Brug mikrofluidenheder til måling Levetid og cellefænotyper i Single Spirende gærceller

Summary

Denne artikel præsenterer en protokol optimeret til produktion af mikrofluide chips og opsætningen af ​​mikrofluide eksperimenter til måling af levetid og cellulære fænotyper af enkelte gærceller.

Introduction

Spirende gær er en kraftfuld model organisme i aldring forskning. Men en konventionel levetid assay i gær bygger på mikrodissektion, som ikke kun er arbejdskrævende, men også lav gennemløb ^{1, 2.} Hertil kommer, at den traditionelle mikrodissektion fremgangsmåde ikke giver et detaljeret billede af forskellige cellulære og molekylære egenskaber i de enkelte moderceller som de bliver ældre. Udviklingen af mikrofluidenheder har muliggjort en automatiseret procedure til måling af gær levetid samt til at følge molekylære markører og forskellige cellulære fænotyper igennem hele livet af moderceller ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Efter gærceller fyldes i en mikrofluidanordning, kan de spores under et mikroskop under anvendelse af automatiske tidspunkter omgangee billeddannelse. Ved hjælp af billeddannelse værktøjer kan forskellige cellulære og molekylære fænotyper ekstraheres ^{3, 6, 8,} herunder levetid, størrelse, fluorescerende reporter, cellemorfologi, cellecyklus dynamik, etc., hvoraf mange er vanskelige eller umulige at opnå ved hjælp af den traditionelle mikrodissektion metode. Mikrofluidenheder har fået fremtrædende plads i gær aldring forskning siden deres succesfulde udvikling for et par år siden ^{3, 4, 6, 7.} Adskillige grupper har efterfølgende offentliggjort på variationer i de tidligere designs ^5, og mange gær laboratorier har ansat mikrofluidenheder for deres undersøgelse.

I en cellekultur undergår eksponentiel vækst, antallet af alderen moderceller der er tilgængelige for observation er miniscule. Derfor er den generelle udformning princip mikrofluidapparatet for levetidsspecifikationerne målinger er at fastholde modercellerne og fjerne datterceller. En sådanne design gør brug af det faktum, at gær gennemgår asymmetrisk celledeling. Strukturerne i enheden vil fælde større mor-celler og tillader mindre datterceller at blive vasket væk. Den mikro chip er beskrevet i denne artikel bruger en blød polydimethylsiloxan (PDMS) pude (vertikale Pensile søjler) til fælde mor celler (figur 1). Indretninger af lignende udformning har tidligere ^{3, 4, 6, 7} er rapporteret. Denne protokol anvender en enklere procedure til at fremstille mikrofluidenheder og en enkel celle-loading metode, der er optimeret til time-lapse billeddannelse eksperimenter. En af de vigtigste parametre i mikrofluidanordning er bredden af ​​PDMS puder bruges til at fælde modercellerne. Vores device bruger bredere puder, der kan holde flere mor celler under hver pude, herunder en signifikant fraktion af friske moderceller der kan spores hele deres levetid. Foruden levetidsspecifikationerne målinger denne protokol er nyttig til enkeltcelle time-lapse imaging eksperimenter, når cellerne skal spores i mange generationer, eller når en observation i hele levetid er nødvendig.

Protocol

1. Silicon Wafer Mold Fabrication

BEMÆRK: fotomaske er designet med AutoCAD og fremstillet af et kommercielt selskab. Dette design indeholder tre lag af forskellige mønstre ( Supplerende File 1 ). Højderne af det første, andet og tredje lag er ca. 4 um, 10 um og 50 um, hhv. Siliciumskiven Formen blev skabt af fotomasken anvendelse blød litografi ^{9, 10.}

