Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Summary

Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.

Introduction

Brotamento levedura é um poderoso organismo modelo na pesquisa de envelhecimento. No entanto, num ensaio de tempo de vida convencional em leveduras depende de microdissecação, que não só é de trabalho intensivo, mas também baixa taxa de transferência ^{1, 2.} Além disso, a abordagem tradicional microdissecação não fornece uma vista detalhada de várias características celulares e moleculares nas células-mãe individuais à medida que envelhecem. O desenvolvimento de dispositivos de microfluidos tem possibilitado um procedimento automatizado para medir o tempo de vida de levedura, bem como para seguir marcadores moleculares e vários fenótipos celulares ao longo do tempo de vida das células-mãe de ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Após as células de levedura são carregados para um dispositivo de microfluidos, que pode ser rastreado sob um microscópio usando tempos voltas automáticase de imagem. Com a ajuda de ferramentas de processamento de imagem latente, vários fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos ^{3, 6, 8,} incluindo o tempo de vida, tamanho, repórter fluorescente, a morfologia celular, a dinâmica do ciclo celular, etc, muitos dos quais são difíceis ou impossíveis de obter usando o método tradicional microdissecação. Dispositivos microfluídicos ganharam destaque na pesquisa do envelhecimento levedura desde o seu desenvolvimento bem sucedido de alguns anos atrás ^{3, 4, 6, 7.} Vários grupos posteriormente publicado em variações dos projetos anteriores ^5, e muitos laboratórios levedura empregaram dispositivos microfluídicos para o seu estudo.

Em uma cultura de células em crescimento exponencial, o número de células mãe com idades que estão disponíveis para a observação é miniscule. Portanto, o princípio de design geral do dispositivo microfluídico para medições de tempo de vida é para reter células-mãe e remover células filhas. Um desses desenhos faz uso do fato de que o fermento sofre divisão celular assimétrica. As estruturas em células-mãe a armadilha dispositivo vontade maiores e permitem que as células filhas mais pequenas a serem lavados. O chip de microfluidos descrito neste artigo utiliza uma almofada macia polidimetilsiloxano (PDMS) (colunas verticais Pensile) para células-mãe armadilha (Figura 1). Dispositivos de desenho semelhante têm sido relatados anteriormente ^{3, 4, 6, 7.} Este protocolo utiliza um processo mais simples para fabricar dispositivos microfluidicos e um método de célula de carga simples que é optimizado para as experiências de imagiologia de intervalo de tempo. Um dos parâmetros chave no dispositivo de microfluidos é a largura das pastilhas de PDMS usados ​​para células mãe armadilha. nossa dispositivo usa almofadas mais amplas que podem manter mais células-mãe em cada bloco, incluindo uma fração significativa de células-mãe frescas que podem ser rastreados ao longo da sua vida útil. Para além das medições vida útil, este protocolo é útil para experiências de imagiologia única célula de intervalo de tempo quando as células necessitam de ser rastreados por muitas gerações ou quando uma observação ao longo de todo o tempo de vida é necessário.

Protocol

1. Silicon Wafer fabricação de moldes

NOTA: O photomask é projetado com software AutoCAD e fabricado por uma empresa comercial. Este projeto contém três camadas de padrões diferentes ( Documento Suplementar 1 ). As alturas das primeira, segunda, e terceira camadas são cerca de 4 mm, 10? M e 50? M, respectivamente. O molde da bolacha de silício foi criado a partir da fotomáscara utilizando litografia macia ^{9, 10.}

