Summary
Her beskriver vi opsætningen, software navigation, og dataanalyse for et rumligt og tidsligt nøjagtig metode til måling tonic og fasiske ekstracellulære glutamat ændringer in vivo ved anvendelse af enzymbundne mikroelektrodepositionerne arrays (MEA).
Abstract
Neurotransmitter forstyrrelser er ofte en vigtig del af sygdomme i centralnervesystemet (CNS), spiller en rolle i patologien bag Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, depression og angst. Traditionelt har mikrodialyse været den mest almindelige (rost) teknik til at undersøge neurotransmitter forandringer, der sker i disse lidelser. Men fordi mikrodialyse har evnen til at måle langsomme 1-20 minut ændringer på tværs af store områder af væv, det har den ulempe er invasiv, potentielt ødelægge iboende forbindelser i hjernen og en langsom prøveudtagning kapacitet. En relativt nyere teknik, mikroelektroden array (MEA), har talrige fordele til måling bestemte neurotransmitter ændringer inden diskrete hjerneområder som de opstår, hvilket giver en rumligt og tidsmæssigt præcise fremgangsmåde. Under anvendelse af MEA er minimalt invasiv, hvilket tillader måling af neurotransmitter ændringer i vivo. I vores laboratorium, vi hahar været specielt interesseret i ændringer i neurotransmitter, glutamat, relateret til Alzheimers sygdom patologi. Som sådan har den her beskrevne fremgangsmåde blevet anvendt til at vurdere potentielle hippocampale forstyrrelser i glutamat i en transgen musemodel for Alzheimers sygdom. Kort fortalt, den anvendte fremgangsmåde involverer at coate en multi-site mikroelektrode med et enzym meget selektiv for neurotransmitteren af interesse og anvendelse selvhenvisende sider for at trække baggrundsstøj og forstyrrende. Efter udpladning og kalibrering kan MEA konstrueres med en mikropipette og sænkes ind i hjernen området af interesse under anvendelse af et stereotaktisk apparat. Her angivne metode involverer bedøve RTG (TauP301L) 4510-mus og under anvendelse af en stereotaktisk anordning til præcist at målrette subregioner (GD, CA1 og CA3) i hippocampus.
Introduction
Måling neurotransmitter ændringer i hjernen er et vigtigt redskab for neuroscientists studerer sygdomme i centralnervesystemet (CNS), der er ofte kendetegnet ved neurotransmitter dysregulering. Selvom mikrodialyse i kombination med højtryksvæskekromatografi (HPLC / EF) har været den mest udbredte metode til at måle ændringer i ekstracellulære neurotransmitterniveauer 1, 2, 3, 4, den rumlige og tidsmæssige opløsning af mikrodialysesonder måske ikke ideel til neurotransmittere , såsom glutamat, der er tæt reguleret i det ekstracellulære rum 5, 6. På grund af de seneste fremskridt inden for genetik og billeddannelse, er der yderligere metoder, der kan anvendes til at kortlægge glutamat in vivo. Anvendelse genetisk indkodede glutamat fluorescerende reportere (iGluSnFR) end to-foton-billeddannelse, kan forskerne visualisere glutamatfrigørelse ved neuroner og astrocytter både in vitro og in vivo 7, 8, 9. Især dette giver mulighed for optagelse fra en større synsfelt og ikke forstyrrer de iboende forbindelser i hjernen. Mens disse nye optiske teknikker tillader visualisering af glutamat kinetik og måling af sensoriske fremkaldte svar og neuronal aktivitet, mangler de evnen til at kvantificere mængden af glutamat i det ekstracellulære rum i diskrete hjerneområder.
