Summary
Данная статья представляет собой протокол, оптимизированный для производства чипов микрофлюидальных и настроек микрофлюидальных экспериментов для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов одиночных дрожжевых клеток.
Introduction
Баддинги дрожжей является мощной моделью организмом в исследовании старения. Однако традиционный анализ продолжительности жизни дрожжей зависит от микродиссекции, который является не только трудоемкий , но и низкой пропускной способностью 1, 2. Кроме того, традиционная микродиссекция подход не дает детальное представление о различных клеточных и молекулярных особенностях в отдельных материнские клетках, поскольку они стареют. Развитие микрофлюидальных устройств позволило автоматизированную процедуру для измерения дрожжей срока службы, а также , чтобы следовать молекулярным маркерам и различные клеточные фенотипам в течение всего срока службы материнских клеток 3, 4, 5, 6, 7, 8. После того, как клетки дрожжей загружаются в микрожидкое устройство, они могут быть отслежены под микроскопом с помощью автоматических временных кругове изображений. С помощью визуализации инструменты обработки, различные клеточные и молекулярные фенотипы могут быть извлечены 3, 6, 8, в том числе срока службы, размера, флуоресцентный репортера, клеточной морфологии, динамики клеточного цикла, и т.д., многие из которых трудно или невозможно получить , используя традиционный метод микродиссекции. Микрофлюидальные устройства приобрели широкую известность в научных исследованиях дрожжей старения , так как их успешного развития несколько лет назад 3, 4, 6, 7. Несколько группы впоследствии опубликованы на вариации предыдущих конструкций 5, и многие дрожжевые лаборатории использовали микрожидкостные устройства для их изучения.
В культуре клеток, подвергающейся экспоненциальный рост, число пожилых материнских клеток, которые доступны для наблюдения miniscuле. Таким образом, общий принцип конструкции микрожидкостных устройства для измерения продолжительности жизни является сохранением материнских клеток и удалить дочерние клетки. Одним из таких конструкций используют тот факт, что дрожжи подвергается асимметричному делению клеток. Структуры в устройстве поглотит крупные материнские клетки и позволяют более мелкие дочерние клетки должны быть смыты. Микрожидкостный чип описан в этой статье используется мягкая полидиметилсилоксан (PDMS) подкладки (вертикальные столбцы Pensile) для улавливания материнских клеток (рис 1). Устройства аналогичной конструкции были ранее сообщалось 3, 4, 6, 7. Этот протокол использует более простую процедуру для изготовления микрожидкостных устройств и простого метода клеточной загрузки, который оптимизирован для экспериментов визуализации покадровых. Одним из ключевых параметров в микрофлюидальном устройстве ширин PDMS прокладок, используемых для ловушки материнских клеток. Наш device использует более широкие подушечки, которые могут держать больше маточных клеток в каждой площадке, в том числе значительной части свежих материнских клеток, которые можно отслеживать на протяжении всей их жизни. В дополнении к измерениям продолжительности жизни, этот протокол является полезным для экспериментов визуализации одной клетки покадровых когда клетки должны быть отслежены в течение многих поколений, или когда наблюдение в течение всего срока службы необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Кремний вафельные Mold Fabrication
Примечание: фотошаблон разработан с программным обеспечением AutoCAD и производством коммерческой компанией. Эта конструкция состоит из трех слоев различных шаблонов ( Дополнительный File 1 ). Высоты первого, второго, и третьего слоев около 4 мкм, 10 мкм и 50 мкм, соответственно. Кремниевая пластина пресс - форма была создана из фотошаблона , используя мягкую литографию 9, 10.
- Испечь кремниевую пластину при 200 ° С в течение 10 мин для испарения водяного пара. Спин покрытие негативного фоторезиста СУ-8 на кремниевой пластине.
