Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll som er optimalisert for fremstilling av microfluidic chips og oppsettet av microfluidic eksperimenter for å måle levetiden og cellulære fenotyper av enkelt gjærceller.

Introduction

Spirende gjær er en kraftig modellorganisme i aldring forskning. Imidlertid kan en konvensjonell levetid analyse i gjær er avhengig av microdissection, som ikke bare er arbeidskrevende, men også lav gjennomstrømning ^{1, 2.} I tillegg vil den tradisjonelle mikrodisseksjon tilnærmingen ikke gi en detaljert oversikt over ulike cellulære og molekylære funksjoner i alenemor celler som de gamle. Utviklingen av microfluidic anordninger har muliggjort en automatisk fremgangsmåte for å måle gjær levetid, så vel som for å følge molekylære markører og forskjellige cellulære fenotyper gjennom hele levetiden av moder cellene ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Etter at gjærcellene er lastet inn i et mikrofluidteknisk enhet, kan de bli sporet under et mikroskop ved hjelp av automatiske tids rundere avbildning. Med hjelp av bildebehandlings verktøy, kan forskjellige cellulære og molekylære fenotyper ekstraheres ^{3, 6, 8,} herunder levetid, størrelse, fluorescerende rapportør, cellemorfologi, cellesyklus dynamikk, etc., hvorav mange er vanskelige eller umulige å oppnå ved hjelp den tradisjonelle mikrodisseksjon metoden. Microfluidic enheter har fått fremtredende i gjær aldring forskning siden deres vellykkede utviklingen for noen år siden ^{3, 4, 6, 7.} Flere grupper har senere publisert på variasjoner av tidligere design ^5, og mange gjær laboratorier har ansatt microfluidic enheter for sin studie.

I en cellekultur under eksponentiell vekst, antall eldre mor celler som er tilgjengelige for observasjon er miniscule. Derfor er det generelle prinsipp av den mikrofluidinnretningen for levetids målinger er å bibeholde moderceller og for å fjerne datterceller. En slik utførelser gjør bruk av det faktum at gjæren underkastes asymmetrisk celledeling. Strukturene i enhets vil fange større moderceller og tillater mindre datterceller for å bli vasket bort. Microfluidic chip som er beskrevet i denne artikkelen, benytter en myk polydimetylsiloksan (PDMS) pute (vertikale pensile kolonner) for å felle mor-celler (figur 1). Anordninger av lignende konstruksjon er rapportert i tidligere ^{3, 4, 6, 7.} Denne protokollen bruker en enklere prosedyre for å fremstille microfluidic enheter og en enkel celle-lasting metode som er optimalisert for time-lapse bildebehandling eksperimenter. En av de viktigste parametre i mikrofluidinnretningen er bredden av PDMS elektrodene som brukes for å felle moderceller. vår device bruker bredere puter som kan holde flere moder cellene under hver blokk, inkludert en betydelig andel av frisk moderceller som kan spores gjennom hele levetiden. I tillegg til levetid, der målingene, er denne protokollen nyttig for enkelt celle på tidsintervaller bildebehandling eksperimenter når cellene må spores i mange generasjoner, eller når en observasjon gjennom hele levetiden er nødvendig.

Protocol

1. Silicon Wafer Mold Fabrication

MERK: Fotomasken er designet med AutoCAD og produsert av et kommersielt selskap. Denne konstruksjonen inneholder tre lag med forskjellige mønstre ( Supplerende File 1 ). Høydene av de første, andre, og tredje lag er ca. 4 pm, 10 pm og 50 pm, respektivt. Silikonplaten Formen ble opprettet fra fotomasken ved hjelp av myklitografi ^{9, 10.}

