마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Summary

이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다.

Introduction

효모 신진 것은 노화 연구에서 강력한 모델 생물이다. 그러나 효모에서 기존의 수명 분석뿐만 아니라 노동 집약적뿐만 아니라 낮은 처리량 ^{1, 2} 인 미세 절제에 의존한다. 그들은 나이 또한, 기존의 미세 절제 방식은 하나의 어머니 세포에서 다양한 세포 및 분자 기능의 상세보기를 제공하지 않습니다. 미세 유체 장치의 개발은 효모 수명을 측정 할뿐만 아니라, 마더 셀 ^{3, 4, 5, 6, 7, 8의} 수명에 걸쳐 분자 마커 및 다양한 세포 표현형을 수행하는 자동화 된 방법을 사용할 수있다. 효모 세포는 미세 유동 장치에로드 된 후, 이들은 자동 시간 바퀴를 사용하여 현미경으로 추적 될 수있다전자 영상. 프로세싱 툴을 묘화의 도움으로, 다양한 세포 및 분자 ^{표현형은 3} 추출 할 수있다 ^(6)하여 얻는 것이 곤란 또는 불가능 이는 많은 등 수명, 크기, 형광 리포터 세포 형태학, 세포주기 역학 포함 ⁸ 기존의 미세 절제 방법. 미세 유체 장치는 몇 년 전 ^{3, 4, 6, 7} 성공적인 개발 이후 효모 노화 연구에 명성을 얻고있다. 몇몇 그룹은 이후에 이전 디자인 ^(5)의 변동에 게시 한 많은 효모 연구소는 연구를 위해 마이크로 유체 장치를 채택했다.

기하 급수적 인 성장을받은 세포 배양에서 관찰에 사용할 수있는 세 어머니 세포의 수는 miniscu입니다르. 따라서, 수명 측정을위한 마이크로 유체 장치의 일반적인 디자인 원칙은 어머니 세포를 유지하고 딸 세포를 제거하는 것입니다. 하나는 이러한 디자인은 효모는 비대칭 세포 분열을 겪는다는 사실을 사용한다. 다음은 장치 의지 트랩 큰 어머니 세포의 구조와 허용 작은 딸 세포가 씻겨합니다. 이 문서에서 설명하는 미세 유체 칩은 트랩 모 세포 연질 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 패드 (매달린 수직 열) (도 1)를 사용한다. 비슷한 디자인의 장치는 이전에 ^{3, 4, 6, 7보고되었다.} 이 프로토콜은 마이크로 유체 장치 및 저속 촬상 실험 최적화되어 직접적인 셀 로딩 방법을 제조하는 간단한 방법을 사용한다. 미세 유동 장치의 주요 매개 변수의 하나는 트랩 모 세포에 사용되는 PDMS 패드의 폭이다. 우리의 Device는 수명 전반에 걸쳐 추적 할 수 있습니다 신선한 어머니 세포의 상당 부분을 포함하여 각 패드에서 더 어머니 세포를 유지할 수 있습니다 넓은 패드를 사용합니다. 세포는 여러 세대하거나 전체 수명에 걸쳐 관찰이 필요 대해 추적 될 필요가있을 때 수명 측정에 더하여,이 프로토콜은 단일 세포 타임 랩스 영상 실험에 유용하다.

Protocol

1. 실리콘 웨이퍼 금형 제작

참고 : 포토 마스크 AutoCAD 소프트웨어 설계 및 상업 회사에 의해 제조된다. 이 디자인은 다른 패턴 (세 층을 포함 보충 파일 1 ). 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 층의 높이가 각각 약 4 ㎛의 10㎛, 및 50㎛의이다. 실리콘 웨이퍼 몰드 소프트 리소그래피 ^{9, 10을} 이용하여 포토 마스크에서 만들어졌다.