Примечание: Спин покрытие СУ-8 3005 при 5000 оборотах в минуту в течение 30 с, чтобы генерировать первый слой, СУ-8 2010 при 3000 оборотах в минуту в течение 30 с, чтобы создать второй слой, и SU-8 3025 при 2000 оборотах в минуту в течение 30 секунд, чтобы генерировать третий слой. - Мягкая выпекать пластины с нанесенным покрытием до тон перенос рисунка. Выравнивание и подвергать пластины в режиме «прямой контакт» с использованием маски выравнивателя.
Примечание: Soft-выпекать пластины в течение 2 мин при 95 ° С в течение первого слоя, 3 мин при 95 ° C для второго слоя и 15 мин при 95 ° С в течение третьего слоя. Используйте дозу облучения при 100 мДж / см 2 для первого слоя, 130 мДж / см 2 для второго слоя и 200 мДж / см 2 для третьего слоя. - После экспозиции, после выпекать пластины и развивать его с помощью SU-8 проявителя. Сушат пластины с использованием N 2 пистолета и трудно выпекать пластины при 200 ° С в течение 30 мин.
Примечание: кремниевая пластина форма прикреплена к 15 см диаметр пластиковой чашки Петри с помощью скотча, с боковым узором лицевой стороны вверх. Как правило, мы помещаем несколько структур идентичны чип на одной и той же пресс-форме, что позволяет несколько микрофлюидные чипы, которые будут изготовлены в то же самое время. Каждая форма может быть повторно использована много раз, чтобы изготовить микрофлюидальных чипы.
2. микрожидкостныхЧип Fabrication
- Поместите чистый вес лодку на весах и тарирование. Залить 50 г PDMS основания в взвешивании лодки.
- Добавляют 5 г PDMS отвердителя на взвешивании лодки (вес / вес соотношении 1:10 к основанию PDMS).
Примечание: Этот объем основан на 15 см диаметра чашки Петри с формой. Регулировка количества реагента при использовании чашки Петри другого размера. - Перемешать основание PDMS и отвердитель с одноразовой пипеткой. Начните с краями взвешенной лодочки и медленно двигаться внутрь. тщательно перемешать в течение нескольких минут, пока маленькие пузырьки не образуются по всей смеси; тщательное перемешивание имеет важное значение для полимеризации PDMS.
- Поток смесь медленно в чашку Петри; смесь должна полностью покрыть кремниевую пластину пресс-форму.
- Поместите чашку Петри в вакууме в течение 10 мин, чтобы удалить все пузырьки воздуха из смеси PDMS. Если пузырьки остаются на поверхности смеси, с помощью пипетки, чтобы взорвать их.
- Инкубируйте кремнийпластины пресс-формы с PDMS в печи при 75 ° С в течение приблизительно 2 ч.
- Аккуратно очистить слой полимеризованных PDMS отходящих от кремниевой пластины пресс-формы, избегая любого повреждения конструкции пластин пресс-формы. В качестве альтернативы, вырезать PDMS непосредственно из кремниевой пластины пресс-формы с минимальным запасом 5 мм вокруг рисунка с использованием одного края промышленного лезвия бритвы; осторожно очистить слой PDMS выключения вафельной формы.
- Поместите слой PDMS на скамье с боковым узором лицевой стороны вверх. Тщательно вырезать отдельный чип с одним краем промышленной лезвием бритвы, сохраняя достаточный запас прочности от края каждого одного чипа, чтобы избежать повреждения конструкции.
- С бокового шаблоном лицевой стороны вверх, использовать пуансон ручку (0,75 мм ID) для пробивки отверстий прямо вниз через входные и выходные круги на каждой стороне каналов.
Примечание: Эти отверстия создают пути для потока среды. Поэтому крайне важно, чтобы пройти через круги и удар весь путь через слой PDMS. Убедись вудалить столбцы PDMS из отверстия. - Проверьте каждую пробитое отверстие, вставив удар пера иглу снова в отверстие. Убедитесь, что игла может выйти с другой стороны, указывая, что нет закупорки. Нанесите ленту на поверхность шаблона, затем аккуратно снимите пленку для очистки частиц пыли. Повторите этот шаг, по крайней мере в три раза. Оставьте чистый кусок скотча на PDMS для поддержания стерилизации.