1. Bake en silisiumskive ved 200 ° C i 10 minutter for å fordampe vanndampen. Spinn belegge negative fotoresist-SU-8 på silikonplaten.
   MERK: Spin coat SU-8 3005 ved 5000 opm i 30 s for å frembringe det første sjikt, SU-8 2,010 ved 3000 opm i 30 s for å generere det andre lag, og SU-8 3025 ved 2000 opm i 30 s for å generere tredje lag.
2. Soft-bake den belagt skive før tHan mønster overføring. Juster og eksponere skiven i "direkte kontakt" modus ved hjelp av en maske aligner.
   MERK: Myk-bake skiven i 2 minutter ved 95 ° C for det første lag, 3 min ved 95 ° C i det andre laget, og 15 minutter ved 95 ° C i det tredje laget. Bruk eksponeringsdose på 100 mJ / cm ² for det første lag, 130 mJ / cm ² for det andre lag, og 200 mJ / cm ² for det tredje lag.
3. Etter eksponering, post-bake kjeks og utvikle den ved hjelp av SU-8 utvikler. Tørk skiven ved hjelp av en _N2 pistol og hardt-bake skiven ved 200 ° C i 30 min.
   MERK: silikonplaten formen er festet til en 15 cm diameter petriskål av plast ved hjelp av limbånd, med mønstersiden vendt opp. Vanligvis setter vi flere identiske chip strukturer på samme støpeform, noe som gjør at flere microfluidic brikker som skal fremstilles samtidig. Hver form kan brukes om igjen mange ganger for å fremstille microfluidic chips.

2. microfluidicchip Fabrication

1. Plasser en ren veier båt på en balanse og kalibrer vekten. Hell 50 g av PDMS base til den veie båten.
2. Tilsett 5 g av PDMS herder til veie båt (vekt / vekt forhold på 1:10 til PDMS base).
   MERK: Dette volum er basert på en 15 cm diameter petriskål med formen. Justere mengden av reagens ved bruk av en petriskål med en annen størrelse.
3. Omrør PDMS basis og herdemidlet med en engangspipette. Start fra kanten av veier båten og sakte bevege seg innover. Omrør grundig i flere minutter inntil det dannes små bobler gjennom blandingen; grundig blanding er viktig for PDMS polymerisasjon.
4. Hell blandingen langsomt inn i petriskål; blandingen må fullstendig dekke silikonplaten formen.
5. Sett petriskål i et vakuum i 10 minutter for å fjerne alle luftbobler fra PDMS blanding. Hvis det dannes bobler forblir på overflaten av blandingen ved å bruke en pipette for å blåse dem ut.
6. Inkuber silisiumwafer støpeform med PDMS i en ovn ved 75 ° C i ca. 2 timer.
7. Forsiktig skrelle sjiktet av polymeriserte PDMS utenfor silikonplaten støpeformen, å unngå eventuell skade på konstruksjonen av skiven formen. Alternativt kan kutte PDMS direkte fra silikonplaten formen med et minimum 5 mm margin rundt mønster ved hjelp av en enkelt-kant industriell barberblad; forsiktig skrelle PDMS lag utenfor skiveformen.
8. Plasser PDMS lag på benken med mønstersiden vendt opp. Forsiktig kuttet ut den enkelte brikke med en enkelt kant industriell barberblad, og beholder en tilstrekkelig margin fra kanten av hver enkelt brikke for å unngå skade på konstruksjonen.
9. Med mønstersiden vendt opp, bruke en dor penn (0,75 mm ID) for å slå hull rett ned gjennom innløps- og utløps sirkler på hver side av kanalene.
   MERK: Disse hull danner reaksjonsveien for strømmen av mediet. Derfor er det viktig å gå gjennom sirklene og punch hele veien gjennom den PDMS lag. Sørg for åfjerne PDMS kolonnene fra hullet.
10. Sjekk hvert slo hull ved å sette trøkk nål igjen i hullet. Sørg for at nålen kan komme ut fra den andre siden, noe som indikerer at det ikke er blokkert. Påfør bånd til mønsteret overflate, deretter forsiktig løsner båndet for å rense støvpartikler. Gjenta dette trinnet minst tre ganger. Legg igjen en ren stykke teip på PDMS å opprettholde sterilisering.
11. Gjenta denne prosedyren på motsatt side av PDMS og la den siste stykke tape på også.
12. Fremstill en 24 mm x 30 mm dekkglass med en tykkelse på 0.13-0.17 mm. Spray 70% etanol på glasset og tørk med støvfjerner for å sterilisere overflaten; i tillegg, kan glasset vaskes med autoklavert vann og tørket med støvfjerner.
13. Overfør dekkglasset og PDMS til en plastplate. Fjern teip fra PDMS og plassere mønsteret siden opp. Unngå kontakt med mønsteret overflaten under overføringen.
14. Plasser forsiktig PDMS på dekkglasset, som forbinder begge hydrofile flater (de flater som står overfor opp under plasmabehandlingen). Pass på at det ikke er luftbobler mellom PDMS og dekkglass.
15. Inkuber PDMS brikken i en ovn ved 75 ° C i minst 2 timer.
    MERK: Mangelmikrovæsker kan forårsake væskelekkasje ut på mikroskop under forsøket. Derfor er det viktig å undersøke bindingen mellom PDMS og dekkglass ved å løfte PDMS fra kantene med pinsett. Forsiktig løfte PDMS bør ikke skille den fra dekkglasset, som indikerer en vellykket binding.