1. 10 분 수증기를 증발시켜 200 ℃에서 실리콘 웨이퍼를 구워. 스핀 코팅 네가티브 포토 레지스트 SU-8을 실리콘 웨이퍼 상.
   참고 : 스핀 코트 SU-8 3005 (30)의 첫 번째 레이어를 생성하기 위해 5,000 rpm에서, SU-8 2010 년 3,000 rpm에서 30 초는 두 번째 레이어를 생성하기 위해, 그리고 SU-8 3025 2000 rpm에서 30 초는을 생성하는 셋째 층.
2. t 전에 코팅 된 웨이퍼를 소프트 베이크패턴 전사를 그. 정렬하고, 마스크 얼 라이너를 사용하는 "직접 접촉"모드에서 웨이퍼를 노출.
   주 : 소프트 베이크 제 층 95 ℃에서 2 분, 두 번째 층의 95 ° C에서 3 분간, 및 제 3 층, 95 ° C에서 15 분간 웨이퍼. 하여 100mJ / 제 ² 층 cm, 130 mJ의 / 제 ² 층 cm, 200 mJ의 / 제 3 층에 대한 cm ^2의 노광량을 사용한다.
3. 노출 후, 웨이퍼를 후 구워 SU-8 개발을 사용하여 개발한다. 는 N 총 ₂ 하드 베이크 30 분 동안 200 ℃에서 웨이퍼를 이용하여 웨이퍼를 건조.
   주 : 실리콘 웨이퍼가 몰드 패턴면이 위로 향하게하여, 스카치 테이프를 이용하여 15cm 직경의 플라스틱 페트리 접시에 고정된다. 일반적으로, 우리는 다수의 미세 유체 칩은 동시에 제조 될 수있는 동일한 금형 여러 동일한 칩 구조물을 넣어. 각 주형은 미세 유체 칩을 제조하기 위해 여러 번 재사용 될 수있다.

2. 미세 유체칩 제조

1. 균형에 깨끗한 무게 보트를 놓고 균형을 용기를. 체중 배에 PDMS 기반의 50g을 부어.
2. 체중 보트 PDMS 경화제 5 g을 넣고 (w /를 PDMS 기재 1:10의 비율 w).
   주 :이 양 몰드와 15cm 직경의 배양 접시에 기초한다. 다른 크기의 페트리 접시를 사용하는 경우, 시약의 양을 조정한다.
3. PDMS의 기재하고 일회용 피펫 경화제 교반한다. 계량 보트의 가장자리에서 시작하고 서서히 안쪽으로 이동합니다. 작은 기포가 혼합물에 걸쳐 형성 할 때까지 몇 분 동안 철저하게 저어; 철저하게 혼합 PDMS 중합 필수적이다.
4. 천천히 페트리 접시에 붓고, 혼합물; 혼합물을 완전히 실리콘 웨이퍼 금형을 포함한다.
5. 10 분은 PDMS 혼합물로부터 모든 공기 방울을 제거하기 위해 진공 페트리 접시를 배치했다. 기포가 혼합물의 표면에 남아 있으면, 그들을 밖으로 날려 피펫을 사용합니다.
6. 실리콘을 품어약 2 시간 동안 75 ° C의 오븐에서 PDMS 몰드와 웨이퍼.
7. 부드럽게 웨이퍼 금형의 구조에 손상을 피하고, 실리콘 웨이퍼 금형 오프 중합 PDMS 층을 박리. 대안 적으로, 단일 에지 산업 면도날을 사용하여, 패턴의 주위에 최소 5 mm 마진으로 실리콘 웨이퍼를 금형에서 직접 PDMS 컷; 부드럽게 웨이퍼 몰드 오프 PDMS 층을 박리.
8. 패턴면이 위로 향하게하여 작업대에 PDMS 층을 놓는다. 조심 구조 손상을 피하기 위해 각각의 단일 칩의 에지에서 충분한 마진을 유지하는, 단일 에지 산업 면도날 개별 칩을 잘라.
9. 위로 향하는 패턴면, 각각의 채널 측에 곧장 입구 및 출구를 통해 원형 펀치 구멍 펀치 펜 (0.75 mm ID)를 사용한다.
   참고 :이 구멍이 매체의 흐름에 대한 경로를 만듭니다. 따라서, 원을 통과하고, PDMS 층을 통해 모든 방법을 펀치 중요하다. 에 있는지 확인구멍에서 PDMS 열을 제거합니다.
10. 구멍에 다시 펀치 펜 바늘을 삽입하여 모든 펀치 구멍을 확인하십시오. 바늘이 막힘이 없음을 나타내는 다른 측면에서 나올 수 있는지 확인합니다. 패턴 표면에 테이프를 적용 부드럽게 먼지를 청소 테이프를 벗겨. 이 단계에서 적어도 세 번 반복합니다. 살균을 유지하기 위해 PDMS에 스카치 테이프의 깨끗한 조각을 남겨주세요.
11. PDMS의 반대편에서이 절차를 반복뿐만 아니라 테이프의 마지막 조각을 둡니다.
12. 0.13-0.17 mm의 두께, 24 mm X 30mm의 커버 유리를 준비한다. 표면 소독, 먼지 제거하여 유리에 70 % 에탄올을 분무 건조; 또한, 멸균 된 유리를 물로 세정하고, 먼지 제거 장치에 의해 건조 될 수있다.
13. 플라스틱 판에 커버 글라스와 PDMS로 이동. PDMS의에서 스카치 테이프를 제거하고 위를 향하도록 패턴면을 넣습니다. 전송 중에 패턴 표면과의 접촉을 피하십시오.
14. 조심스럽게 모두 친수성 표면 (플라즈마 처리 중에 직면하는면)을 연결하는 커버 유리 위에 PDMS를 배치했다. PDMS의 커버 유리 사이에 기포가 없는지 확인합니다.
15. 적어도 2 시간 동안 75 ° C의 오븐에서 PDMS 칩 인큐베이션.
    참고 : 불충분 한 미세 유체 실험시 현미경에 액체 누출의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 약간 핀셋 가장자리에서 PDMS를 올려 PDMS와 커버 글라스 사이의 결합을 확인하는 것이 중요하다. 부드럽게 성공적인 결합을 나타내는 커버 유리에서 분리되지 않아야 PDMS 리프팅.