En alternativ fremgangsmåde er enzymbundet mikroelektrode array (MEA), der selektivt kan måle ekstracellulære neurotransmitterniveauer, såsom glutamat, ved anvendelse af en selv-refereret optagelse ordning. Den MEA teknik har været anvendt til at studere ændringer i ekstracellulær glutamat følgende traumatisk hjerneskadeskade 10, 11, 12, ældning 13, 14, stress 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimers sygdom 19, 20, og injektion af en viral mimic 21 og repræsenterer en forbedring i forhold de rumlige og tidsmæssige begrænsningerne ved mikrodialyse. Ud fra følgende betragtninger mikrodialyse begrænser evnen til at måle nær synapse 22, 23, MMA har en høj rumlig opløsning, der giver mulighed for selektive foranstaltninger af ekstracellulær glutamat afsmittende nær synapser 24, 25. Sekund, den lave tidsmæssige opløsning af mikrodialyse (1 - 20 min) begrænser muligheden for at undersøgehurtige dynamik glutamatfrigivelse og clearance forekommer i millisekund til andet interval 26. Fordi forskelle i frigivelsen eller clearance af glutamat kan ikke altid tydeligt i foranstaltninger af tonic, hvilende glutamatniveauer, kan det være væsentligt at glutamatfrigivelse og clearance måles direkte. MEA'er mulighed for sådanne foranstaltninger på grund af deres høje tidsmæssig opløsning (2 Hz) og lave påvisningsgrænser (<1 um). Tredje, MEA tillader undersøgelse af subregionale variationer i neurotransmittere i en bestemt hjerneregion, såsom en rotte eller mus hippocampus. For eksempel ved anvendelse MEA'er vi kan separat målrette den tandede gyrus (DG), cornu ammonis 3 (CA3) og cornu ammonis 1 (CA1) af hippocampus, som er forbundet via en trisynaptic kredsløb 27, at undersøge subregionale forskelle i ekstracellulær glutamat. På grund af størrelsen af mikrodialysesonder (1 - 4 mm længde) og skader forårsaget af implantation 28 </ sup>, 29, subregionale forskelle er vanskelige at løse. Endvidere er de optiske systemer kun tillade stimulering via eksterne stimuli, såsom en knurhår stimulation eller lys flimmer, som ikke tillader subregionale stimulation 7. En endelig fordel af multilaterale miljøaftaler i forhold til andre metoder er evnen til at studere disse subregioner in vivo uden at forstyrre deres ydre og indre forbindelser.
Her beskriver vi, hvordan et registreringssystem (fx FAST16mkIII) i kombination med MEA'er, der består af en keramisk-baseret multisite mikroelektrode, kan differentielt overtrækkes på optagemediet sider for at muliggøre interfererende midler, der skal detekteres og fjernes fra analytsignalet. Vi også demonstrere disse arrays kan anvendes til amperometri-baserede undersøgelser af in vivo glutamat forskrift i GD, CA3 og CA1 hippocampale delområder bedøvede RTG (TauP301L) 4510-mus, et udbredt mOuse model af Alzheimers sygdom. Derudover giver vi bekræftelse af følsomheden af MEA systemet til de hurtige dynamik glutamatfrigivelse og efter behandling af mus med riluzol, at et lægemiddel vist in vitro falde glutamatfrigivelse og øge glutamatoptagelse 30, 31, 32, 33, og demonstrere disse respektive ændringer i vivo i TauP301L musemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Belægning af mikroelektrode Array med enzymer eller Matrix Layer
- Fremstilling af proteinet matrixopløsning
- Afvej 10 mg bovint serumalbumin (BSA), som overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj 985 pi af DI vand til mikrocentrifugerør indeholdende BSA. Bland opløsningen ved manuel omrøring (re-pipettering anvendelse 1.000 pi pipette ~ 3 gange, indtil BSA opløses).
BEMÆRK: Brug ikke vortex at blande opløsningen da dette kan indføre luft ind i løsningen. Indstil også pipetten til et volumen <1000 uL (fx 700 uL) for at undgå at indføre luftbobler. Opløsningen kan anbringes i en mikrocentrifuge, hvis nødvendigt. - Når BSA-opløsningen opløses, tilsættes 5 pi af 25% glutaraldehydopløsning. Bland opløsningen ved at vende det lukkede rør 3 - 5 gange. Den resulterende opløsning er 1% BSA med 0,125% glutaraldehyd.