1. Asse uma bolacha de silício a 200 ° C durante 10 minutos para evaporar o vapor de água. revestimento rotação fotorresistente negativo SU-8 sobre a bolacha de silício.
   NOTA: revestimento rotação SU-8 3005 a 5000 rpm durante 30 segundos para gerar a primeira camada, SU-8, 2010 a 3000 rpm durante 30 segundos para gerar a segunda camada, e SU-8 3025 a 2000 rpm durante 30 segundos para gerar o terceira camada.
2. Soft-cozer a bolacha revestido antes de tele transferência padrão. Alinhar e expor a hóstia no modo "contato direto" usando um alinhador de máscara.
   NOTA: Soft-coza a bolacha durante 2 min a 95 ° C para a primeira camada, 3 min a 95 ° C para a segunda camada, e 15 min a 95 ° C para a terceira camada. Utilizar a dose de exposição a 100 mJ / cm ² para a primeira camada, de 130 mJ / cm ² para a segunda camada, e de 200 mJ / cm ² para a terceira camada.
3. Após a exposição, pós-assar o wafer e desenvolvê-lo usando SU-8 desenvolvedor. Seca-se a pastilha utilizando uma pistola de N ₂ e difícil de cozedura da bolacha a 200 ° C durante 30 min.
   NOTA: O molde de bolacha de silício é fixo para cerca de 15 cm de diâmetro de plástico de Petri usando fita Scotch, com o lado do padrão virado para cima. Normalmente, colocamos várias estruturas de chips idênticos no mesmo molde, que permite que vários chips microfluídicos a ser fabricado, ao mesmo tempo. Cada molde pode ser reutilizado muitas vezes para fabricar chips de microfluidos.

2. Microfluidicfabricação de chips

1. Coloque um barco com peso limpo em uma balança e tarar a balança. Pour 50 g de base de PDMS no barco pesar.
2. Adicionar 5 g de PDMS agente de cura para o barco de pesagem (w / w proporção de 1:10 para a base de PDMS).
   NOTA: Este volume é baseada em um diâmetro de 15 cm-placa de Petri com o molde. Ajustar a quantidade de reagente de se utilizar uma placa de Petri com um tamanho diferente.
3. Agita-se a base de PDMS e o agente de cura com uma pipeta descartável. Iniciar a partir da borda do barco de pesagem e mova lentamente para dentro. Agita-se vigorosamente durante vários minutos até formar pequenas bolhas por toda a mistura; mistura completa é essencial para PDMS polimerização.
4. Verter a mistura lentamente para a placa de Petri; a mistura deve cobrir completamente o molde de bolacha de silício.
5. Colocar a placa de Petri no vácuo durante 10 minutos para remover todas as bolhas de ar a partir da mistura de PDMS. Se as bolhas permanecem sobre a superfície da mistura, utilizar uma pipeta para fundi-los fora.
6. Incubar o silíciomolde bolacha com PDMS em uma estufa a 75 ° C durante cerca de 2 h.
7. Com cuidado, descascar a camada de PDMS polimerizados para fora do molde bolacha de silício, evitando qualquer dano para a construção do molde da bolacha. Alternativamente, cortar o PDMS directamente a partir do molde da bolacha de silício com uma margem mínima de 5 mm em torno do padrão utilizando uma lâmina de barbear industrial de ponta simples; suavemente descascar a camada de PDMS fora do molde bolacha.
8. Coloque a camada de PDMS no banco com o padrão lado virado para cima. Cuidadosamente cortar o chip indivíduo com uma lâmina de barbear industrial de ponta única, mantendo uma margem adequada a partir da borda de cada um único chip para evitar danos de construção.
9. Com o padrão lado virado para cima, utilizar uma caneta punção (ID de 0,75 mm) para fazer furos na vertical através das entrada e saída de círculos em cada lado dos canais.
   NOTA: Estes furos criar o caminho para o fluxo de meio. Portanto, é crucial para percorrer os círculos e socos todo o caminho através da camada de PDMS. Tenha certeza deremover as colunas de PDMS do furo.
10. Verificar todos os buracos perfurados através da inserção da agulha da caneta de novo perfurador para dentro do buraco. Certifique-se de que a agulha pode sair do outro lado, indicando que não há nenhum bloqueio. Aplique a fita para a superfície do padrão, em seguida, descasque delicadamente a fita para limpar as partículas de poeira. Repetir esta etapa, pelo menos, três vezes. Deixar um pedaço limpo de fita adesiva sobre os PDMS para manter a esterilização.
11. Repita este procedimento no lado oposto do PDMS e deixar o último pedaço de fita no bem.
12. Preparar um x 30 mm de vidro de cobertura 24 mm com uma espessura de 0.13-0.17 mm. Spray de etanol a 70% sobre o vidro e seco com removedor de poeira para esterilizar a superfície; Além disso, o vidro pode ser lavada com água esterilizada e secou-se com removedor de poeira.
13. Transferir o vidro de cobertura e PDMS a uma placa de plástico. Retire a fita adesiva do PDMS e coloque lado o padrão voltado para cima. Evite qualquer contato com a superfície do padrão durante a transferência.
14. Cuidadosamente colocar o PDMS para o vidro de cobertura, que liga ambas as superfícies hidrofílicas (as superfícies que enfrentam-se durante o tratamento por plasma). Certifique-se de que não existem bolhas de ar entre o PDMS e a tampa de vidro.
15. Incubar o chip PDMS em uma estufa a 75 ° C durante pelo menos 2 h.
    NOTA: microfluidos deficiente pode provocar fugas de líquido sobre o microscópio durante a experiência. Portanto, é importante para verificar a ligação entre o PDMS e a tampa de vidro, levantando ligeiramente o PDMS a partir das bordas com uma pinça. Suavemente levantar o PDMS não devem separar-lo a partir da tampa de vidro, indicando uma ligação bem sucedida.