- Повторите эту процедуру на противоположной стороне PDMS и оставить последнюю часть ленты на а.
- Подготовка 24 мм х 30 мм покровного стекла с толщиной 0.13-0.17 мм. Спрей 70% этанола на стекле и насухо для удаления пыли, чтобы стерилизовать поверхность; Кроме того, стекло может быть промыто автоклавной водой и сушит для удаления пыли.
- Передача покровного стекла и PDMS к пластиковой пластине. Снимите липкую ленту с PDMS и положите шаблон лицевой стороной вверх. Избегать контакта с поверхностью шаблона во время передачи.
- Осторожно поместите PDMS на покровное стекло, соединяя обе гидрофильные поверхности (поверхности, которые, с которыми сталкиваются в ходе плазменной обработки). Убедитесь, что нет пузырьков воздуха между PDMS и покровным стеклом.
- Инкубируйте чип PDMS в сушильном шкафу при 75 ° С в течение по меньшей мере 2 ч.
Примечание: Дефектные микрофлюидики могут привести к утечке жидкости в микроскоп во время эксперимента. Поэтому важно, чтобы проверить связь между PDMS и покровного стекла, слегка поднимая PDMS от краев с помощью пинцета. Осторожно поднимая PDMS не должен отделить его от покровного стекла, что указывает на успешную связь.
3. Подготовка к эксперименту
- Submerge входные и выходные трубы в 70% растворе этанола отдельно за 1 день до получения чипа ПДМС.
- Заполните 5-мл шприц с автоклавной водой, чтобы промыть трубы. Промыть каждую пробирку, подключив трубку на шприц и промывки трубки с водой.
- Повторите стадии промывки по крайней мере, 3 раза, чтобы очистить остаток этанола.
Примечание: Сделайте несколько фишек за один раз в шаге 2, чтобы гарантировать, что есть резервные чипы, особенно если сделать устройство в первый раз.
- Передача 1 мл подготовленного образца дрожжей (OD 600 0,6-0,8) на две 1,5-мл микроцентрифужных пробирках и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 х г.
- Удалить большинство супернатанта из каждой пробирки и объединяют остаток с образованием пробы 0,5 мл.
Примечание: Во избежание всасывания образца в шприц.
Примечание: Для измерения продолжительности жизни, снимки были сделаны один раз каждую 15 мин с помощью оптического микроскопа с 40x объективом. Для флуоресцентного анализа репортера, изображения были взяты один раз каждые 15 мин с помощью флуоресцентного микроскопа с целью 60X нефти.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После экспериментов продолжительность жизнь этих клеток и многих клеточных и молекулярных фенотипов может быть извлечена из записанных изображений покадровых. Поскольку существует целый ряд различных функций, которые могут быть извлечены из каждой ячейки, первый шаг анализа состоит в том, чтобы аннотировать клетки и событие, в том числе положений и границ ячеек и синхронизации различных событий, которые отслеживаются, например как многообещающие события. Эти аннотации облегчат возвращаться к одной и той же совокупности ячеек и анализировать различные возможности в будущем. С помощью программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ 11 и связанные с ними плагин, список фенотипов затем может быть извлечен из данных изображения , используя записанные аннотации клеток.