1. Bage en siliciumskive ved 200 ° C i 10 min for at afdampe vanddamp. Spin frakke negativ fotoresist SU-8 på siliciumskiven.
   BEMÆRK: Spin coat SU-8 3005 ved 5.000 rpm i 30 s for at generere det første lag, SU-8 2010 på 3.000 rpm i 30 s for at generere det andet lag, og SU-8 3025 ved 2.000 rpm i 30 s for at generere tredje lag.
2. Soft-bage det coatede wafer før than transfer mønster. Juster og eksponere skiven i "direkte kontakt" mode anvendelse af en maske aligner.
   BEMÆRK: Soft-bage skiven i 2 minutter ved 95 ° C i det første lag, 3 min ved 95 ° C i det andet lag, og 15 minutter ved 95 ° C i det tredje lag. Brug eksponeringsdosen ved 100 mJ / ^cm2 for det første lag, 130 mJ / ^cm2 for det andet lag, og 200 mJ / ^cm2 for det tredje lag.
3. Efter eksponering, post-bage wafer og udvikle det ved hjælp SU-8 fremkalder. Tør skiven under anvendelse af en _N2-pistol og hårdt-bage waferen ved 200 ° C i 30 minutter.
   BEMÆRK: siliciumwafer støbeform er fastgjort til en 15 cm diameter plastisk petriskål under anvendelse af tape, med mønstret opad. Normalt vi sætte flere identiske chip strukturer på samme støbeform, som tillader flere mikrofluide chips, der skal fremstilles samtidigt. Hver form kan genbruges mange gange at fremstille mikrofluid chips.

2. MikrofluidChip Fabrication

1. Placer en ren vejebåd på en balance og tarere vægten. Hæld 50 g PDMS base til den vejebåd.
2. Tilsættes 5 g PDMS hærdningsmiddel til vejebåd (vægt / vægt forhold på 1:10 til PDMS base).
   BEMÆRK: Denne mængde er baseret på en 15 cm diameter petriskål med formen. Justere mængden af ​​reagens, hvis anvendelse af en petriskål med en anden størrelse.
3. Omrør PDMS base og hærdningsmidlet med en engangspipette. Start fra kanten af ​​vejebåd og langsomt bevæge sig indad. Omrør grundigt i flere minutter, indtil små bobler dannes hele blandingen; grundig blanding er afgørende for PDMS polymerisation.
4. Hæld blandingen langsomt i petriskålen; blandingen skal helt at dække siliciumwafer formen.
5. Placer petriskålen i et vakuum i 10 min for at fjerne alle luftbobler fra PDMS-blandingen. Hvis bobler forblive på overfladen af ​​blandingen bruge en pipette til at blæse dem ud.
6. Inkubér siliciumwafer form med PDMS i en ovn ved 75 ° C i ca. 2 timer.
7. Forsigtigt skræl laget af polymeriserede PDMS off siliciumwaferen formen, undgå enhver skade på konstruktionen af ​​wafer formen. Alternativt skæres PDMS direkte fra siliciumwaferen støbeform med mindst 5 mm margen omkring mønsteret anvendelse af en enkelt-kant industrielle barberblad; forsigtigt skræl PDMS lag off wafer formen.
8. Placer PDMS lag på bænken med mønstret opad. Skær forsigtigt den individuelle chip med en enkelt kant industrielle barberblad, bevarer en passende margen fra kanten af ​​hver enkelt chip at undgå konstruktion skader.
9. Med mønstret opad, bruge en punch pen (0,75 mm ID) til hulle lige ned gennem indløbet og udløbet cirkler på hver side af kanalerne.
   BEMÆRK: Disse huller skabe vejen for strømmen af ​​mediet. Derfor er det afgørende at gå igennem de kredse og punch hele vejen gennem PDMS lag. Sørg for atfjerne PDMS kolonnerne fra hullet.
10. Kontroller hver udstansede hul ved at indsætte punch pen nål igen ind i hullet. Sørg for, at nålen kan komme ud fra den anden side, hvilket indikerer, at der ikke er nogen blokering. Anvende tape til mønstret overflade, derefter forsigtigt skrælle båndet til at rense støvpartikler. Gentag dette trin mindst tre gange. Efterlad en ren stykke tape på PDMS at opretholde sterilisation.
11. Gentag denne procedure på den modsatte side af PDMS og efterlade det sidste stykke tape på så godt.
12. Forberede en 24 mm x 30 mm dækglas med en tykkelse på 0.13-0.17 mm. Spray 70% ethanol på glasset og tørre med støv remover at sterilisere overfladen; yderligere kan glasset vaskes med autoklaveret vand og tørret med støv remover.
13. Overfør dækglasset og PDMS til en plastplade. Fjern tape fra PDMS og placere mønsteret opad. Undgå enhver kontakt med mønster overflade under overførslen.
14. Forsigtigt PDMS på dækglas, der forbinder både hydrofile overflader (de overflader, der står op under plasmabehandlingen). Sørg for, at der ikke er luftbobler mellem PDMS og dækglasset.
15. Inkubér PDMS chip i en ovn ved 75 ° C i mindst 2 timer.
    BEMÆRK: Mangelfulde mikrofluidik kan forårsage væskelækage på mikroskopet under eksperimentet. Derfor er det vigtigt at kontrollere bindingen mellem PDMS og dækglasset ved let løfte PDMS fra kanterne med pincet. Forsigtigt løfte PDMS bør ikke adskille den fra dækglasset, hvilket indikerer en vellykket obligation.