- Afsæt proteinmatricen Solution i 5 minutter. Løsningen vil blive vist lys gul i farven.
- Fremstilling af den ønskede enzymopløsning (fx glutamat oxidase)
- Forbered glutamat oxidase opløsning ved tilsætning af filtreret deioniseret vand til det frysetørrede, oprensede enzym (for eksempel 50 pi DI vand tilsat til 25 enheder glutamat oxidase til opnåelse 0,5 U / pl).
BEMÆRK: alikvot stamopløsning (fx 1 uL) og gemme alikvoterne i passende størrelse beholdere (fx 500 pi mikrocentrifugerør rør) ved -20 ° C. Portioner kan opbevares i op til 6 måneder under disse betingelser. - Tilsæt 4 pi af BSA / glutaraldehydopløsning til mikrocentrifuge alikvoteret rør indeholdende glutamat oxidase. Bland opløsningen ved manuel omrøring (re-pipettering med en 10 pi pipette. Pipetten bør sættes til volumen <5 pi). Den resulterende opløsning er 1% BSA, 0,125% glutaraldehyd og 0,1 U / pl glutamat oxidase.Brug løsningen til belægning med det samme.
Bemærk: Glutamat oxidase overtræksopløsning må kun anvendes inden for 15 min. Skønt adskillige MEA kan overtrækkes med én fremstillede opløsning, anbefales det ikke at overskride den brugbare tidsvindue for glutamat oxidase. Antallet af elektroder, der kan coates inden for 15 minutter variere. Generelt kan 4 til 6 elektroder overtrækkes ad gangen.
- Forbered glutamat oxidase opløsning ved tilsætning af filtreret deioniseret vand til det frysetørrede, oprensede enzym (for eksempel 50 pi DI vand tilsat til 25 enheder glutamat oxidase til opnåelse 0,5 U / pl).
- Belægning MEA
- Typisk belægge et par optagelse site (s) på en MEA med det ønskede enzym (glutamat oxidase) og et andet par af optagelse site (s) (sentinel 'site (s)) er belagt med det inaktive protein-matrix.
- Brug stump-tip Hamilton mikrosprøjter (fx 10 pi) at overtrække MEA'er med L-glutamat oxidase eller inaktivt protein matrix-opløsning (BSA + glutaraldehyd). De metoder for enzym- eller inaktive protein-matrix overtræk er de samme.
- Rengør sprøjter før og efter brug (3 skylninger medDI vand, 3 skylninger med methanol, 5 skylninger med DI vand).
BEMÆRK: Dedikeret sprøjter anvendes til påføring lag enzym (glutamat oxidase) eller protein-matrix. Brug ikke den samme sprøjte til en anden løsning. Det anbefales at udføre protein-matrix overtræk før enzym overtræk. - Udarbejde glutamat oxidase eller proteinmatrix anvendelse af en 10 pi Hamilton-sprøjte. tryk forsigtigt stemplet for at dispensere en lille vulst af opløsning ved sprøjtespidsen (visualiseret ved anvendelse af et dissektionsmikroskop).
- Brug af dissektionsmikroskop at målrette MEA optagelse sites, anvende løsningen på de pågældende optagelsesdata sites ved kortvarigt at bringe optagelsen sites med opløsningen dråbe / perle, som repræsenterer et lag. Tre lag er tilstrækkelige for både protein-matrix og enzymet pels. Tykke lag kan reducere følsomheden af MEA.
- Hæv løsning dråben lige op og væk fra optagelser lokaliteter (dvs. Syringe spids skal ikke skrabe hen over MEA overflade).
- Indstille en timer til 1 min. Dette er minimumskravet tid mellem belægning ansøgninger til optagelse site (s). Tillad enzymovertrukne MEA'er hærde ved 4 ° C i 5-7 dage.
- Notér antal lag påføres, hvor lang tid det tog at anvende belægninger, elektroden nummer og et navn og dato i et laboratorium notesbog.
