Summary
यह लेख एक प्रोटोकॉल microfluidic चिप्स के उत्पादन और microfluidic प्रयोगों की स्थापना के जीवन काल और एकल खमीर कोशिकाओं के सेलुलर समलक्षणियों को मापने के लिए के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करता है।
Introduction
नवोदित खमीर अनुसंधान उम्र बढ़ने में एक शक्तिशाली मॉडल जीव है। हालांकि, खमीर में एक पारंपरिक जीवन काल परख सूक्षम पर निर्भर करता है, जो न केवल श्रम गहन लेकिन यह भी कम प्रवाह क्षमता 1, 2 है। इसके अलावा, पारंपरिक सूक्षम दृष्टिकोण अकेली मां कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर और आणविक सुविधाओं का एक विस्तृत विवरण प्रदान नहीं करता है उनकी उम्र बढ़ने के। Microfluidic उपकरणों के विकास के खमीर उम्र को मापने के लिए और साथ ही मां कोशिकाओं 3, 4, 5, 6, 7, 8 की उम्र भर आणविक मार्कर और विभिन्न सेलुलर समलक्षणियों पालन करने के लिए एक स्वचालित प्रक्रिया में सक्षम बनाया है। बाद खमीर कोशिकाओं एक microfluidic युक्ति में लोड कर रहे हैं, वे स्वत: समय-लैप का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे ट्रैक किया जा सकताई इमेजिंग। प्रसंस्करण उपकरण इमेजिंग की मदद से, विभिन्न सेलुलर और आणविक समलक्षणियों 3 निकाला जा सकता है, 6, 8, उम्र, आकार, फ्लोरोसेंट संवाददाता, सेल आकृति विज्ञान, कोशिका चक्र की गतिशीलता, आदि, जिनमें से कई मुश्किल या असंभव का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं सहित पारंपरिक सूक्षम विधि। Microfluidic उपकरणों कुछ साल पहले 3, 4, 6, 7 उनके सफल विकास के बाद से खमीर उम्र बढ़ने अनुसंधान के क्षेत्र में प्रसिद्धि प्राप्त की है। कई समूह बाद में पहले डिजाइन 5 के रूपांतरों पर प्रकाशित किया है, और कई खमीर प्रयोगशालाओं उनके अध्ययन के लिए microfluidic उपकरणों कार्यरत हैं।
एक सेल संस्कृति घातीय वृद्धि के दौर से गुजर में, वृद्ध मां कोशिकाओं है कि अवलोकन के लिए उपलब्ध हैं की संख्या miniscu हैle। इसलिए, उम्र मापन के लिए microfluidic डिवाइस के सामान्य डिजाइन सिद्धांत मां कोशिकाओं बनाए रखने के लिए और बेटी की कोशिकाओं को हटाने के लिए है। ऐसा ही एक डिजाइन तथ्य यह है कि खमीर असममित कोशिका विभाजन से होकर गुजरती है का उपयोग करता है। डिवाइस इच्छा जाल बड़ा मां कोशिकाओं में संरचनाओं और अनुमति देने के छोटे बेटी कोशिकाओं धुल जाने। Microfluidic चिप इस आलेख में वर्णित जाल मां कोशिकाओं को एक नरम polydimethylsiloxane (PDMS) पैड (ऊर्ध्वाधर लटकता हुआ कॉलम) (चित्रा 1) का उपयोग करता है। इसी तरह की डिजाइन की डिवाइस पहले से 3, 4, 6, 7 की जानकारी मिली है। यह प्रोटोकॉल microfluidic उपकरणों और एक सीधा सेल लोडिंग विधि है कि समय-अंतराल इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलित है निर्माण करने के लिए एक सरल प्रक्रिया का उपयोग करता। microfluidic युक्ति में महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक PDMS जाल मां कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया पैड की चौड़ाई है। हमारे घevice व्यापक पैड कि प्रत्येक पैड