3. Forberedelser til eksperimentet

1. Oversvømme input og output rør i 70% ethanolopløsning separat 1 dag før PDMS chip forberedelse.
2. Fyld en 5-ml sprøjte med autoklaveret vand til at vaske rørene. hvert rør vaskes ved at tilslutte røret på sprøjten og skylning af røret med vand.
3. Gentag vasketrinet mindst 3 gange for at rense ethanol rest.

Undersøge PDMS kanaler under et optisk mikroskop med et 10X objektiv for at sikre strukturen er konsekvent og intakt. Stabilisere PDMS chip på mikroskopet platformen ved hjælp af tape.
BEMÆRK: Foretag flere chips på én gang i trin 2 for at sikre, at der er backup chips, især hvis gøre enheden for første gang.

Fyld en 5-ml sprøjte med autoklaveret vand. Fastgør sprøjten til en sprøjtepumpe og indsætte de tilsvarende input- og output rør. Indstil vaskehastighed til 750 pl / h at skylle chip til omkring 10 min. Luftboblerne på branche kanalerskal vaskes væk i denne periode; hvis der stadig er bobler, manuelt justere hastigheden at fjerne boblerne.

Gær prøveforberedelse.

1. Overfør 1 ml af tilberedt gær prøve _(OD600 0,6-0,8) i to 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres i 5 minutter ved 3000 x g.
2. Fjerne hovedparten af ​​supernatanten fra hvert rør og kombinere resten til dannelse af en 0,5-ml prøve.

Pause sprøjtepumpen og fjern input rør fra PDMS chip.

Manuelt vende sprøjtepumpen at sutte en lille luftboble (1 til 2 cm i længde) i hver indgang rør. Gå videre til suge i gæren prøve; luftboblen vil vise prøven grænse og angive, hvor meget prøve er blevet trukket.
BEMÆRK: Undgå at suge prøven ind i sprøjten.

Indsæt indgangsrøret tilbage i PDMS chippen og genstarte pumpen at indlæse cellerne ved en hastighed på 750 pi / time.

Efterlad sprøjtepumpen på i 10 minn og undersøge cellefyldning progression under mikroskop; en succesfuld lastning vil fælde celler under mere end 60% af suspendere søjle.

Skift til ernæring opløsning og justere hastigheden til 400 uL / ​​h for celledyrkning.

Vælg observation stillinger for mikroskopet.
BEMÆRK: levetidsspecifikationerne målinger, billeder blev taget en gang hver 15 min ved et optisk mikroskop med et 40x objektiv. For det fluorescerende reporter-analysen blev billeder taget hvert 15. min af et fluorescensmikroskop med et 60X olie mål.

Representative Results

Efter forsøgene kan livslængde af cellerne og mange cellulære og molekylære fænotyper ekstraheres fra optagede tidsforskudte billeder. Da der er en række forskellige funktioner, der kan ekstraheres fra hver celle, det første trin i analysen er at anmærke cellerne og arrangementer, herunder positioner og grænserne for cellerne og timingen af ​​forskellige begivenheder, der spores, sådan som de spirende begivenheder. Disse anmærkninger vil gøre det lettere at vende tilbage til det samme sæt af celler og analysere forskellige funktioner i fremtiden. Ved hjælp af billedanalyse software, såsom ImageJ ¹¹ og de tilhørende plugins, kan en liste over fænotyper derefter udtrækkes fra billeddata ved hjælp af de registrerede anmærkninger i cellerne.