3. Forberedelse til eksperimentet

1. Senk inngangs- og utgangsrørene i 70% etanol-løsning for seg en dag før PDMS chip preparat.
2. Fyll en 5 ml sprøyte med autoklavert vann for å vaske rørene. Vask hvert rør ved å plugge røret på sprøyten og skylling av røret med vann.
3. Gjenta vasketrinn minst 3 ganger for å rengjøre etanol rest.

Undersøk PDMS kanaler under et optisk mikroskop med et 10X objektiv for å sørge for at konstruksjonen er konsistent og intakt. Stabilisere PDMS-brikken på mikroskopet plattformen ved hjelp av teip.
MERK: Lag flere chips på en gang i trinn 2 for å sikre at det finnes backup chips, spesielt hvis du gjør enheten for første gang.

Fyll en 5 ml sprøyte med autoklavert vann. Feste sprøyten til en sprøytepumpe og sette inn de tilsvarende inngangs- og utgangsrørene. Sett vaskehastigheten til 750 pl / t for å skylle brikken i omtrent 10 min. Luftboblene i grenkanalenemå vaskes bort i løpet av denne perioden; hvis det er gjenværende bobler, manuelt justere hastigheten for å fjerne boblene.

Gjær prøvepreparering.

1. Overføring 1 ml fremstilte gjær prøven _(OD600 0,6-0,8) i to 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger i 5 minutter ved 3000 x g.
2. Fjern mesteparten av supernatanten fra hvert rør og kombinere resten for å danne en 0,5 ml prøve.

Pause sprøytepumpen og fjerne det innførte rør fra PDMS-brikken.

omvendt manuelt sprøytepumpe for å suge en liten luftboble (1 til 2 cm i lengde) i hvert inngangs rør. Gå videre for å suge i gjær prøven; luftboblen vil vise prøven grensen og indikere hvor mye prøven har blitt trukket.
MERK: Unngå å suge prøven i sprøyten.

Sett inngangsrøret tilbake inn i PDMS brikken og starter pumpen for å laste cellene ved en hastighet på 750 pl / t.

La sprøyten pumpe på i 10 minutter in og undersøke cellelasten progresjon under mikroskop; en vellykket lasting vil felle celler under mer enn 60% av suspen søyle.

Bytt til næringsoppløsning og justere hastigheten til 400 pl / t for celledyrking.

Velg observasjon posisjoner i mikroskop.
NB: For levetid, der målingene, bilder ble tatt en gang hvert 15 min med et optisk mikroskop med et 40x objektiv. For det fluorescerende rapportør analysen ble bildene tatt hvert 15. min med et fluorescens mikroskop med et 60X objektiv olje.

Representative Results

Etter forsøkene, kan levetid for cellene og mange cellulære og molekylære fenotyper ekstraheres fra de registrerte tids-lapse bilder. Siden det er en rekke forskjellige funksjoner som kan ekstraheres fra hver celle, er det første trinnet av analysen er å kommentere cellene og hendelser, blant posisjonene og grensene til cellene og tidspunktene for ulike hendelser som blir sporet, slik som de spirende hendelser. Disse kommentarene vil gjøre det lettere å gå tilbake til det samme settet av celler og analysere ulike funksjoner i fremtiden. Ved hjelp av bildeanalyse-programvare, slik som ImageJ ¹¹ og de tilhørende plugg, kan en liste over fenotyper deretter ekstraheres fra bildedataene ved hjelp av de registrerte markeringer på cellene.