के तहत और अधिक मां कोशिकाओं रख सकते हैं, ताजा मां कोशिकाओं है कि उनके जीवन भर ट्रैक किया जा सकता का एक महत्वपूर्ण अंश सहित उपयोग करता है। उम्र माप के अलावा, इस प्रोटोकॉल एकल कक्ष समय-अंतराल इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयोगी जब कोशिकाओं कई पीढ़ियों या जब पूरे जीवन भर एक अवलोकन के लिए आवश्यक है के लिए नज़र रखी जा करने की आवश्यकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सिलिकॉन वेफर ढालना निर्माण
नोट: photomask ऑटोकैड सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया है और एक वाणिज्यिक कंपनी द्वारा निर्मित है। इस डिजाइन विभिन्न पैटर्न (की तीन परतों में शामिल है अनुपूरक फ़ाइल 1 )। प्रथम, द्वितीय, और तीसरे परतों की ऊंचाई लगभग 4 सुक्ष्ममापी, 10 सुक्ष्ममापी, और 50 सुक्ष्ममापी, क्रमशः रहे हैं। सिलिकॉन वेफर ढालना photomask नरम लिथोग्राफी 9, 10 का उपयोग करने से बनाया गया था।
- 200 डिग्री सेल्सियस पर एक सिलिकॉन वेफर बेक 10 मिनट जल वाष्प के वाष्पीकरण के लिए के लिए। स्पिन कोट नकारात्मक photoresist SU-8 सिलिकॉन वेफर पर।
नोट: स्पिन कोट SU-8 3005 5000 आरपीएम 30 पहली परत उत्पन्न करने के लिए के लिए कम से, SU-8 2010 3000 rpm पर 30 रों दूसरी परत उत्पन्न करने के लिए, और SU-8 3025 2,000 rpm पर 30 रों उत्पन्न करने के लिए के लिए के लिए तीसरी परत। - मुलायम बेक टी से पहले लेपित वेफरवह पैटर्न हस्तांतरण। संरेखित और एक मुखौटा aligner का उपयोग कर "सीधे संपर्क" मोड में वेफर बेनकाब।
नोट: मुलायम सेंकना पहली परत के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, दूसरी परत के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, और तीसरी परत के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए वेफर। 100 MJ / पहली परत के लिए सेमी 2, 130 MJ / दूसरी परत के लिए सेमी 2, और 200 MJ / तीसरी परत के लिए सेमी 2 पर जोखिम खुराक का उपयोग करें। - प्रदर्शन के बाद, वेफर के बाद बेक और SU-8 डेवलपर का उपयोग कर इसे विकसित करना। वेफर एक एन 2 बंदूक और कड़ी मेहनत से सेंकना 30 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर वेफर का उपयोग कर सुखाएं।
नोट: सिलिकॉन वेफर ढालना स्कॉच टेप का उपयोग कर एक 15 सेमी व्यास प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए तय हो गई है, पैटर्न की ओर ऊपर की ओर रखते। आमतौर पर, हम एक ही ढालना, जो कई microfluidic चिप्स एक ही समय में गढ़ा जा करने की अनुमति देता पर कई समान चिप संरचनाओं डाल दिया। प्रत्येक ढालना कई बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता microfluidic चिप्स का निर्माण करना।
2. Microfluidicचिप निर्माण
- एक संतुलन पर एक साफ वजन नाव रखें और संतुलन मरोड़ा। वजन नाव में PDMS आधार के 50 ग्राम डालो।
- वजन नाव के लिए PDMS इलाज एजेंट की 5 ग्राम जोड़ें (w / PDMS आधार को 1:10 के अनुपात डब्ल्यू)।