3. 실험 준비

1. 70 % 에탄올 용액을 별도로 PDMS 칩 제조 전에 1 일 입출력 튜브 담근다.
2. 튜브를 세척 멸균 물 5 mL를 주사기를 채우기. 주사기에 튜브를 연결하고 물에 튜브를 세척하여 각 튜브를 씻으십시오.
3. 에탄올 잔기 청소 세정 공정을 3 회 이상 반복한다.

반드시 구조가 일관되고 그대로 만들기 위해 10X 목표와 광학 현미경으로 PDMS 채널을 검사합니다. 스카치 테이프를 사용하여 현미경 플랫폼 상에 PDMS 칩을 안정.
참고 : 장치를 처음 만드는 특히, 백업 칩이 있다는 것을 확인하기 위해 2 단계에서 한 번에 여러 개의 칩을합니다.

멸균 물을 5 ML의 주사기를 채우십시오. 주사기 펌프와 주사기를 고정하고, 해당 입력 및 출력 튜브를 삽입한다. 약 10 분 동안 칩을 씻어 750 μL / h의 세정 속도를 설정한다. 분기 채널의 기포이 기간 중에 씻겨한다; 남아있는 거품이있는 경우, 수동으로 거품을 제거하기 위해 속도를 조정합니다.

효모 샘플 준비.

1. 3,000 × g으로 5 분간 두 1.5mL 용량의 마이크로 원심 튜브에 용액 제조 효모 샘플 (OD ₆₀₀ 0.6-0.8)의 양도 1 원심 분리기.
2. 각 튜브에서 뜨는의 대부분을 제거하고 0.5 mL의 샘플을 형성하기 위해 나머지를 결합합니다.

주사기 펌프를 일시 중지하고 PDMS 칩으로부터 입력 튜브를 제거한다.

수동 각 입력 튜브 (길이 1~2 cm)의 작은 기포를 흡입하도록 주사기 펌프를 역방향. 효모 샘플에서 빨아로 이동합니다; 기포는 샘플 경계를 표시하고 그려 얼마나 많은 샘플을 나타냅니다.
참고 : 주사기에 샘플을 흡입하지 마십시오.

다시 PDMS 칩에 입력 튜브를 삽입하고 750 μL / h의 속도로 셀로드를 다시 펌프.

10 분 동안 펌프 주사기를 남겨n 및하면 현미경으로 세포 로딩 진행을 검토; 기둥을 중지의 60 % 이상에서 성공적으로 로딩 것이다 트랩 세포.

영양 용액으로 전환 세포 배양 400 μL / h의 속도를 조절한다.

현미경 선택 관측 위치.
주 : 수명 측정의 경우, 이미지는 40X 대물 광학 현미경에 의해 15 분마다 한번 촬영 하였다. 형광 리포터 분석을 위해, 이미지는 60X 대물 오일과 형광 현미경에 의해 15 분마다 한번 촬영 하였다.

Representative Results

실험 후, 균체 많은 세포와 분자 표현형의 수명은 녹화 시간 경과 화상으로부터 추출 할 수있다. 각 셀로부터 추출 될 수있는 다른 다양한 기능이 있기 때문에, 분석의 제 1 단계는, 위치 및 셀 경계 추적되고 각종 이벤트의 타이밍을 포함하는 세포 및 이벤트를 주석 등이다 신진 이벤트와 같은. 이러한 주석은 쉽게 미래에 다양한 기능을 세포의 동일한 세트로 복귀하고 분석 할 수 있도록합니다. 이러한 ImageJ에 ⁽¹¹⁾ 및 연관된 플러그인으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 표현형의리스트는 셀의 기록 통계를 이용하여 이미지 데이터로부터 추출 될 수있다.