Følgende er et par eksempler på fænotyper målt med mikrofluidapparatet. Levetiden fænotype af gærkan opnås ved at tælle antallet af knopper udarbejdet af hver fanget mor celle og estimering med Kaplan-Meier estimator. Cellerne oprindeligt fanget i mikrofluide enheder er af ukendte aldre. For at minimere forspændingen af levetidsspecifikationerne målinger fra disse ukendte aldre, tidligere fremgangsmåder anvendes det gennemsnitlige antal bud ar på de indfangede celler til at kalibrere levetid ^{4, 7.} Dog knop ar målinger kræver yderligere farvning af celler og giver kun en indirekte estimering af forspændingen. Ved hjælp af denne protokol, enheden ofte fælder friske datterceller, som havde blomstret ud fra allerede fanget celler. Disse celler derefter gå i mor celler. Sådanne celler kan identificeres ved hjælp af vores nedstrøms billede analyse software (film 1). Disse friske mor celler tilvejebringer en mere nøjagtig levetid måling. Som vist i figur 2, Levetiden kurver af friske mor celler blev virksomrød med specifikationerne for de celler af ukendt alder. I dette eksperiment, den gennemsnitlige levetid for de friske mor cellerne var lidt længere (ca. 2 generationer af forskel i median levetid).

Ud over antallet af knopper, andre interessante fænotyper, såsom tidsintervallet mellem to på hinanden følgende spirende begivenheder, som vist i figur 3, kan ekstraheres fra de billeddata ^{3, 7, 8.} Celler ind i en periode med hurtigere spirende efter et par langsommere indledende buddings. Den spirende bremset dramatisk mod slutningen af ​​deres levetid, hvilket indikerer den usunde tilstand af disse alderen celler. Cellecykluskinetikken dynamik indeholder meget nyttig information om den cellulære tilstand af de unge og gamle celler og er blevet anvendt, for eksempel til at karakterisere telomerase mutanter ^12. Vigtigt er det, kan denne enhed væreanvendes til at måle fluorescenssignaler igennem hele livet (figur 4), der giver mulighed for sporing af molekylære markører, der kan være føreren af modningen.

Figur 1: En skematisk af udformningen af mikrofluidapparatet. Anordningen består af 6 uafhængige funktionelle moduler, der kan operere i parallel. Hvert modul er fremstillet af en hovedkanal forbundet til to sidekanaler. Hver sidekanal 113 Pensile kolonner. En ekstra bro tilføjes i midten for at forbinde den vigtigste kanal med de to side-kanaler. Moderceller er fanget under de Pensile kolonner, mens de mindre datterceller vaskes bort af strømmen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Friske mor celler lever længere end celler med ukendt historie. Den replikative levetid af friske modercellerne versus celler af ukendt historie (celler fanget fra begyndelsen af ​​forsøget) i SD medium, 30 °. I gennemsnit friske mor celler lever omkring 2 generationer længere. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Længden af spirende intervaller ændringer celle alderen. Spirende intervaller målt som tidsrammer mellem buddings blev farvekodet, celler blev sorteret efter deres replikation levetid, og friske mor celler blev septemberarated fra celler af ukendt historie. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Måling af aktiviteten af Heat Shock Factor 1 (HSF1) under anvendelse af en mikrofluidapparat. Den Hsf1-aktivitet reporter konstrueres ved et grønt fluorescerende protein (GFP) fusioneret til en forkrøblet CYC1 promotor med HSE opstrøms ^13. Fluorescens billeder blev taget hver 30 min. GFP intensitet blev derefter kvantificeret under anvendelse af en tilpasset MATLAB kode ^14. Datapunkter for hvert enkelt celle er tilsluttet, og angives med en farvet linje. I dette forsøg blev stammen dyrket i SD-medium med 2% glucose (vægt / vol) ved 30 ° C natten over; det blev derefter fortyndet med det samme medium til nyttiggørelse. Bagefter,SD-medium med 0,05% glucose (vægt / vol) blev anvendt til at dyrke celler i mikrofluid chip under fluorescensmåling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: Et eksempel på friske moderceller blive fanget i indretningen for hele levetiden. Filmen viser en frisk mor celle født af en fanget celle. Den røde pil i begyndelsen af ​​filmen markerer placeringen af ​​den friske mor celle og dens første spirende. Denne mor celle blev fanget i mikrofluidapparatet for hele dens levetid. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Discussion