नोट: यह मात्रा मोल्ड के साथ एक 15 सेमी व्यास पेट्री डिश पर आधारित है। यदि एक अलग आकार के एक पेट्री डिश का उपयोग कर अभिकर्मक को एडजस्ट करें। - PDMS आधार है और एक डिस्पोजेबल विंदुक के साथ इलाज एजेंट हलचल। वजन नाव के किनारे से शुरू करें और धीरे-धीरे अंदर की ओर ले जाते हैं। कई मिनट के लिए अच्छी तरह से हलचल जब तक छोटे बुलबुले मिश्रण भर फार्म; पूरी तरह से मिश्रण PDMS बहुलकीकरण लिए आवश्यक है।
- धीरे-धीरे पेट्री डिश में मिश्रण डालो; मिश्रण पूरी तरह से सिलिकॉन वेफर ढालना कवर करना होगा।
- एक निर्वात में पेट्री डिश रखें 10 मिनट PDMS मिश्रण से सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए। यदि बुलबुले मिश्रण की सतह पर बने हुए हैं, उन्हें बाहर उड़ाने की एक पिपेट का उपयोग।
- सिलिकॉन सेतेके बारे में 2 घंटे के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS साथ वेफर ढालना।
- धीरे सिलिकॉन वेफर ढालना बंद polymerized PDMS की परत छील, वेफर मोल्ड के निर्माण को कोई नुकसान से बचने। वैकल्पिक रूप से, पैटर्न एक एकल बढ़त औद्योगिक रेजर ब्लेड का उपयोग कर के आसपास कम से कम 5 मिमी मार्जिन के साथ सिलिकॉन वेफर मोल्ड से सीधे PDMS कटौती; धीरे वेफर ढालना बंद PDMS परत छील।
- पैटर्न की ओर ऊपर की ओर रखते बेंच पर PDMS परत रखें। ध्यान से एक भी बढ़त औद्योगिक रेजर ब्लेड के साथ अलग-अलग चिप काट, प्रत्येक एकल चिप निर्माण क्षति से बचने के लिए के किनारे से एक पर्याप्त मार्जिन को बनाए रखना।
- ऊपर की ओर पैटर्न पक्ष के साथ, चैनलों के प्रत्येक पक्ष पर सीधे प्रवेश और आउटलेट हलकों के माध्यम से नीचे छेद पंच के लिए एक पंच कलम (0.75-मिमी आईडी) का उपयोग करें।
नोट: ये छेद के माध्यम के प्रवाह के लिए मार्ग बना सकते हैं। इसलिए, यह हलकों के माध्यम से जाने के लिए और PDMS परत के माध्यम से सभी तरह से पंच के लिए महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित कर लेंछेद से PDMS स्तंभों को निकालने के। - पंच कलम सुई छेद में फिर से डालने से हर मुक्का मारा छेद की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि सुई दूसरी तरफ से बाहर आ सकते हैं, जो यह दर्शाता कोई रुकावट है कि वहाँ बनाओ। पैटर्न सतह के लिए टेप लागू करें, फिर धीरे से टेप धूल के कणों को साफ करने के लिए बंद छील। इस कदम के कम से कम तीन बार दोहराएँ। PDMS पर स्कॉच टेप की एक स्वच्छ टुकड़ा छोड़ दो नसबंदी बनाए रखने के लिए।
- PDMS के विपरीत दिशा में यह प्रक्रिया दोहराएँ और साथ ही पर टेप के अंतिम टुकड़ा छोड़ दें।
- 0.13-0.17 मिमी की मोटाई के साथ एक 24 मिमी x 30 मिमी कवर कांच तैयार करें। कांच पर 70% इथेनॉल स्प्रे और धूल पदच्युत के साथ शुष्क सतह नसबंदी; इसके अलावा, कांच autoclaved पानी के साथ धोया और धूल पदच्युत के साथ सुखाया जा सकता है।
- एक प्लास्टिक प्लेट को कवर कांच और PDMS स्थानांतरित करें। PDMS से स्कॉच टेप निकालें और ऊपर की ओर पैटर्न पक्ष रखें। स्थानांतरण के दौरान पैटर्न सतह के साथ किसी भी संपर्क से बचें।
- ध्यान से कवर कांच पर PDMS जगह, दोनों हाइड्रोफिलिक सतहों (सतहों कि प्लाज्मा उपचार के दौरान सामना करना पड़ा) जोड़ने। यकीन है कि PDMS और कवर कांच के बीच कोई हवाई बुलबुले देखते हैं कि सुनिश्चित करें।