Det følgende er noen eksempler på fenotyper som ble målt med mikrofluidinnretningen. Levetiden fenotypen av gjærkan oppnås ved å telle antallet av knopper som frembringes av hvert fanget mor celle og estimere med Kaplan-Meier-estimator. Cellene i utgangspunktet fanget i microfluidic enhetene er ukjente aldre. For å minimere belastningen av levetids målinger som stammer fra disse ukjente alderen, tidligere metoder anvendes det gjennomsnittlige antall av knoppen arr på den innfangede celler for å kalibrere levetid ^{4, 7.} Imidlertid knopp arr målinger krever ytterligere farging av celler og gir bare en indirekte beregning av forspenningen. Ved hjelp av denne protokollen, enheten feller ofte friske datterceller som knoppskutte ut fra allerede fanget celler. Disse cellene deretter slå inn mors celler. Slike celler kan bli identifisert ved hjelp av nedstrømsbildeanalyseprogramvare (Film 1). Disse nye modercellene tilveiebringe en mer nøyaktig måling levetid. Som vist i figur 2, levetiden kurver av frisk moderceller ble selrød med de av cellene i ukjent alder. I dette eksperimentet, gjennomsnittlig levetid for de ferske mor cellene var litt lenger (ca 2 generasjoner av forskjellen i median levetid).

I tillegg til antallet av knopper, andre interessante fenotyper, slik som tidsintervallet mellom to suksessive spirende hendelser, som vist i figur 3, kan trekkes ut fra avbildningsdataene ^{3, 7, 8.} Celler angitt en periode med hurtigere spirende etter noen få langsommere innledende buddings. Den spirende avtok dramatisk mot slutten av sin levetid, noe som indikerer usunn tilstand hos disse alderen celler. Cellecyklus dynamikk de inneholder meget nyttig informasjon angående celletilstanden av de unge og gamle celler og har vært brukt, for eksempel, for å karakterisere telomerase mutanter ^12. Viktigere, kan denne enheten værebrukes til å måle fluorescens-signaler i løpet av levetiden (figur 4), slik at for sporing av molekylære markører som kan være føreren av aldringsprosessen.

Figur 1: En skjematisk fremstilling av konstruksjonen av mikrofluidinnretningen. Enheten består av 6 uavhengige funksjonelle moduler som kan operere i parallell. Hver modul består av en hovedkanal koblet til to sidekanaler. Hver side kanal har 113 pensile kolonner. En ytterligere bro tilsettes i midten for å forbinde hovedkanalen sammen med de to sidekanaler. Mor-celler er fanget under pensile kolonnene, mens de mindre dattercellene blir vasket bort av strømningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Friske mor cellene lever lenger enn celler med ukjent historie. Den replikative levetid av friske moder celler versus celler av ukjent historie (celler innfanget fra begynnelsen av eksperimentet) på SD-medium, 30 grader. I gjennomsnitt, frisk mor celler lever omtrent to generasjoner lenger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Lengden av spirende intervaller endringer som celle alderen. Spirende intervaller målt som tidsrammer mellom buddings var fargekodet, cellene ble bestilt av deres replikasjon levetid, og frisk moderceller ble septemberarated fra celler av ukjent historie. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Måling av aktiviteten av varmesjokkfaktor 1 (HSF1) ved anvendelse av en mikrofluidteknisk innretning. Den Hsf1-aktivitet reporter er konstruert av et grønt fluorescerende protein (GFP) fusjonert til en forkrøplet CYC1 promoter med HMS oppstrøms ^13. Fluorescens bildene ble tatt hver 30 min. GFP intensitet var da kvantifisert ved hjelp av en tilpasset MATLAB kode ^14. Datapunkter for hver enkelt celle er tilkoblet og indikert med en farget linje. I dette eksperimentet, ble stammen dyrket i SD-medium med 2% glukose (vekt / volum) ved 30 ° C over natten; Den ble deretter fortynnet med det samme medium for utvinning. Etterpå,SD-medium med 0,05% glukose (vekt / volum) ble brukt til å dyrke cellene i mikrofluid brikken under fluorescens-målingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Film 1: Et eksempel på frisk moder celler å bli fanget inne i innretningen for hele levetiden. Filmen viser en fersk mor celle født fra en fanget celle. Den røde pilen i begynnelsen av filmen markerer posisjonen til frisk mor cellen og dens første spirende. Denne moren cellen ble fanget i mikrofluidanordning for hele sin levetid. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