상기 미세 유체 소자로 측정 표현형의 몇몇 예이다. 효모의 수명 표현형각각의 포획 된 모세포에 의해 생성 된 싹의 수를 카운트하고 카플란 - 마이어 추정기로 추정하여 얻을 수있다. 처음에 마이크로 유체 장치에 갇혀 세포는 알 수없는 나이의이다. 이 알 수없는 연령에서 발생하는 수명 측정의 편견을 최소화하기 위해 이전 방법은 수명이 ^{4, 7을} 교정하기 위해 포획 된 세포에 꽃 봉오리 흉터의 평균 수를 사용했다. 그러나, 뇌 상처 측정 셀의 추가 염색을 필요로하고, 바이어스의 간접 추정을 제공한다. 이 프로토콜을 사용하여 장치는 자주 이미 갇혀 세포에서 떨어져 싹 신선한 딸 세포 트랩. 이 세포는 어머니 세포로 설정합니다. 이러한 세포는 우리의 다운 스트림 이미지 분석 소프트웨어 (동영상 1)를 사용하여 식별 할 수 있습니다. 이 신선한 어머니 세포는보다 정확한 수명 측정을 제공합니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 신선한 모 세포의 수명 곡선 안돼요을 있었다알 수없는 시대의 세포들 빨간색. 이 실험에서, 신선한 어머니 세포의 평균 수명 (평균 수명의 차이의 2 세대) 약간 이상했다.

싹이도 3에 도시 된 바와 같은 두 개의 연속 신진 이벤트 사이의 시간 간격과 같은 다른 흥미로운 표현형의 수뿐만 아니라, 영상 데이터 ^{(3), (7), (8)로부터} 추출 될 수있다. 세포는 느린 몇 초기 buddings 다음 빠른 신진의 기간에 들어갔다. 신진는이 세 세포의 건강하지 못한 상태를 나타내는 그들의 수명의 끝으로 크게 둔화. 세포주기 역학은 젊은이와 노인 세포의 세포 상태에 대한 매우 유용한 정보를 포함하고 텔로 머라 돌연변이 체 ^{(12)의 특성을,} 예를 들어, 사용되어왔다. 중요한 것은,이 장치 될 수있다노화 과정의 드라이버 일 수있다 분자 마커의 추적을 허용 수명 (도 4)에 걸쳐 형광 신호를 측정하는데 사용된다.

도 1 : 미세 유동 장치의 설계의 개략도. 이 장치는 병렬로 동작 할 수있는 독립적 인 기능 모듈 (6)로 구성된다. 각 모듈은 양측 채널에 접속 한 메인 유로로 이루어진다. 양쪽 채널은 113 개 매달린 칼럼을 갖는다. 추가적인 다리 양측 채널이 주 채널을 연결하는 중간에 추가된다. 작은 딸 세포가 떨어져 흐름에 의해 세척하는 동안 어머니 세포는 매달린 열 아래에 갇혀있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 신선한 어머니 세포가 알 수없는 역사를 가진 세포보다 더 오래 산다. 알 수없는 역사의 세포에 비해 신선한 어머니 세포의 복제 성 수명은 SD 미디어, 30 개도에서 (세포 실험의 시작부터 갇혀). 평균적으로, 신선한 어머니 세포는 약 2 세대 이상 살고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 세 세포로 간격 변화를 신진의 길이입니다. buddings 사이의 시간 프레임으로 측정 신진 간격을 색상으로 구분, 세포들은 복제 수명에 의해 명령을 받았다되었고, 신선한 어머니 세포 9월했다알 수없는 역사의 세포에서 arated. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4 : 마이크로 유체 장치를 이용하여 열 충격 인자 1 (HSF1)의 활성을 측정. Hsf1 활동 리포터는 HSE 상류 ¹³ 절름발이 CYC1 프로모터에 융합 된 녹색 형광 단백질 (GFP)에 의해 구성된다. 형광 이미지는 매 30 분을 촬영했다. GFP 강도는이었다 맞춤 MATLAB 코드 ^14를 사용하여 정량. 각각의 단일 셀에 대한 데이터 포인트는 연결 색깔의 선으로 표시됩니다. 이 실험에서, 상기 균주는 밤새 30 ° C에서 2 % 글루코스 (중량 / 부피)로 SD 배지에서 성장시키고; 그 다음 복구 같은 배지로 희석 하였다. 기후,글루코스 0.05 % (중량 / 부피)로 SD 매체 형광 측정 동안 미세 유체 칩에서 세포를 성장 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1 : 신선한 어머니 세포의 예는 전체 수명에 대한 장치 내에 갇혀. 영화는 포획 된 세포에서 태어난 신선한 어머니 셀을 보여줍니다. 영화의 시작 부분에 빨간색 화살표는 신선한 어머니 셀과 최초의 신진의 위치를 ​​표시합니다. 이 어머니 셀의 전체 수명에 대한 미세 유체 장치에 갇혀 있었다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

