числовая апертура: 1.3) нефти объектива была использована, и изображений была исполнена с 488 нм Аргоновый лазер (10% / 0,2 МВт мощности) и 505 до 550 Нм полосовой фильтр для CF-PE и лизосомальных маркер (лм)-зеленый. Гелий неоновый лазер 543 Нм (100% / 0,2 МВт мощности) и 560 до 615 Нм полосовой фильтр был использован для dox, Dox-NP и лизосомальных маркер красный. 633 нм гелий неонового лазера (мощностью 100% / 0,5 МВт) и 640 Нм Лонг-фильтр был использован для сделал.
Из-за его инкапсуляции в vitro цитотоксичность, биодоступность и фармакокинетики dox были значительно изменены3,9,14. Разница между биодоступность препарата при приеме в форме свободных и инкапсулированные показана на рисунке 3. DOX интеркалирующего агента и должны ввести в ядре клетки, чтобы стать цитотоксических. Рисунок 3 и похожие фильмы 1 и 2 показывают 3 h покадровой BLM клеток, относились с dox или Dox-NP в одинаковых условиях. В течение нескольких минут воздействия dox ядерная DXR можно наблюдать (рис. 3а, 1 кино) и, используя меньше получить (вставка), можно увидеть вставочный в ядре. В противоположность этому при контакте с Dox-NP, внутриклеточных DXR едва заметны в пределах данного тайм фрейма (фильм 2,рис. 3B). Только путем увеличения выгоды фотоэлектронный умножитель, может наблюдаться DXR в цитоплазме (вставить). С помощью ImageJ, плотность пикселей ядерные и цитоплазматические DXR были проанализированы. Как клетки находятся в движении во время промежуток времени оценки, важно сочетать люминесцентные с ярко поле изображения. Это представляет возможность отслеживания отдельных ячеек и стабилизации XY-дрейф, используя конкретные плагины в ImageJ. В анализ, представленный на рисунке 3светлые области изображения было использовано для привлечения региона интерес (ROI) вокруг цитоплазмы (сплошная линия) и ядра (пунктирная линия). ROI менеджер в ImageJ можно найти в пункте меню Analyze > инструменты > менеджер ROI. Эти трансформирования используются люминесцентные изображения для анализа плотность пикселей с помощью пункта меню Analyze > мера. Разница между плотность пикселей в ядре (рис. 3 c) и цитоплазмы (рис. 3D) dox - или Dox-NP-лечение клеток подтверждает, что видно на изображениях. Кроме того клетки инкубировали за 24 ч с dox или Dox-NP, после чего соединение был заменен среднего и немедленно отражаться с повышенной чувствительностью фотоэлектронный умножитель прибыль (рис. 4). Другие параметры, например мощности лазера, смещение, точечным и изображения, были идентичны. Поразительно низкий сигнал DXR Dox-NP-лечение по сравнению с dox лечение клеток. С помощью усиления 700, DXR в клетках Dox-NP-лечение становится видимым, тогда как изображение dox уже переэкспонированных. Этот простой в vitro эксперимент визуализирует существенное различие в биодоступность свободных против инкапсулированные наркотиков.
Когда клетки постоянно подвергаются воздействию Dox-NP за 24 ч, DXR нарастают с течением времени, как показано на рисунке 5А и фильмы 3 и 4. Сигнал увеличивается в цитоплазме, и позднее, также DXR находится интеркалированного в ядре. Эти наблюдения подтверждаются графики плотности пикселей (Рисунок 5B). Плотность измеренной цитоплазматических пикселей ниже в BLM, по сравнению с 1F6 клеток из-за разницы в внутриклеточного распределения. DXR в 1F6 клетках распространяется по всей ячейки, в то время как DXR в клетках BLM больше сосредоточена в органеллы недалеко от ядра (рис. 5 c).
Таким образом был исследован локализации наркотиков и перевозчика в различных клеточных линий (рис. 6). Клетки инкубировали за 24 ч с Dox-NP/сделал и фотосъемка. Используя светлые области изображения, наложение клеточной мембраны (сплошная линия) и ядра (пунктирная линия) было обращено в флуоресцентного изображения трех различных клеточных линий. Здесь показано, что перевозчик, помечены по той же схеме цитоплазматических как DXR: сосредоточены в органеллы недалеко от ядра в BLM, вокруг всего ядра в ООО и случайно, разбросанных по всей цитоплазме в B16BL6 клетках. В ядре, только DXR и не видно, указывающее выпустила dox. Уменьшая выгоды фотоэлектронный умножитель, отдельных клеточных везикулы, содержащие DXR и перевозчиком, помечены сделал, а также с CF-PE (цифры 6B и 6 C), можно увидеть.