3. Preparação para o Experimento

1. Submergir os tubos de entrada e de saída em solução de etanol a 70% separadamente um dia antes da preparação chip de PDMS.
2. Encher uma seringa de 5 ml com água esterilizada para lavar os tubos. Lava-se cada tubo através da ligação do tubo da seringa e a lavagem do tubo com água.
3. Repetir o passo de lavagem, pelo menos, 3 vezes para limpar resíduo etanol.

Examine os canais PDMS sob um microscópio óptico com uma objetiva de 10X para garantir que a estrutura é consistente e intacta. Estabilizar o chip PDMS para a plataforma microscópio usando fita adesiva.
NOTA: Faça múltiplos chips ao mesmo tempo no passo 2 para garantir que não são chips de backup, especialmente se tornando o dispositivo pela primeira vez.

Encher uma seringa de 5 mL com água autoclavada. Fixar a seringa para uma bomba de seringa e inserir os tubos de entrada e de saída correspondentes. Definir a velocidade de lavagem de 750 mL / h para enxaguar o chip durante cerca de 10 min. As bolhas de ar nos canais de filialdeve ser lavado durante este período; Se existem bolhas restantes, ajustar manualmente a velocidade para eliminar as bolhas.

preparação de amostras de levedura.

1. Transferir 1 ml de amostra de levedura preparada _(DO600 0,6-0,8) em dois tubos de microcentrifugação de 1,5 mL e centrifuga-se durante 5 min a 3000 x g.
2. Remover a maior parte do sobrenadante de cada tubo e combinar o restante para formar uma amostra de 0,5 ml.

Pause a bomba de seringa e remover os tubos de entrada a partir do chip PDMS.

reverter manualmente a bomba de seringa para aspirar uma pequena bolha de ar (1 a 2 cm de comprimento) em cada tubo de entrada. Passar para sugar a amostra de levedura; a bolha de ar irá mostrar o limite de amostra e indicar a quantidade de amostra foi tirada.
NOTA: Evite sugar a amostra para dentro da seringa.

Inserir o tubo de entrada de volta para o chip de PDMS e reiniciar a bomba para carregar as células a uma velocidade de 750 mL / h.

Deixar a bomba de seringa em 10 minutos para an e examinar a progressão de células de carga sob o microscópio; uma carga bem sucedida, as células armadilha sob mais do que 60% de suspender pilar.

Mudar para a solução de nutrição e ajustar a velocidade de 400 mL / h para o cultivo de culas.

posições de observação selecionar para o microscópio.
NOTA: Para medições de tempo de vida, uma vez que as imagens foram tiradas a cada 15 minutos por um microscópio óptico com uma objectiva 40x. Para a análise repórter fluorescente, imagens foram tiradas a cada 15 min por um microscópio de fluorescência com um objetivo óleo de 60X.

Representative Results

Após as experiências, os tempos de vida das células e muitas fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos a partir das imagens de lapso de tempo gravado. Uma vez que há um certo número de características diferentes que podem ser extraídos a partir de cada uma das células, o primeiro passo da análise é de anotar as células e eventos, incluindo as posições e os limites das células e do calendário de vários acontecimentos que estão a ser rastreado, tal como os eventos de brotamento. Estas anotações, será mais fácil para voltar ao mesmo conjunto de células e analisar características diferentes no futuro. Utilizando software de análise de imagem, tal como ImageJ ¹¹ e os encaixes associados, uma lista de fenótipos pode então ser extraído a partir dos dados de imagem utilizando as anotações gravadas das células.