2. Elektroplettering med m-phenylendiamin til forbedret selektivitet
- Fremstilling m-phenylendiamin dihydrochlorid (MPD) opløsning
BEMÆRK: Plate udelukkelsen lag, MPD, at forhindre oxidation af dopamin og andre store, forstyrrende molekyler (fx ascorbinsyre) for derved at forbedre selektiviteten af sensoren for glutamat / H2O 2 forhold til andre potentielt-interfererende molekyler.- Måle 50 ml 0,05 M phosphatbufret saltvand (PBS) i en målekolbe og overføre 50 ml 0,05M PBS til en større (150 ml) Erlenmeyer-kolbe.
- Ved hjælp af slangen forbundet til en nitrogen tank (fx under anvendelse af slangen tilsluttet et tryk ejektor), vedhæfte en pipettespids (fx P200 tip) til den åbne ende af slangen. Placer røret med den vedhæftede pipettespids i PBS-opløsning og dækker opløsningen løst med parafilm. Tænde nitrogen og forsigtigt boble opløsningen i 20 minutter.
- Afvej 0,045 g MPD.
Forsigtig: MPD er et potentielt kræftfremkaldende stof. Vejning af MPD bør udføres ved anvendelse af en skala indeholdt i et stinkskab. Brug handsker og maske ved brug af MPD. Sikre hætten er funktionel, og at rammen er trukket til den passende arbejdshøjde. Umiddelbart rene overflader, der kan være blevet kontamineret med MPD at undgå permanent farvning. - Efter gennembobling overdrager alle MPD til afgasset PBS-opløsning. Dække kolben åbning med parafilm og forsigtigt hvirvel opløsning for at opløse MPD i opløsning. Undgå aggressive blanding eller anvendelse af en vortex da dette kan indføre gasser i opløsningen.
- Opløsningen overføres til en 50-ml-bæger. En omrører er ikke nødvendig.
- Galvanisering elektroden
- Opnå en referenceelektrode. Bruge reference elektroder dedikeret til MPD kun udpladning. Brug en anden referenceelektrode for kalibreringsprocedurer.
- Placer plast arm af referenceelektroden holderen over bægerglasset den. Tjek for luftbobler i glasset referenceelektrode (måske ikke i stand til at se). Knips forsigtigt den distale ende af referenceelektroden for at fjerne eventuelle luftbobler på spidsen.
- Placer referenceelektroden gennem åbningen i plasten arm og lavere i bægerglasset indeholdende PBS. Sikre, at referenceelektroden ikke berører bunden af bægerglasset.
- Forbinde referenceelektroden til hovedtrin (fx 2 pA / mV) og forbinde (f.eks DIP stik) MEA at være mpd pladed til hovedtrin.
- Sænk MEA i bægeret opløsning, således at kun MEA spids er nedsænket i opløsningen. Må ikke nedsænkes MEA tip i flydende ud over det sorte 'boble' (den sorte isolering placeret over MEA spids). Det kan beskadige MEA.
- Køre en 'prøve' kalibrering for at kontrollere funktionaliteten af elektrodelagene kanaler og forbindelsen til hovedtrin.
BEMÆRK: Selvom hardware indstillinger bør afspejle det udstyr, der anvendes, detaljer relateret til analyt / forstyrrende type og koncentration behøver ikke skal indtastes for 'test' kalibrering. Omkodning tilstand skal være 'Amperometri' og 'V-anvendt' bør være -0.7 V. Kontroller typisk optagelse for alle kanaler. - Annuller ved at vælge 'Annuller', når konnektivitet af alle optagelsen steder er bekræftet. Det er ikke nødvendigt at gemme kalibreringsdata.
- Vælg "Galvanisering" ikonet på skrivebordet. Den Galvanisering Tilol Menu vises. Kontroller de korrekte indstillinger er indtastet:
PP amplitude: 0,25
Offset: -0,5
Frekvens: 0,05
Varighed (min): 20 - Vælg knappen 'pause' for at begynde plating. Den forløbne tid felt skal begynde at tælle ned.
