使用微流体装置来衡量寿命和细胞表型单芽殖酵母细胞

Summary

本文介绍用于生产微流体芯片和微流体实验的设置来测量的寿命和单个酵母细胞的细胞表型进行了优化的协议。

Introduction

芽殖酵母是衰老研究了强大的模式生物。然而，在酵母的常规寿命测定依赖于显微切割，这不仅是劳动密集，而且低吞吐量^1,2。此外，他们的年龄在传统的显微方法不提供在单一母细胞的各种细胞和分子特征的详细视图。微流体装置的发展已使自动程序以测量酵母寿命以及跟随的分子标记和各种细胞表型在整个母细胞^{3，4，5，6，7，8}的寿命。后的酵母细胞被加载到微流控装置，它们可以在显微镜下使用自动时间圈跟踪È成像。随着成像处理工具的帮助下，各种细胞和分子的表型可以被提取^3，6，8，包括寿命，大小，荧光报道，细胞形态，细胞周期动力学， 等 ，其中许多是难以或不可能获得使用传统的显微解剖法。因为他们的成功发展了几年前^{3，4，6，7}的微流体装置已经获得了在酵母衰老研究突出。一些研究小组已经随后发表在早期的设计⁵的变化，许多酵母实验室已经采用微流体装置作为研究对象。

在细胞培养进行指数增长，可用于观测岁母细胞的数量是miniscu乐。因此，微流体装置的寿命测量一般设计原则是保留母细胞，并删除子细胞。一个这样的设计使得使用酵母进行不对称细胞分裂的事实。在该装置将捕获更大母细胞的结构和更小的允许子细胞被冲走。这篇文章中描述的微流体芯片采用了软聚二甲基硅氧烷（PDMS）垫（垂直悬挂列）以捕获母细胞（ 图1）。类似的设计的设备先前已被^3,4，6,7的报道。该协议使用一个简单的程序来制造微流体装置和被用于延时成像实验优化的直接的细胞装载方法。一个在微流体装置的关键参数是用于捕获母细胞的PDMS焊盘的宽度。我们ðevice使用更宽垫，可以让更多的母细胞各垫下，包括可以在整个他们的寿命进行跟踪新鲜母细胞的显著部分。除了寿命测量，当细胞需要跟踪许多代或当在整个寿命的观察是必要这个协议是用于单细胞延时成像实验是有用的。

Protocol

1.硅片模具制造

注：光掩膜的设计与AutoCAD软件和商业公司制造的。这种设计包含不同的图案（三层补充文件1 ）。第一，第二，和第三层的高度分别为大约4微米，10微米和50微米。硅晶片模具从使用软光刻^9,10光掩模创建。

1. 在200℃下烘烤的硅晶片10分钟，以蒸发水蒸汽。旋涂负性光刻胶SU-8到硅晶片上。
   注意：旋涂SU-8 3005在5,000rpm下30秒，以产生第一层，SU-8 2010以3,000rpm进行30秒，以产生第二层，和SU-8 3025以2000rpm进行30秒，以产生第三层。
2. 软烤吨处理前的涂布晶片他的图案转移。对准，并且使用掩模对准器在暴露“直接接触”模式的晶片。
   注：软烘烤的晶片在95℃下2分钟，所述第一层，在95℃下3分钟为第二层，和在95℃下15分钟的第三层。在100mJ / cm ²的第一层，130毫焦耳/厘米²的第二层，和为200mJ / cm ²的第三层使用的曝光剂量。
3. 曝光后，后烘烤的晶圆，并使用SU-8开发者开发。干燥使用N ₂枪和硬烘烤在200℃下将晶片30分钟的晶片。
   注：将硅晶片模具是用透明胶带固定到15厘米直径的塑料培养皿中，与图案的一面朝上。一般，我们把在相同的模具，它允许多个微流体芯片来同时制造多个相同的芯片结构。每个模具可以重新使用多次以制造微流控芯片。