Цитоплазматическая DXR секвестров в мелких пузырьков, и клетки были помечены с маркером лизосомальных клеток в зеленый или красный. Движение этих лизосомы можно проследить в клетках (фильм 5). Цитоплазматическая DXR и nanocarrier colocalize в рамках этих структур, и межклеточных разница в DXR шаблон, как показано на рисунке 6, объясняется здесь. Лизосомы случайным образом распределены по всей цитоплазме в B16BL6 и расположены рядом с ядром в BLM клеток (рис. 7A). С помощью ImageJ, colocalization между DXR и перевозчиком в Лизосома была рассчитана (рис. 7B). Цвет изображения были сделаны двоичные (процесс > бинарные > сделать бинарный) и, используя плагин colocalization (анализ > Colocalization), образ colocalization был сделан из DXR с сделал. Это создает образ цветной зеленый красно белые, с белыми пикселами, представляющих colocalized пикселей оба изображения. Через меню пункт процесс > бинарные > сделать бинарный, белые пиксели будут отделены и преобразованы в черных точек, от которых отмеряется плотность пикселей (анализ > мера). После этого, colocalization изображение было сделано между этой DXR-изображение и измерены двоичное изображение лизосомальных маркер (LM) и плотность пикселей. Colocalization данных — это процент пикселей позитивные для DXR-сделал и DXR-сделал/лизосомальных маркер (рис. 7 c). Что перевозчик, а также помечены CF-PE как, расположен в Лизосома также показано на рисунке 7 d.
Рисунок 1: инструменты и оборудование установки. A) imaging камеру + предметов первой необходимости. 25-мм #1 крышка стекла (1), нижней части камеры (2), лучшие части камеры (местоd вверх вниз) и уплотнительное кольцо (3), этап держатель (4) и уплотнение крышки (5). Линейки: 2 см. B) инкубационный блок. Подогреваемый столик микроскопа (1), поток сцену с в - и вне - flow для CO2 (2), CO2 зонд (3) и закрытия патч (4). Линейки: 2 см. C) Imaging палаты в группе инкубатора, как увидеть под микроскопом. D) Multi-времени серии макрос. E) оборудование для томографии. Инвертированный микроскоп (1), флуоресцентный свет (2), компьютер (3), кольцевой нагреватель (4, вставить) и контроллер (4, Главная фигура), CO2 потока труб (5), CO2 клапан (6), контроллер CO2 (7), CO2 увлажнитель (8), O2 клапана и контроллер (9) и этап регулятор температуры (10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема параметров Микроскоп, подробно изложены в протоколе Секция 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: расследование краткосрочные поглощение dox и Dox-NP. Клетки BLM непрерывно подвергаются dox или Dox-NP для 3 h, и промежуток времени было принято. (A) все еще фотографии покадровой клетки инкубировали с dox. (B) все еще фотографии покадровой клетки инкубировали с Dox-NP. Шкалы бар = 50 µm. (C) пиксель плотность увеличение ядерных DXR dox - и Dox-NP-лечение клеток. (D) увеличение плотности пикселей цитоплазматических DXR dox - и Dox-NP-лечение клеток. Данные представляют собой среднее ± SD 3 клетки одного поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: исследование долгосрочных поглощение dox и Dox-NP в различных клеточных линий. Клетки были подвержены dox или Dox-NP и образы 24 часа позже. Изображения были приняты сразу же после удаления наркотиков, с 3 различные выгоды. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: исследование клеточного поглощения и освобождение липосомальных агентов. Клетки были постоянно подвергаются воздействию Dox-NP за 24 ч, и промежуток времени была сделана. (A) все еще фотографии промежуток времени. Шкалы бар = 50 µm. (B) пиксель плотность увеличение DXR в ядре и цитоплазме. Данные представляют собой среднее ± SD 3 клетки одного поля. (C) изображения, демонстрируя локализации DXR внутри клетки. Сплошная линия: клеточной мембраны, пунктирная линия: ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: расследование локализации наркотиков и перевозчика в различных клеточных линий. (A) клетки были подвержены Dox-NP/сделал для 24 h и образы. Шкалы бар = 50 µm. (B) клетки были подвержены Dox-NP/сделал/CF-PE за 24 часа и образы с нижней интенсивности получить различать отдельные пузырьки. (C) ярко поле и DXR наложение показаны DXR в цитоплазматических везикул (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: расследование внутриклеточной локализации наркотиков и перевозчика. Клетки были подвержены Dox-NP/сделал или CF-PE/сделал за 24 ч, и лизосом визуализируются с использованием клеток лизосомальных маркер (LM) в зеленый или красный. (A) внутриклеточной локализации DXR и перевозчика (DiD). Стрелки представляют 3 Примеры DXR и сделал локализованных в Лизосома. Шкалы бар = 50 µm. (B) совместно локализации анализ DXR и перевозчик (DiD) в лизосом (LM) с помощью ImageJ. (C) доля совместного локализация DXR и перевозчика в лизосом. Данные представляют собой среднее ± SEM 3 отдельных экспериментов. (D) лизосомальных поглощения перевозчика визуализируется с использованием двух различных маркеров. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: связанные с Рисунок 3 : BLM клетки инкубировали с dox для 3 h. Промежуток времени: 19 изображений, с интервалом в 10 мин Частота кадров: 3 fps. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2: связанные с Рисунок 3 : BLM клетки инкубировали с Dox-NP для 3 h. Промежуток времени: 19 изображений, с интервалом в 10 мин Частота кадров: 3 fps. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 3: связанные с Рисунок 5 : BLM клетки инкубировали с Dox-NP за 24 ч. Промежуток времени: 96 изображений, с интервалом 15 мин Частота кадров: 8 fps. Шкалы бар = 50 мкм.
Фильм 4: связанные с Рисунок 5 : 1F6 клетки инкубировали с Dox-NP за 24 ч. Промежуток времени: 96 изображений, с интервалом 15 мин Частота кадров: 8 fps. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Кино 5: связанные с Рисунок 7 : Лизосомы B16BL6 клетки окрашивали с маркером клеток. Промежуток времени: 10 изображений, с интервалом 10 s. частота кадров: 3fps. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Discussion
Как отмечалось в прошлом, фиксация может разрушить липосомальных nanocarriers почти сразу и DXR выпустила формы этих уничтоженных липосомы еще время, чтобы войти ядро, что делает интерпретации данных очень трудным и даже вводить в заблуждение. С некоторыми изменениями, микроскопические химиотерапевтические судьба в живых клеток и тканей могут расследоваться регулярно подтвердить или свержения гистологические наблюдений. Недавний документ, показал поглощения, выпуска и локализации DXR в клетках, обработанных с свободными и инкапсулированные dox, с использованием клеток промежуток времени визуализации9. Эта работа описывает экспериментальной установки более подробно. С помощью этой модели, это позволяет визуализировать немедленной транспортировки dox к ядру, где он постоянно накапливается до тех пор, пока клетка в конце концов умирает. В противоположность этому когда используется Dox-NP, только небольшое количество выпущенных dox находятся в ядре. Несмотря на непрерывное воздействие приводит к непрерывной DXR накопления, флуоресцентного сигнала значительно ниже в Dox-NP-против dox лечение клетки, указывающее разницу в клеточных концентрации и последующих цитотоксичности. Кроме того с помощью маркеров клеток, было показано, что, когда разоблачение клетки Dox-NP, DXR и nanocarrier расположены в Лизосома. Это означает, что полный липосом занимают ячейку и демонстрирует участие endocytic путь в ходе внедрения этих наночастиц. Ясно из выпущенных dox DXR в ядре. Однако используя этот метод, как перевозчика, так и DXR совместно локализации и, кажется, быть в ловушке в лизосомы, это до сих пор безрезультатно ли это инкапсулирован или выпущен dox. Вполне возможно, что внутренняя стабильность наночастиц предотвращает dox-релиз когда локализуется в Лизосома.
В этом протоколе клеток показана с помощью конкретных микроскопических установки, с держателем на заказ этап (спецификации может быть предоставлена по запросу). Однако наиболее Конфокальный микроскоп производителей предлагают широкий спектр инкубаторы, которые выполняют клеток. Сохранение условий культуры клеток (например, температуры, CO2, рН, влажность и стерильности) является главным критерием эти инкубаторы и требует некоторых предварительных испытаний для определения надлежащих условий, далее пояснил, что. Приобретение программ автоматизированных баз данных также могут быть доставлены же производителей. Параметр «Multi расположение» позволяет изображения несколько позиций в той же камере, уточнения статистического анализа. Однако этот вариант в макросе, упомянутых в этой рукописи требует фиксированной позиции XYZ, посредством которых теряется возможность исправить для Z-дрейф. Z-измерение сканирования могут быть включены в этот макрос и использует плоскость фокуса для анализа. Однако это требует дополнительной проверки, увеличивая возможность Фототоксичность и отбеливания.