Den PDMS enhed skal være frisk gjort. Ellers vil luftboblerne forårsaget ved at indsætte rør i indretningen være vanskeligt at fjerne. Trin 3.4 er vigtigt at forbedre celle lastning effektivitet ved at koncentrere cellerne. For at forøge throughput af eksperimentet, 4 til 6 moduler på samme PDMS chip forbundet til selvstændigt driver pumperne typisk til at udføre 4 til 6 forskellige eksperimenter (forskellige stammer eller medier sammensætninger) samtidigt.

Sammenlignet med den konventionelle gær replikative aldring assay (som bruger mikrodissektion), den mikro her præsenterede fremgangsmåde er mindre arbejdskrævende og tidskrævende. Desuden mikrofluidapparatet muliggør detaljeret kvantificering af forskellige cellulære eller molekylære parametre, herunder cellestørrelse, cellecyklus dynamik, cellemorfologi og forskellige molekylære markører. Denne mikrofluid fremgangsmåde opnår langsigtet celle sporer med høj opløsning mikroskopi ved at tilbageholdemor celler under PDMS mikro-pads som datterceller skylles automatisk.

Denne enhed anvender bløde PDMS mikro-pads til fælde moderceller ^4, med den grundlæggende struktur lignende, som Huberts et al. beskrevet i hans arbejde ^7. Der er en række forskelle i indretningen design og eksperimentelle protokoller. Den bredere PDMS pad i denne enhed giver visse nyfødte datterceller at blive fanget og analyseret (figur 2 og 3, Movie 1). For at identificere sådanne celler, vi kommenteret de datterceller okulerede fra allerede fanget mor celler, ignorerer de datterceller, der skylles væk uden spirende. I gennemsnit fik vi omkring 2 friske mor celler pr PDMS pad. Forholdet mellem disse friske modercellerne til cellerne af ukendt historie var omkring 1: 2, blandt hvilke ca. en tredjedel blev holdt i indretningen for hele levetiden. Disse celler tillader en mere nøjagtig levetid måling end gør det muligt at analysere sammenhænge mellem mor og datter celler. I denne indretning er en dybere hovedkanal forbundet til to mindre dybe sidekanaler hvor observationerne er lavet; dette design er med til at mindske risikoen for sidesluserne blokeres af store luftbobler. For mikrofluid chip produktion, denne protokol anvender også en simpel fremgangsmåde til at binde PDMS og dækglas, blot ved hjælp af plasma eksponering og ovnbagning, hvilket øger succesrate.

Med denne protokol, mikrofluidapparatet er i stand til robust fælde mindst en celle (3-5 celler i gennemsnit) pr PDMS pad ved begyndelsen af forsøget for vildtype haploide gærstammer (dvs. BY4741 eller BY4742). Omkring 30% af cellerne kan bevares gennem hele deres levetid. Det er værd at bemærke, at udførelsen af ​​PDMS enhed afhænger af kløften størrelse mellem Pensile kolonner og glasset og størrelsen af ​​gærcellerne. For vildtype haploide gærstammer, denpassende størrelse til afstanden er 3,5-4,5 um. Uden for dette område, lastning effektivitet og fastholdelse celle ratefald kraftigt. Således skal nye indretninger til gærstammer med meget større eller mindre cellestørrelser ⁷ fremstilles ved at modificere højden af det første lag fremstillet i trin 1.

Sammenfattende indretningen og protokollen beskrevet i denne artikel, er ikke kun egnet til gær aging undersøgelser, men er også anvendelig til andre eksperimenter, der kræver sporing af modercellerne og overvågning af molekylære markører i mange generationer eller igennem hele livet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B