2.微流控芯片制造

1. 放在天平上的清洁称重船和去皮。倾50克PDMS碱入称量皿。
2. 5克PDMS固化剂添加到所述称量皿（w / w至所述PDMS基的1:10的比例）。
   注意：此卷是基于一个直径为15cm，培养皿与模具。如果使用不同大小的培养皿中调整试剂的量。
3. 搅拌PDMS基并用一次性移液管的固化剂。从称量船的边缘开始慢慢地向内移动。充分搅拌几分钟直至小气泡形成在整个混合物中;彻底混合对于PDMS聚合是必不可少的。
4. 把混合物慢慢倒入培养皿;该混合物必须完全覆盖硅晶片模具。
5. 放置在真空中的陪替氏培养皿10分钟，以除去从PDMS混合物中的所有气泡。如果气泡保留在混合物的表面上，用移液管吹出来。
6. 孵育硅晶片与模具在75℃的烘箱中用于PDMS约2小时。
7. 轻轻剥离聚合PDMS断硅晶片模具的层，避免对晶片模具的结构的任何损坏。可替换地，直接地从硅晶片与模具周围使用单边缘工业刀片图案的最小5毫米余量切割PDMS;轻轻剥离PDMS层从晶片模具。
8. 放置PDMS层与图案面朝上的替补​​。仔细地切出具有单边缘工业刀片的单独的芯片，保持从每个单芯片，以避免损害结构的边缘足够的裕度。
9. 朝上的图案的一面，使用冲头笔（0.75毫米ID），以打孔通过入口和出口圆直倒在通道的每一侧。
   注意：这些孔创建介质流动的通路。因此，关键是要经过圈，并通过PDMS层冲一路。确保从孔去除PDMS列。
10. 通过再次插入冲笔针头插入孔检查每一个冲孔。确保针头可以从另一面出来，这表明没有堵塞。将胶带粘图案表面，然后轻轻剥离胶带清洁灰尘颗粒。重复此步骤至少三次。留在PDMS一块干净透明胶带，以保持消毒。
11. 重复对PDMS的相对侧此过程并离开最后一块胶带上为好。
12. 制备一个24毫米×30毫米玻璃盖的厚度为0.13-0.17毫米。喷洒70％的乙醇在玻璃上并干燥与除尘器消毒的表面上;另外，该玻璃可以与高压灭菌水洗涤，并用除尘器干燥。
13. 转移盖玻璃和PDMS的塑料板。从PDMS取下胶带并放置图案的一面朝上。避免在传送过程中与图案表面的任何接触。
14. 小心地将PDMS到盖玻璃，连接两个亲水表面（即在等离子体处理期间朝上的表面）。确保有是PDMS和玻璃盖之间没有气泡。
15. 孵育在烘箱中在PDMS芯片在75℃下至少2小时。
    注意：微流体缺陷可能会导致液体渗漏到在实验过程中的显微镜。因此，通过从与镊子的边缘略微抬起PDMS检查PDMS和盖玻璃之间的结合是重要的。轻轻提起PDMS不应它从玻璃盖分开，指示成功的键。

3.实验准备

1. 淹没在70％乙醇溶液分别PDMS芯片制备前1天的输入和输出管。
2. 填充有5毫升的注射器用高压灭菌水清洗管。通过插入注射器上的管，并用水冲洗管洗每个管中。
3. 重复该洗涤步骤至少3次以清洁乙醇残留物。

检查用10X物镜在光学显微镜下的PDMS通道，以确保该结构是一致的和完整的。稳定PDMS芯片上使用透明胶带的显微镜平台。
注：在步骤2中的时间使多个芯片，以确保有备份芯片，特别是如果使设备首次。

填充有5毫升的注射器用高压灭菌水。固定注射器的注射泵，并插入相应的输入和输出管。设置洗涤速度至750μL/ h至冲洗芯片约10分钟。在分支通道中的气泡应该在此期间被洗掉;如果有剩余的气泡，手动调整速度以消除气泡。