PDMS enheten må være rykende fersk. Ellers vil luftboblene som forårsakes ved innføring av rør i anordningen være vanskelig å fjerne. Trinn 3.4 er viktig for å forbedre den celle-innføring effektiviteten ved å konsentrere cellene. For å øke gjennomstrømningen av forsøket, 4 til 6 moduler på den samme brikke PDMS koblet til uavhengig drift av pumper er vanligvis brukes til å utføre 4 til 6 forskjellige forsøk (forskjellige stammer eller Sammensetningen av mediene) samtidig.

Sammenlignet med den konvensjonelle gjær replikative aldring assay (som bruker microdissection), idet mikrofluidfremgangsmåten som presenteres her er mindre arbeidskrevende og tidkrevende. Videre lar mikrofluidinnretningen for den detaljerte kvantifisering av forskjellige cellulære eller molekylære parametre, innbefattende cellestørrelse, cellesyklus dynamikk, cellemorfologi, og forskjellige molekylmarkører. Denne mikrofluid metode oppnår langvarig celle sporing med høy oppløsning mikroskopi ved å beholdemors celler under PDMS mikro pads som dattercellene blir spylt automatisk.

Denne innretning benytter myke PDMS mikroputer for å felle moderceller ^4, med den grunnleggende struktur lignende, som Huberts et al. beskrev i sitt arbeid ^7. Det finnes en rekke forskjeller i enhets utforming og eksperimentelle protokoller. Den bredere PDMS puten i denne innretning tillater visse nyfødte datterceller å bli fanget og analysert (figurene 2 og 3, filmen 1). For å identifisere slike celler, kommenterte vi dattercellene knoppskutte fra allerede fanget mors celler, ignorerer dattercellene som skylles bort uten spirende. I gjennomsnitt, vi fikk ca to friske mors celler per PDMS pad. Forholdet mellom disse frisk moder celler til celler av ukjent historie var omtrent 1: 2, hvorav en tredjedel var holdt i anordningen for hele levetiden. Disse celler tillater en mer nøyaktig måling av en levetidd gjør det mulig å analysere sammenhengen mellom mor og datter-celler. I denne anordning blir en dypere hovedkanal forbundet med to grunnere sidekanaler, hvor det foretas observasjoner; dette design bidrar til å redusere sjansen for sidekanalene blir blokkert av store luftbobler. For mikrofluid chip produksjon, bruker denne protokoll også en enkel metode for å binde PDMS og dekkglass, bare ved hjelp av plasmaeksponering og ovn baking, noe som øker den suksessrate.

Med denne protokollen, er den mikrofluidinnretningen i stand til å robust felle i det minste en celle (3-5 celler i gjennomsnitt) per PDMS puten ved begynnelsen av eksperimentet for vill-type haploid gjærstammer (dvs. BY4741 eller BY4742). Omtrent 30% av cellene kan beholdes gjennom hele sin levetid. Det er verdt å merke seg at utførelsen av PDMS-enheten avhenger av gapstørrelsen mellom pensile søyler og glasset og størrelsen av gjærcellene. For villtype haploide gjærstammer, jopassende størrelse for gapet er 3,5-4,5 mikrometer. Utenfor dette området, last effektivitet og selvretensjon hastighet avta kraftig. Derfor må nye anordninger for gjærstammer med mye mindre eller større cellestørrelser ⁷ fremstilles ved å endre høyden av det første lag som er fremstilt i trinn 1.

Oppsummert, den anordning og protokollen som er beskrevet i denne artikkelen, er ikke bare egnet for gjær eldingsstudier, men er også anvendelig for andre forsøk som krever sporing av moderceller og overvåking av molekylære markører for mange generasjoner eller hele levetiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B