- Ved afslutningen (alle forløbne tid), skal du vælge 'anden MEA' i dukkede op menuen for at begynde MPD plating en ekstra MEA. Udskift forgyldt MEA med en MEA skal MPD forgyldt og gentag galvanisering procedure ved hjælp af galvanisering værktøj.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge den fremstillede MPD opløsning ikke mere end 2 gange eller inden for en 1 h periode. Forberede en frisk opløsning til fremstilling af mere end 2 MEA'er. - Vælg 'exit-software' for at afslutte galvanisering. Skyl MPD-belagte elektrodespidserne med DI vand (for at undgå et salt rest) og lager (24 timer), før kalibrering.
- Fjern referenceelektroden fra opløsning og skyl med deioniseret vand før anbringelse i de passende storage opløsning (for eksempel 3 M NaCl). Sikre referenceelektroden spids er nedsænket i opløsningen. Langsomt lavere glas referenceelektrode i opløsningen for at undgå at beskadige glasset.
- Bortskaffe MPD opløsning i en passende mærket farligt affaldsbeholder.
3. Kalibrer MEA for Glutamat Detection og Selektivitet (figur 1) 21
- Forberedelse af løsninger, der er nødvendige til kalibrering.
BEMÆRK: Se tabel 1. - Udføre kalibrering under konstant omrøring (magnetisk batteridrevet omrører) ved 37 ° C. Tænd varmepude eller cirkulerende vandbad og opnå en lille omrører. Rør langsomt, men hurtigt nok, at når en tilføjelse er lavet (nedenfor), er den nye plateau nås hurtigt.
- Tilslut hovedtrin (2 pA / mV) til optagelse styresystem og indsætte MEA spidsen i 40 ml omrørt 0,05 M PBS (brug en 50-ml-bæger).
- Tilslut ræs elektrode. Flick enden at sikre, at der ikke er luftbobler.
- Åbn optagelsen program og klik på "kalibrering". Sørg for, at indstillingerne er korrekte (kontrollere, at sentinel sites er valgt, da det kan ændre sig med forskellige elektroder), vælge MEA, og tryk på "Start".
- Tillad 5 - 10 min til ækvilibrering; begynde, når baseline er stabiliseret (<0,004 nA / min ændring).
- Vælg "Baseline" og tilsæt 500 pi 20 mM ascorbinsyre (forstyrrende; endelig [250 uM]) og vælg "Interfererende" (AA er tænkt som hjerne-dækkende forstyrrende), når den nuværende har nået en ny, stabil plateau, hvis nogen. Tillad 0,5 C - 1 min mellem tilsætningerne. Hvis MEA er korrekt galvaniseret, skal observeres næsten ingen ændring.
- Tilsæt 40 pi 20 mM L-glutamat (endelig [20 uM]) og en gang strømmen har nået en ny, stabil plateau, mark 1 st addition "analyt". Gentag tre gange for i alt 3 glu-e tilføjelser.
- Tilsæt 40 uL DA. Vælg ikke "analyt"; vælg "Test Stof" - DA må kun være en forstyrrende i områder, der indeholder DA.
- Tilføj 40 ul peroxid. Vælg ikke "analyt"; vælg "Test Stof".
- Klik på knappen "Stop", når kalibreringen er færdig.
- For at bestemme funktionaliteten af MEA, klikke på fanen beregning og optage følgende parametre i et laboratorium notesbog.
- For MEA design (3.000 um 2) anvendt i disse kalibreringer, bruge en MEA med en hældning på ≥ 0,004 nA / uM men lavere skråninger kan anvendes til visse forsøg. Hvis der er mindre end en forskel i hældningen mellem enzymovertrukne og uovertrukne steder 10%, så bruge disse MEA'er for evoked release kun eller ren / kassere MEA.
- Brug en detektionsgrænse (LOD) ≤ 1,5 uM. Hvis LOD er større end 1,5 uM, så bruge disse MEA'er for evoked RELEASe og optagelse alene. Brug ikke disse elektroder til optagelse styrkende niveauer.
- Brug en selektivitet for den ønskede analyt (dvs. glutamat) i løbet af den forstyrrende på> 20 arbitrære enheder. Hvis selektivitet er mindre end 20, så ren / kassere MEA.