A seguir estão alguns exemplos de fenótipos medidos com o dispositivo de microfluidos. O fenótipo tempo de vida de levedurapode ser obtida através da contagem do número de gomos produzidos por cada célula mãe preso e estimar com o estimador de Kaplan-Meier. As células inicialmente presas nos dispositivos microfluídicos são de idades desconhecidas. Para minimizar o viés de medições lifespan originários a partir destas idades desconhecidos, os métodos anteriores usavam o número médio de cicatrizes bud sobre as células aprisionadas para calibrar o tempo de vida ^{4, 7.} No entanto, as medições da cicatriz broto requerem a colorao adicional de células e proporcionar apenas uma estimativa indirecta da polarização. Usando este protocolo, o dispositivo frequentemente intercepta células filhas frescos que enxertadas fora a partir de células já presas. Estas células se transformar em células-mãe. Tais células podem ser identificados usando nosso software de análise de imagem downstream (Filme 1). Estas células mãe frescos fornecer uma medida vida útil mais precisa. Como mostrado na Figura 2, as curvas de tempo de vida de células mãe frescos foram compavermelho com os das células de idade desconhecida. Nesta experiência, a esperança média de vida das células-mãe frescos era ligeiramente maior (cerca de 2 gerações de diferença no tempo de vida médio).

Além do número de gomos, outros fenótipos interessantes, tais como o intervalo de tempo entre dois eventos de brotamento sucessivas, como mostrado na Figura 3, pode ser extraída a partir dos dados de imagem ^{3, 7, 8.} Células entrou num período de brotação mais rápida após alguns mais lento germinações iniciais. O brotamento abrandou dramaticamente em direcção ao fim da sua vida útil, que indica o estado doentio destas células com idade. A dinâmica do ciclo celular contém informações muito úteis sobre o estado celular das células jovens e velhos e tem sido utilizado, por exemplo, para caracterizar os mutantes de telomerase ^12. Importante, este dispositivo pode serutilizado para medir os sinais de fluorescência ao longo do tempo de vida (Figura 4), permitindo o controlo dos marcadores moleculares, que podem ser o controlador do processo de envelhecimento.

Figura 1: um esquema de desenho do dispositivo de microfluidos. O dispositivo consiste de 6 módulos funcionais independentes, que podem operar em paralelo. Cada módulo é feito de um canal principal ligado a dois canais laterais. Cada canal lateral tem 113 colunas Pensile. Uma ponte adicional é adicionado no meio para conectar o canal principal com os dois canais laterais. células mãe são presas por baixo das colunas Pensile, enquanto as células filhas menores são lavados pelo fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: células-mãe frescas vivem mais do que as células com história desconhecida. O tempo de vida replicativo das células-mãe Fresco contra células de história desconhecida (células preso desde o início do experimento), em meio SD, 30 graus. Em média, as células mãe frescos vivem cerca de 2 gerações mais tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O comprimento de brotamento intervalos de mudanças como célula envelhecido. intervalos de brotamento medidos como intervalos de tempo entre os brotos foram codificados por cores, as células foram ordenados por seu tempo de vida de replicação, e células-mãe frescos foram setembroarated a partir de células de história desconhecida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A medição da actividade de Factor de Choque Térmico 1 (HSF1) utilizando um dispositivo de microfluidos. O repórter HSF1-actividade é construído por uma proteína fluorescente verde (GFP) fundida com um promotor CYC1 incapacitada com HSE a montante ^13. imagens de fluorescência foram tomadas a cada 30 min. Intensidade de GFP foi então quantificada usando um código MATLAB personalizado ^14. Os pontos de dados para cada única célula são ligados e indicado com uma linha colorida. Nesta experiência, a estirpe foi crescida em meio SD com 2% de glucose (p / vol) a 30 ° C durante a noite; foi, em seguida, diluída com o mesmo meio de recuperação. Depois,meio SD com 0,05% de glucose (p / v) foi utilizado para cultivar as células no chip de microfluidos durante a medição de fluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: Um exemplo de células-mãe frescas estar preso dentro do dispositivo durante toda a vida útil. O filme mostra uma célula-mãe fresca nascido de uma célula preso. A seta vermelha no início do filme marca a posição da célula mãe fresca e sua primeira brotação. Esta célula mãe estava presa no dispositivo microfluídico para toda sua vida útil. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).