Как с всеми флуоресцентные измерениями, передержка является проблемой, особенно при сравнении двух соединений с различных клеточных поглощения. Интенсивности флуоресценции зависит не только на внутреннюю сигнал соединения, но и на скорость поглощения, концентрация и время воздействия наркотиков. Как показано на рисунке 3, ядерной DXR содержание dox лечение клеток уже видны, тогда сигнал не видна в клетках Dox-NP-лечение. Только путем увеличения выгоды можно DXR Dox-NP-лечение клеток изобразить, ведущих к передержки в клетках dox лечение. Кроме того, даже внутриклеточно Dox-NP гетерогенно распространяется, что может привести к неизбежной под- или передержки. Особенно при расследовании сотовой DXR захвата, прибыль была значительно сократить различать отдельные органеллы (цифры 5B и 5 C). Таким образом измерения, представленное плотность пикселей должны сопровождаться представитель изображений для правильной интерпретации результатов.
Фототоксичность, отбеливания и низкое соотношение сигнал шум также важные вопросы в флуоресцентной микроскопии, и компромисс между качеством изображения и захвата изображений должны быть установлены. Однако даже когда Микроскоп Настройка является оптимальной, качество изображения также в значительной степени определяется качеством ячеек и дополнительного комплекса. DXR дает сильный сигнал и, с соблюдением надлежащих мер предосторожности, отбеливание не наблюдалось, даже после длительного периода (до 72 ч). Однако сокращение флуоресцентного сигнала может также быть результатом измеряем. Измеряем является важным явлением наркотиков сопротивления15 и происходит, когда клетки выкачивать препарат от внутриклеточного сайта действий. Поэтому снижение флуоресцентного сигнала со временем может также быть результатом dox измеряем9. Сравнивая флуоресцентного сигнала без проверки нахождения в конце эксперимента с последнего образа из покадровой серии продемонстрируют отбеливания (то есть, сигнал будет выше в месте, не проверенных) или измеряем (то есть, оба сигналы будут идентичны). В программах, как ImageJ16доступны несколько вариантов исправительных учреждений (например, фон, дрейф, отбеливания и т.д.). Кроме того с увеличением интенсивности флуоресценции со временем, параметры конфигурации могут быть предварительно оцененные в эксперимент, чтобы свести к минимуму чрезмерного в конце промежуток времени (шаг 3.21). Кроме того тепловизионные камеры с клетками уже воздействию препарата за желаемый период времени может использоваться для инициализации параметров. Наконец для этого типа анализа, концентрации токсичных наркотиков (шаг 3.22) следует избегать и предварительно создан с помощью обычных био анализы.
Непрерывно клетки культивировали и поддерживается в среде без фенола красного. Фенол красный флуоресцирует в красной части спектра и может наблюдаться в клеточных органелл, скорее лизосомы, представления ложных сведений (шаг 1.2). Чтобы обеспечить мониторинг отдельных клеток, клеток слияния не должна превышать 70% (шаг 3.1.). CO2 -скорость потока (шаг 3.5) должна регулироваться в эксперименте проверки при покупке оборудования или после ремонта. Если скорость слишком высока, средний будет испаряться. Когда скорость слишком низка, рН среды будет увеличиваться, что может повлиять на рост клеток. Как носитель без фенола Красного рН показатель изменения рН не может наблюдаться и поэтому легко забывают. После проверки CO2 потока, эти параметры могут использоваться в всех будущих экспериментах.
Используя метод, описанный здесь, судьба наночастиц легко могут быть исследованы с помощью клеток и time-lapse микроскопии. В этой процедуре были использованы коммерчески доступных наночастиц. Однако судьба термочувствительных17, Катионный липосомы10; липосомы, обогащенный с короткой цепью shingolipids18; и наночастиц инкапсуляции других препаратов,8,19 также были исследованы таким образом в опухолевых и нормальных клеток.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Микроскопия объектов, используемых являются частью центра Эразма оптических изображений, и мы хотели бы поблагодарить сотрудников ОИК за их услуги.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