Ниже приведены несколько примеров фенотипов, измеренных с микрофлюидальным устройством. Продолжительность жизни фенотип дрожжейможет быть получено путем подсчета числа бутонов, произведенных каждой захваченной материнской клеткой и оценки с оценкой Каплана-Мейер. Клетки изначально попавшие в микрофлюидальных устройствах неизвестных возрастов. Для того, чтобы свести к минимуму смещения измерений продолжительности жизни , происходящим из этих неизвестных возрастов, предыдущие методы использовали среднее число бутонов рубцов на запертые клетки , чтобы откалибровать срок службы 4, 7. Однако измерения бутона рубца требуют дополнительного окрашивания клеток и обеспечивают лишь косвенное оценку смещения. Используя этот протокол, устройство часто подстерегает свежие дочерние клетки расцветших от из уже захваченных клеток. Затем эти клетки превращаются в материнские клетки. Такие клетки могут быть идентифицированы с помощью нашего вниз по течению программного обеспечения для анализа изображений (Movie 1). Эти свежие материнские клетки обеспечивают более точное измерение продолжительности жизни. Как показано на рисунке 2, продолжительность жизни кривые свежих материнских клеток были комкрасный с теми клетками неизвестного возраста. В этом эксперименте, средняя продолжительность жизни свежих материнских клеток была немного больше (около 2 поколений разницы в средней продолжительности жизни).
В дополнении к числу бутонов, других интересных фенотипы, такие как интервал времени между двумя последовательными многообещающими событиями, как показан на рисунке 3, может быть извлечено из данных изображений , 3, 7, 8. Клетки вступили в период бутонизации быстрее следующий несколько медленнее начального buddings. Почкованием замедлилось резко к концу их жизни, что указывает на нездоровое состояние этих клеток в возрасте. Динамика клеточного цикла содержит очень полезную информацию о клеточном состоянии молодых и старых клеток и используется, например, для характеристики теломеразы мутантов 12. Важно отметить, что это устройство может бытьиспользуется для измерения сигналов флуоресценции в течение всего срока службы (Рисунок 4), что позволяет для отслеживания молекулярных маркеров , которые могут быть водителем процесса старения.
Рисунок 1: Схема конструкции микрофлюидального устройства. Устройство состоит из 6 независимых функциональных модулей, которые могут работать параллельно. Каждый модуль состоит из одного основного канала, подключенного к двум боковым каналам. Каждый боковой канал имеет 113 Pensile столбцов. Дополнительный мост добавляется в середине, чтобы соединить основной канал с двумя боковыми каналами. Матери клетки в ловушке под Pensile колонн, в то время как более мелкие дочерние клетки смываются потоком. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Свежие материнские клетки живут дольше , чем клетки с неизвестной историей. Репликативная продолжительность жизни свежих материнских клеток по сравнению с клетками неизвестной истории (клетки в ловушке с самого начала эксперимента) в SD СМИ, 30 градусов. В среднем, свежие материнские клетки живут около 2 поколения дольше. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Длина почкования интервалов изменения в клетку в возрасте. Многообещающие интервалы, измеренные, как временные рамки между buddings были цвет, клетки были упорядочены по их продолжительности жизни репликации, а также свежие материнские клетки были Сентябремклеток, удаленных от неизвестной истории. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Измерение активности фактор теплового шока 1 (HSF1) с использованием микрожидкостных устройств. HSF1-активность репортера построена по зеленым флуоресцентным белком (GFP) , слитый с искалеченной CYC1 промотора с HSE выше по течению 13. Флуоресцентные изображения были сделаны через каждые 30 мин. Интенсивность GFP затем количественно , используя пользовательский код 14 MATLAB. Точки данных для каждой отдельной ячейки соединены между собой и обозначаются цветной линией. В этом эксперименте штамм выращивали в среде SD с 2% глюкозы (вес / объем) при температуре 30 ° С в течение ночи; затем разбавли ли ту же среду для восстановления. После этого,SD-среду с 0,05% глюкозы (вес / объем) был использован для выращивания клеток в микрофлюидальной чипа во время измерения флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1: Пример свежих материнских клеток в ловушку внутри устройства в течение всего срока службы. Фильм показывает свежий мать клетку рожденной из захваченной клетки. Красная стрелка в начале фильма отмечает положение свежей материнской клетки и ее первой бутонизации. Эта материнская клетка была поймана в микрофлюидальном устройстве для всей его жизни. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устройство ПДМСА должно быть свежеприготовленным. В противном случае, пузырьки воздуха, вызванные вставки трубы в устройство будет трудно удалить. Шаг 3.4 имеет важное значение для повышения эффективности нагрузки сотовой ячейки путем концентрации клеток. Для того, чтобы увеличить пропускную способность эксперимента, от 4 до 6 модулей на одном чипе PDMS соединены с независимо друг от друга, работающие насосы, как правило, используются для выполнения от 4 до 6 различных экспериментов (различные штаммы или медиа-композиции) одновременно.