Discussion

O dispositivo PDMS precisa ser feitos na hora. De outro modo, as bolhas de ar causadas pela inserção de tubos para o dispositivo irá ser difícil de remover. Etapa 3.4 é importante para melhorar a eficiência de carregamento de células por concentração das células. Para aumentar o rendimento da experiência, de 4 a 6 módulos no mesmo chip PDMS ligado a bombas que operam independentemente são normalmente utilizados para efectuar 4 a 6 experiências diferentes (diferentes estirpes ou composições de meio) simultaneamente.

Em comparação com o ensaio de envelhecimento replicativo levedura convencional (que utiliza microdissecação), o método de microfluidos aqui apresentados é menos trabalhosa e demorada. Além disso, o dispositivo de microfluidos permite a quantificação detalhada de vários parâmetros celulares e moleculares, incluindo o tamanho das células, a dinâmica do ciclo celular, a morfologia das células, e vários marcadores moleculares. Este método microfluídico alcança celular longo prazo rastreamento com microscopia de alta resolução através da retençãocélulas-mãe sob PDMS micro-pastilhas como as células filhas são liberadas automaticamente.

Este dispositivo utiliza o PDMS moles micro-pastilhas de células mãe armadilha ^4, com a estrutura básica semelhante, como Huberts et al. descrito em seu trabalho ^7. Há um número de diferenças na concepção do dispositivo e protocolos experimentais. O bloco de PDMS mais ampla no presente dispositivo permite que algumas células filhas recém-nascidos para ser preso e analisados (Figuras 2 e 3, um filme). Para identificar essas células, nós anotado as células filhas enxertadas a partir de células mãe já presos, ignorando as células filhas que Flushed Away sem brotamento. Em média, temos cerca de 2 células-mãe frescas por bloco PDMS. A proporção destas células-mãe frescos para as células de história desconhecido foi de cerca de 1: 2, entre os quais cerca de um terço foram mantidos no dispositivo para toda a vida útil. Estas células permitir uma medição de um tempo de vida mais precisod torná-lo possível analisar as correlações entre as células mãe e filha. Neste dispositivo, um canal profundo principal está ligado a dois canais laterais pouco profundas, onde as observações são feitas; este projeto ajuda a reduzir a chance dos canais laterais sendo bloqueado por bolhas de ar grandes. Para a produção de chip de microfluidos, este protocolo também utiliza um método simples para ligar os PDMS e tampa de vidro, usando apenas a exposição do plasma e cozedura em forno, o que aumenta a taxa de sucesso.

Com este protocolo, o dispositivo de microfluidos é capaz de robustamente armadilha, pelo menos, uma célula (3-5 células, em média) por almofada PDMS no início da experiência para a de tipo selvagem estirpes de levedura haplóides (isto é, BY4741 ou BY4742). Cerca de 30% das células podem ser mantidas ao longo de toda sua vida útil. Vale a pena notar que o desempenho do dispositivo de PDMS depende do tamanho da folga entre as colunas Pensile e o vidro e o tamanho das células de levedura. Para o tipo selvagem estirpes de levedura haplóides, atamanho adequado para o intervalo é 3,5-4,5 uM. Fora desta gama, a eficiência de carga e declínio taxa de retenção de células agudamente. Assim, novos dispositivos para as estirpes de levedura com tamanhos de célula muito maiores ou menores ⁷ deve ser fabricado por modificar a altura da primeira camada feita em um passo.

Em resumo, o dispositivo e o protocolo descrito neste artigo não só são adequados para estudos de envelhecimento de levedura, mas também são aplicáveis ​​para outras experiências que requerem a identificação de células mãe e a monitorização de marcadores moleculares para muitas gerações ou durante toda a vida.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B