- कम से कम 2 घंटे के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS चिप सेते हैं।
नोट: कमी microfluidics प्रयोग के दौरान माइक्रोस्कोप पर तरल रिसाव हो सकती है। इसलिए, यह थोड़ा चिमटी से किनारों से PDMS उठाने द्वारा PDMS और कवर कांच के बीच बंधन की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है। धीरे PDMS उठाने कवर कांच से अलग नहीं किया जाना चाहिए, एक सफल बंधन का संकेत है।
3. प्रयोग की तैयारी
- 70% इथेनॉल समाधान अलग से 1 दिन PDMS चिप तैयार करने से पहले में इनपुट और आउटपुट ट्यूब डूब।
- autoclaved पानी के साथ एक 5 एमएल सिरिंज भरें ट्यूब धोने के लिए। सिरिंज पर ट्यूब प्लग और पानी के साथ ट्यूब निस्तब्धता द्वारा प्रत्येक ट्यूब धो लें।
- इथेनॉल अवशेषों साफ करने के लिए कपड़े धोने चरण दोहराएँ कम से कम 3 बार।
ध्यान दें: चरण 2 में एक बार में एकाधिक चिप्स बनाने सुनिश्चित करने के लिए बैकअप चिप्स देखते हैं कि, पहली बार के लिए उपकरण बनाने, खासकर अगर।
- से कम 3,000 एक्स जी दो 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में तैयार खमीर नमूना (ओवर ड्राफ्ट 600 0.6-0.8) के एमएल स्थानांतरण 1 और 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला के बहुमत निकालें और एक 0.5-एमएल नमूना के रूप में शेष गठबंधन।
नोट: सिरिंज में नमूना चूसने से बचें।
नोट: उम्र माप के लिए, छवियों एक बार हर 15 मिनट के एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप से एक 40x उद्देश्य के साथ ले जाया गया। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर विश्लेषण के लिए, छवियों एक 60x तेल उद्देश्य के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी से एक बार हर 15 मिनट ले जाया गया।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्रयोगों के बाद, कोशिकाओं और कई सेलुलर और आणविक समलक्षणियों के जीवनकाल रिकॉर्ड किए गए समय-अंतराल छवियों से निकाला जा सकता। के बाद से वहाँ विभिन्न सुविधाओं कि प्रत्येक कोशिका से निकाला जा सकता का एक नंबर रहे हैं, विश्लेषण का पहला कदम, कोशिकाओं और घटनाओं, स्थितियों और कोशिकाओं की सीमाओं और विभिन्न घटनाओं के समय है कि ट्रैक किए जा रहे सहित व्याख्या करने के लिए है इस तरह के नवोदित घटनाओं के रूप में। ये टिप्पणियां यह आसान भविष्य में कोशिकाओं के एक ही सेट में लौटने और विभिन्न सुविधाओं का विश्लेषण करने के कर देगा। ऐसे ImageJ 11 और संबद्ध प्लगइन्स के रूप में, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, समलक्षणियों की एक सूची तो कोशिकाओं की दर्ज की गई टिप्पणियों का उपयोग करने छवि डेटा से निकाला जा सकता।