По сравнению с обычным дрожжевым репликативным анализом старения (который использует микродиссекцию), Микрожидкостные методы, представленные здесь, является менее трудоемкой и занимает много времени. Кроме того, устройство позволяет Микрожидкостному для детальных количественного анализа различных клеточных или молекулярных параметров, включая размер клеток, динамики клеточного цикла, морфологии клеток и различные молекулярные маркер. Этот метод Микрожидкостный достигает долгосрочное отслеживание клетки с микроскопией высокого разрешения, сохраняяматеринские клетки под PDMS микро подушечек как дочерние клетки сбрасываются автоматически.
Это устройство использует мягкий PDMS микро-подушечку , чтобы ловушка материнских клетки 4, с основной структурой , аналогичной, как Huberts и соавт. описал в своей работе 7. Есть целый ряд различий в конструкции прибора и экспериментальных протоколов. Шире ПДМС колодка в этом устройстве обеспечивает некоторые новорожденные дочерние клетки в ловушке и анализировали (фиг.2 и 3, Movie 1). Для того, чтобы идентифицировать такие клетки, мы аннотированные дочерние клетки расцветших из уже захваченных материнских клеток, игнорируя дочерние клетки, которые смываются без почкования. В среднем, мы получили около 2 свежих маточных клеток на PDMS площадки. Соотношение этих свежих материнских клеток к клеткам неизвестной истории было около 1: 2, среди которых около одной трети были сохранены в устройстве для всей продолжительности жизни. Эти клетки позволяют более точно измерение продолжительности жизниd позволяет анализировать корреляции между материнской и дочерними клетками. В этом устройстве, более глубокий основной канал подключен к двум неглубоким боковым каналам, где производится наблюдение; эта конструкция помогает снизить вероятность побочных каналов, заблокированный большими пузырьками воздуха. Для микрофлюидального производства микросхем, этот протокол также использует простой метод для скрепления PDMS и покровного стекла, только с помощью воздействия плазмы и печи выпечки, что увеличивает вероятность успеха.
С помощью этого протокола, Микрожидкостное устройство способно робастно ловушки , по меньшей мере одну ячейки (3-5 клеток в среднем) в расчет на PDMS площадки в начале эксперимента для дикого типа гаплоидных штаммов дрожжей (например, BY4741 или BY4742). Около 30% клеток могут быть сохранены в течение всей их жизни. Стоит отметить, что производительность устройства PDMS зависит от величины зазора между Pensile колоннами и стекла и размера клеток дрожжей. Для гаплоидных штаммов дрожжей дикого типа,подходящий размер для зазора 3,5-4,5 мкм. За пределами этого диапазона, эффективность загрузки и снижение скорости удержания клеток резко. Таким образом, новые устройства для дрожжевых штаммов с гораздо больших или меньших размеров ячеек 7 должны быть изготовлены путем изменения высоты первого слоя , выполненного на шаге 1.
Таким образом, устройство и протокол, описанное в этой статье не пригодны только для исследований дрожжей старения, но также применимы к другим экспериментам, которые требуют отслеживания материнских клеток и мониторинга молекулярных маркеров для многих поколений или в течение всего срока службы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Pure Ethanol, Koptec | VWR | 64-17-5 | |
| Whoosh-Duster™ | VWR | 16650-027 | |
| 5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip) | Becton, Dickinson and Company | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028) | Component Supply Company | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | Component Supply Company | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | Fisher Scientific | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