酵母样品制备。

1. 传输1制备的酵母样品（OD ₆₀₀ 0.6-0.8）中的溶液到两个1.5毫升微量离心管中离心5分钟，在3000×g下。
2. 除去大部分从每管中的上清液并结合其余以形成0.5毫升的样品。

暂停注射泵和从PDMS芯片删除输入管。

手动反向注射泵吸小气泡（1至2cm长）到每个输入管。移动对酵母​​样品中吸;气泡将显示样品边界，并指出有多少样本已经绘就。
注意：避免将试料吸入到注射器中。

插入输入管放回PDMS芯片，并重新启动泵以750μL/ h的速度加载细胞。

离开注射器泵上10分钟的n和检查显微镜下细胞加载进展;一个成功加载将捕获细胞下暂停支柱的60％以上。

切换到营养溶液和调整速度以用于细胞培养400微升/小时。

在显微镜观察选择位置。
注：对于寿命测量，图像通过光学显微镜拍摄一次，每15分钟用40×物镜。对于荧光报告分析，图像通过用60X油浸物镜的荧光显微镜拍摄每15分钟一次。

Representative Results

实验后，将细胞和许多细胞和分子表型的寿命可以从所记录的时间推移的图像被提取。由于有许多可从每个细胞中提取不同的特征，分析的第一步是将注释细胞和事件，包括位置和小区的边界和正被跟踪的各种事件的定时，例如作为萌芽事件。这些注释将使它更容易返回到相同的一组细胞并分析不同的特点，在未来。使用图像分析软件，如ImageJ的¹¹和相关联的插件，表型的列表然后可以从使用的小区的记录注解的图像数据中提取。

以下是与微流体装置测量的表型的几个例子。酵母的寿命表型可通过计算由每个捕获母细胞中产生芽的数量和与所述的Kaplan-Meier估计器估计来获得。最初被困在微流体装置的细胞是未知的青睐。为了最小化从这些未知年龄始发寿命测量值的偏差，以前的方法使用在捕获的细胞芽疤痕的平均数目来校准寿命^4,7。然而，芽痕测量需要细胞的额外染色，并提供了偏置的间接估计。使用该协议，设备经常陷阱从已捕获的细胞芽关闭新鲜的子细胞。然后，这些细胞变成母细胞。这种细胞可以使用我们的下游图像分析软件（ 电影1）来识别。这些新鲜母细胞提供更精确的测量寿命。 如图2所示，新鲜母细胞的寿命曲线是COMPA红色与年龄不详的细胞。在这个实验中，新鲜母细胞的平均寿命稍长（约2代差的中位寿命）。

除了芽，其他有趣的表型，如在两个连续事件出芽之间的时间间隔，如在图3中示出的数目，可以从成像数据^3，7，8中提取。单元格中输入以下几个较慢的初始芽接一段较快的萌芽。含苞待放的放缓极大地朝其寿命结束，表明这些老化细胞的非正常状态。细胞周期动力学包含有关老少细胞的细胞状态非常有用的信息，并已使用，例如，表征端粒酶突变体^12。重要的是，该设备可以是用于测量荧光信号在整个寿命（ 图4），允许的分子标记，其可以是老化过程的驱动器的跟踪。