निम्नलिखित microfluidic डिवाइस के साथ मापा जाता समलक्षणियों के कुछ उदाहरण रहे हैं। खमीर के जीवन काल फेनोटाइपप्रत्येक फंस माँ सेल द्वारा उत्पादित कलियों की संख्या की गणना और कापलान-मायर आकलनकर्ता के साथ का आकलन करके प्राप्त की जा सकती है। कोशिकाओं शुरू में microfluidic उपकरणों में फंस अज्ञात उम्र के हैं। इन अज्ञात उम्र से होने वाले जीवन काल मापन के पूर्वाग्रह को कम से कम करने के लिए, पिछले तरीकों उम्र 4, 7 ठीक करना फंस कोशिकाओं पर कली निशान की औसत संख्या का इस्तेमाल किया। हालांकि, कली निशान माप कोशिकाओं के अतिरिक्त धुंधला की आवश्यकता होती है और पूर्वाग्रह का केवल एक अप्रत्यक्ष अनुमान प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, डिवाइस अक्सर ताजा बेटी कोशिकाओं कि पहले से ही फंस कोशिकाओं से बंद अंकुरित फंसा लेती है। इन कोशिकाओं को फिर मां कोशिकाओं में बदल जाते हैं। ऐसी कोशिकाओं हमारे नीचे की ओर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (मूवी 1) का उपयोग कर पहचाना जा सकता है। ये ताजा मां कोशिकाओं एक और अधिक सटीक उम्र माप प्रदान करते हैं। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, ताजा मां कोशिकाओं की उम्र घटता कंपनियों थेअज्ञात उम्र की कोशिकाओं के लोगों के साथ लाल। इस प्रयोग में, ताजा मां कोशिकाओं की औसत आयु में थोड़ा लंबा (मंझला उम्र में अंतर के बारे में 2 पीढ़ियों) था।
कलियों, इस तरह के लगातार दो नवोदित घटनाओं के बीच समय अंतराल के रूप में अन्य रोचक समलक्षणियों,, के रूप में 3 चित्र में दिखाया की संख्या के अलावा, इमेजिंग डेटा 3, 7, 8 से निकाला जा सकता। कोशिकाओं में कुछ धीमी प्रारंभिक buddings निम्नलिखित तेजी से उभरते की अवधि में प्रवेश। नवोदित उनके जीवन काल के अंत में नाटकीय रूप से धीमा, इन आयु वर्ग कोशिकाओं के अस्वस्थ राज्य का संकेत है। कोशिका चक्र गतिशीलता युवा और वृद्ध कोशिकाओं के सेलुलर राज्य के बारे में बहुत उपयोगी जानकारी है और, इस्तेमाल किया गया है उदाहरण के लिए, टेलोमिरेज उत्परिवर्ती 12 चिह्नित करने के लिए। महत्वपूर्ण रूप से, इस उपकरण हो सकता हैउम्र (चित्रा 4) के दौरान प्रतिदीप्ति संकेतों को मापने के लिए, आणविक मार्कर उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के चालक हो सकता है कि की ट्रैकिंग के लिए अनुमति का इस्तेमाल किया।
चित्र 1: microfluidic डिवाइस के डिजाइन का एक योजनाबद्ध। डिवाइस 6 स्वतंत्र कार्यात्मक मॉड्यूल है कि समानांतर में काम कर सकते हैं के होते हैं। प्रत्येक मॉड्यूल एक मुख्य दो पक्ष चैनलों से कनेक्ट चैनल से बना है। प्रत्येक पक्ष चैनल 113 लटकता हुआ कॉलम शामिल हैं। एक अतिरिक्त पुल बीच में जोड़ दिया जाता है दो पक्ष चैनलों के साथ मुख्य चैनल कनेक्ट करने के लिए। माँ कोशिकाओं, लटकता हुआ कॉलम के नीचे फंस जाते हैं, जबकि छोटे बेटी कोशिकाओं दूर प्रवाह से धोया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: ताजा मां कोशिकाओं अज्ञात इतिहास के साथ कोशिकाओं की तुलना में लंबे समय तक रहते हैं। अज्ञात इतिहास की कोशिकाओं की तुलना में ताजा मां कोशिकाओं की replicative उम्र SD मीडिया, 30 डिग्री में (कोशिकाओं प्रयोग की शुरुआत से फंस)। औसत पर, ताजा मां कोशिकाओं के बारे में 2 पीढ़ियों अब रहते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: सेल आयु वर्ग के रूप में अंतराल परिवर्तन नवोदित की लंबाई। buddings के बीच समय फ्रेम के रूप में मापा नवोदित अंतराल कलर-कोडेड, कोशिकाओं को उनके प्रतिकृति उम्र द्वारा आदेश दिए थे रहे थे, और ताजा मां कोशिकाओं सितम्बर थेअज्ञात इतिहास की कोशिकाओं से arated। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: हीट शॉक फैक्टर 1 (HSF1) की गतिविधि को मापने एक microfluidic युक्ति का उपयोग करते हुए। Hsf1-गतिविधि रिपोर्टर एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एच एस ई नदी के ऊपर 13 के साथ एक अपंग CYC1 प्रमोटर को आपस में जुड़े द्वारा निर्मित है। प्रतिदीप्ति छवियों हर 30 मिनट ले जाया गया। GFP तीव्रता तो था एक स्वनिर्धारित MATLAB कोड 14 का उपयोग कर मात्रा निर्धारित। प्रत्येक एकल कक्ष के लिए डेटा अंक जुड़ा हुआ है और एक रंगीन लाइन के साथ दर्शाया गया है। इस प्रयोग में, तनाव एसडी माध्यम में 2% ग्लूकोज (भार / खंड) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हो गया था; यह तो ठीक होने के लिए एक ही माध्यम से पतला था। बाद में,एसडी 0.05% ग्लूकोज (भार / खंड) के साथ मध्यम प्रतिदीप्ति माप के दौरान microfluidic चिप में कोशिकाओं को बढ़ने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 1: ताजा मां कोशिकाओं का एक उदाहरण पूरे जीवन काल के लिए डिवाइस के अंदर फंस जा रहा है। फिल्म एक फंस सेल से पैदा हुआ एक ताजा मां सेल को दर्शाता है। फिल्म की शुरुआत में लाल तीर ताजा मां सेल और इसके पहले नवोदित की स्थिति को दर्शाता है। यह मां सेल अपने पूरे जीवन काल के लिए microfluidic युक्ति में फंस गया था। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDMS डिवाइस हाल में किए जाने की जरूरत है। अन्यथा, हवा के बुलबुले डिवाइस में ट्यूब डालने की वजह से दूर करने के लिए कठिन हो जाएगा। चरण 3.4 कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करके सेल लोड हो रहा है दक्षता में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है। प्रयोग के प्रवाह क्षमता बढ़ाने के लिए, एक ही PDMS चिप पर 4 से 6 मॉड्यूल स्वतंत्र रूप से काम कर रही पंप आमतौर पर 4 से 6 विभिन्न प्रयोगों (अलग उपभेदों या मीडिया रचनाओं) एक साथ प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया जाता है से जुड़ा है।
पारंपरिक खमीर replicative उम्र बढ़ने परख (जो सूक्षम उपयोग करता है) की तुलना में, यहाँ प्रस्तुत microfluidic विधि कम श्रमसाध्य और समय लेने है। इसके अलावा, microfluidic युक्ति सेल के आकार, कोशिका चक्र की गतिशीलता, सेल आकृति विज्ञान, और विभिन्न आणविक मार्कर सहित विभिन्न सेलुलर या आणविक मापदंडों की विस्तृत मात्रा के लिए अनुमति देता है। इस microfluidic विधि लंबे समय तक सेल बनाए रखने के द्वारा उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के साथ नज़र रखने को प्राप्त होता हैबेटी की कोशिकाओं के रूप में PDMS सूक्ष्म पैड के तहत मां कोशिकाओं स्वचालित रूप से प्लावित कर रहे हैं।