Discussion

PDMS의 장치는 갓해야합니다. 그렇지 않으면, 장치에 관을 삽입함으로써 발생되는 기포를 제거하는 것이 어려울 것이다. 단계 3.4 세포를 집중하여 셀 로딩 효율을 개선하는 것이 중요하다. 실험의 처리량을 증가시키기 위해 동일한 PDMS 칩 4~6 모듈을 독립적으로 작동하는 펌프는 전형적으로 동시에 4~6 다른 실험 (상이한 균주 또는 미디어 조성물)을 수행하는 데 사용하기 위해 연결된다.

(미세 절제를 사용하여) 종래 효모 복제 성 노화 시험에 비해, 여기에서 제시된 방법은 마이크로 유체 이하 힘들고 시간 소모적이다. 또한, 상기 미세 유동 장치는 세포 크기, 세포주기 역학, 세포 형태, 다양한 분자량 마커를 포함하는 다양한 셀룰러 또는 분자 파라미터의 상세한 정량을 허용한다. 이 마이크로 유체 방법은 유지하여 고해상도 현미경으로 추적 장기 세포를 달성딸 세포로 PDMS 마이크로 패드에서 어머니 세포는 자동으로 플러시됩니다.

이 장치는 HUBERTS 동부 알 유사한 기본 구조로, 트랩 머더 셀 ⁽⁴⁾ PDMS 마이크로 소프트 패드를 사용한다. 그의 작품 ⁷ 설명했다. 장치 설계 및 실험 프로토콜의 차이가 있습니다. 이 장치에서는 넓은 PDMS 패드 일부 신생아 딸 세포를 포획하고 (도 2 및 3, 영화 1)를 분석 할 수있다. 이러한 세포를 확인하기 위해, 우리는 신진없이 플러쉬 딸 세포를 무시하고 이미 갇혀 어머니 세포에서 싹 딸 세포를, 주석. 평균적으로, 우리는 PDMS 패드 당 약 2 신선한 어머니 세포를 얻었다. 2, 약 1/3가 전체 수명의 장치에 보존 된 중에서 불명 역사 세포 조금만 모 세포의 비는 약 1이었다. 이 세포들은보다 정확한 수명 측정을 허용D이 가능 어머니와 딸 세포 사이의 상관 관계를 분석 할 수 있습니다. 이 장치에서, 깊은 메인 채널 관측이 이루어지는 두 얕은 측면 채널에 접속되고; 이 디자인은 큰 기포에 의해 차단되는 측면 채널의 가능성을 줄일 수 있습니다. 미세 유체 칩의 제조를위한,이 프로토콜은 단지 성공률을 증가 혈장 노출과 베이킹 오븐을 이용하여 PDMS와 커버 유리를 결합하는 간단한 방법을 사용한다.

이 프로토콜로, 마이크로 유체 장치는 야생 형 반수체 효모 균주 (예 : BY4741 또는 BY4742)에 대한 실험의 시작 부분에 견고하게 트랩 PDMS 패드 당 적어도 하나의 셀 (평균 3 ~ 5 세포)를 할 수 있습니다. 세포의 약 30 %가 자신의 전체 수명에 걸쳐 유지 될 수있다. 그것은 PDMS 장치의 성능이 매달린 열 및 유리와 효모 세포의 크기 사이의 간격의 크기에 의존한다는 것을 주목할 필요가있다. 야생 형 반수체 효모 균주를 들어,갭 적합한 크기는 3.5~4.5 ㎛의 것이다. 이 범위를 크게 로딩 효율성과 세포 유지율 하락 외부. 따라서, 더 큰 또는 더 작은 셀 크기 ⁷ 효모 새로운 장치는 1 단계에서 제조 된 제 1 층의 높이를 변경하여 제조되어야한다.

요약하면,이 문서에서 설명하는 장치와 프로토콜은하지 효모 노화 연구에만 적합뿐만 아니라 어머니 세포의 추적 및 여러 세대 또는 수명 전반에 걸쳐 분자 마커의 모니터링을 필요로하는 다른 실험에 적용 할 수있다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B