图1： 在微流体装置的设计的示意图。该装置由可以并行操作6个独立的功能模块。每个模块由连接到两个侧信道的一个主通道。每个侧通道具有113个悬挂列。一个额外的桥在中间加入到连接与两个侧通道的主通道。母细胞被捕获在悬挂柱的下方，而较小的子细胞被冲走流。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2： 新鲜母细胞的寿命比未知的历史较长的细胞。新鲜母细胞与未知的历史细胞的复制寿命（电池被困在实验开始时）在SD培养基中，30度。平均而言，新鲜母细胞活约2代更长的时间。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3： 出芽间隔变化老化电池的长度。作为芽接之间的时间帧测量出芽的间隔颜色编码，将细胞通过它们的复制寿命排序，并且新鲜母细胞九月来自未知历史的细胞相分离。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4： 使用微流体装置测量热激因子1（HSF1）的活性。的HSF1活性报告基因是通过融合到一个残缺CYC1启动子与HSE上游¹³绿色荧光蛋白（GFP）构成。荧光图像每隔30分钟。 GFP强度然后使用定制的MATLAB代码¹⁴定量。对于每个单细胞数据点连接起来，并用彩色线表示。在该实验中，将菌株在30℃下生长在SD培养基中含有2％葡萄糖（重量/体积）过夜;然后将其用为恢复相同的培养基中稀释。之后，用0.05％葡萄糖（重量/体积）的SD培养基中使用的荧光测量期间生长细胞在微流体芯片中。 请点击此处查看该图的放大版本。

电影1： 新鲜母细胞的一个例子被截留在装置内对整个寿命。影片显示了一个被困的细胞诞生一个新的母细胞。在电影开头的红色箭头标志的新鲜母细胞和它的第一个萌芽的位置。该母细胞被困在其整个生命周期的微流体装置。 请点击此处观看该视频。 （右键点击下载）。

Discussion

PDMS的设备需要新鲜的。否则，引起的插入管插入装置的空气气泡将难以去除。步骤3.4是重要通过浓缩细胞提高电池装载效率。为了增加实验的吞吐量，连接到同一个PDMS芯片上4至6个模块来独立地操作泵通常用于执行4至6个不同的实验（不同菌株或介质的组合物）同时进行。

相比于常规的酵母复制型老化试验（使用显微解剖），这里提出的微流体方法不太费力和耗时的。此外，微流体装置允许各种细胞或分子参数，包括细胞大小，细胞周期动力学，细胞形态，以及各种分子标记的详细的量化。该微流控方法实现长期的细胞通过保留高分辨率显微镜追踪下PDMS微焊盘作为子细胞母细胞被自动冲洗。

该装置使用软PDMS微垫捕获母细胞^4，用的基本结构相似，如Huberts 等。在他的作品⁷中。有许多在该装置的设计和实验方案的差异。在该装置中更广泛的PDMS垫允许被捕获并分析（ 图2和3， 电影1）一些新生子细胞。为了识别这些细胞，我们从注释已经被困母细胞芽子细胞，忽略冲走没有萌芽的子代细胞。平均而言，我们得到了每PDMS垫约2新鲜母细胞。这些新鲜母细胞未知历史的细胞的比例为约1：2，其中约三分之一保持在该装置为全寿命。这些细胞允许更准确的寿命测量中的d使得可以分析母女细胞之间的相关性。在该装置中，更深的主通道连接到在观测由两种较浅侧通道;这样的设计有助于降低被拦截的大气泡的一侧通道的机会。用于微流体芯片的生产，该协议也使用简单的方法来粘结PDMS和玻璃盖片，只是利用等离子体的曝光和烘烤炉，这增加了成功率。

与此协议中，微流体装置能够鲁棒地捕集每PDMS垫的至少一个小区（3-5细胞平均）在实验开始时为野生型单倍体酵母菌株（ 即，BY4741或BY4742）。在细胞的约30％，可在其整个生命周期全被保留。值得注意的是，PDMS装置的性能取决于悬挂柱和玻璃和酵母细胞的大小之间的间隙尺寸。对于野生型单倍体酵母菌株，所述对于该间隙合适的尺寸是3.5-4.5微米。在这个范围之外时，装载效率和细胞保留率大幅下降。因此，对于具有更大或更小的小区尺寸⁷的酵母菌株新设备必须通过修改在步骤1中所做的第一层的高度来制造。

总之，本文中所描述的设备和协议不仅适用于酵母的老化研究，但也适用于需要母细胞的跟踪和分子标志物的许多代或整个寿命监视其它实验。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B