इस उपकरण के समान बुनियादी संरचना, Huberts एट अल के रूप में के साथ, जाल मां कोशिकाओं से 4 नरम PDMS सूक्ष्म पैड का उपयोग करता है। अपने काम के 7 में वर्णित। डिवाइस डिजाइन और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में मतभेद की एक संख्या हैं। इस उपकरण में व्यापक PDMS पैड कुछ नवजात बेटी कोशिकाओं फंस और विश्लेषण (आंकड़े 2 और 3, मूवी 1) की अनुमति देता है। ऐसी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, हम पहले से ही फंस मां कोशिकाओं से अंकुरित बेटी कोशिकाओं, बेटी कोशिकाओं है कि नवोदित बिना दूर प्लावित अनदेखी एनोटेट। औसत पर, हम PDMS पैड प्रति के बारे में 2 ताजा मां कोशिकाओं मिला है। 2, जो बीच में लगभग एक तिहाई पूरे जीवन काल के लिए डिवाइस में रखा गया था: अज्ञात इतिहास की कोशिकाओं के लिए इन ताजा मां कोशिकाओं के अनुपात के बारे में 1 था। इन कोशिकाओं को एक और अधिक सटीक उम्र माप एक की अनुमति देते हैंघ यह संभव मां और बेटी की कोशिकाओं के बीच परस्पर संबंध का विश्लेषण है। इस उपकरण में, एक गहरी मुख्य चैनल दो उथले पक्ष चैनलों जहां टिप्पणियों बना रहे हैं करने के लिए जुड़ा हुआ है; इस डिजाइन पक्ष चैनलों की मौका बड़ा हवाई बुलबुले द्वारा अवरुद्ध किया जा रहा कम करने के लिए मदद करता है। microfluidic चिप उत्पादन के लिए, इस प्रोटोकॉल भी PDMS और कांच कवर संयोजित करना चाहते थे, बस प्लाज्मा जोखिम और ओवन पकाना, जो सफलता की दर बढ़ जाती है का उपयोग करते हुए एक सरल विधि का उपयोग करता।
इस प्रोटोकॉल के साथ, microfluidic युक्ति मजबूती के साथ जंगली प्रकार अगुणित खमीर के उपभेदों (यानी, BY4741 या BY4742) के लिए प्रयोग की शुरुआत में जाल कम से कम एक सेल (औसतन 3-5 कोशिकाओं) PDMS पैड प्रति करने में सक्षम है। कोशिकाओं के बारे में 30% के लिए अपने पूरे जीवन भर बनाए रखा जा सकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि PDMS डिवाइस के प्रदर्शन लटकता हुआ कॉलम और कांच और खमीर कोशिकाओं के आकार के बीच की खाई आकार पर निर्भर करता लायक है। जंगली प्रकार अगुणित खमीर के उपभेदों के लिए,खाई के लिए उपयुक्त आकार 3.5-4.5 सुक्ष्ममापी है। इस रेंज, लोड हो रहा है दक्षता और सेल प्रतिधारण दर गिरावट तेजी से बाहर। इस प्रकार, बहुत बड़ा या छोटा सेल आकार 7 के साथ खमीर के उपभेदों के लिए नए उपकरणों पहली परत चरण 1 में बनाया की ऊंचाई को संशोधित करके गढ़े किया जाना चाहिए।
सारांश में, डिवाइस और प्रोटोकॉल इस आलेख में वर्णित खमीर उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए ही उपयुक्त नहीं हैं, लेकिन यह भी अन्य प्रयोगों कि मां कोशिकाओं की ट्रैकिंग और कई पीढ़ियों के लिए या जीवन भर आणविक मार्कर की निगरानी की आवश्यकता के लिए लागू होते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Pure Ethanol, Koptec | VWR | 64-17-5 | |
| Whoosh-Duster™ | VWR | 16650-027 | |
| 5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip) | Becton, Dickinson and Company | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028) | Component Supply Company | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | Component Supply Company | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | Fisher Scientific | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