- Brug en linearitet (R2) af kalibreringskurven på ≥ 0,90. Hvis linearitet er mindre end 0,90, så ren eller kassere MEA.
- Gem filen med # af MEA, dato og initialer på den person kalibrering.
4. Monter Mikropipette
BEMÆRK: Mikropipetter (kapillær glas) bør have en spids med en indvendig diameter på 10 - 15 um.
- Placer mikropipetten centralt blandt alle fire platin optagelse sites og montere 50-100 um over MEA anvendelse klæbrig voks og modellervoks.
- At indlæse mikropipette Brug en 1 ml sprøjte fyldt med glutamat eller KCl opløsning, en 0,22-um steril sprøjte filter, og en 97 mm lang, 28-gauge pipette fyldstof, efterfylde mikropipette. Det vil sige, indfør kanylen i toppen af mikropipetten og fylde i bunden af mikropipetten (enden mod MEA), og sørg for der er ingen bobler.
- Fastgør mikropipette til trykket udsmidningssystem 2 - 20 psi i ca. 1 s.
5. Plade Miniature reference elektrode til in vivo anvendelse
- Forbered pletteringsopløsningen (50 g NaCl / 90 ml 1 M HCI i en 100 ml bæger (plating bad)) og skæres badet elektrode (~ 10 cm længde af platin (Pt) tråd (~ 0,02" diameter)).
- Skær en 10 - 15 cm langt stykke teflonbelagt sølvtråd (0,008" tomt) og bruge et barberblad til at skrabe ~ 1 cm Teflon coating fra hver ende af ende af sølvtråd.
- Lodde en guldnål den ene ende og placere den ene ende af eksponeret sølvtråd i pletteringsbadet.
- Under anvendelse af en DC-adapter (bruger kun DC adapter, der har et output på ~ 9 -. 15 VDC max),klemme "røde" (+) ledning til den fremstillede sølvtråd (referenceelektrode) på guld pin side. Spænd den "sorte" (-) ledning til Pt bad katode.
- Tilslut DC-adapter. Kigge efter den korrekte pletteringsproces - bobler skal anbringes i badet elektrode; referenceelektrode fik en sølv / grå farve.
ADVARSEL: Tænd ikke ledningerne [Sort (-) vs Rød (+)] - plating bad vil blive ødelagt, hvis dette sker og frisk plating løsning vil skulle foretages. En dårlig løsning vil blive gul i farven: BRUG IKKE!
BEMÆRK: plating reaktion finder 2-5 min generelt: Ag 0 + Cl - → AgCl + e - - Test referenceelektroden.
- Sæt et multimeter til 100 - mV DC indstilling 200.
- Placer en benchmark (dvs. en tidligere testede elektrode som fungerer) referenceelektrode i 3 M NaCl og test mod den nyligt belagte referenceelektrode.
BEMÆRK: Hvis osing en ny referenceelektrode, lægges i blød i 3 M NaCl før brug (12 timer anbefales). - Placer "røde" (+) føringen på guldnål af referenceelektroden, der skal testes. Placer "sorte" (-) foran, benchmark elektrode. Et acceptabelt udlæsning interval er ± 10 mV. 0 mV er ideel tværs af de 2 referenceelektroder.
6. Generelt Animal Kirurgi for MEA Optagelser
- Forberedelse til operation
- Placer kirurgi værktøjer i desinfektionsmiddel aftenen før.
- Fjern de værktøjer fra desinfektionsmiddel og skylles grundigt og placere værktøjer på en steril kirurgi pad. Anskaf en varmepude.
- Kalibrere to elektroder og vedhæfte mikropipetten som beskrevet i procedurerne 3 og 4.
- Gøre referenceelektroden som beskrevet i afsnit 5.
- Gøre 200 uM glutamat og 70 mM KCI. Der henvises til tabel 1.
- Anskaf dyret, og vægten registreres på kirurgi ark.
- Forbered anæstesi og tænd varmepuden.
- Udfør MEA kirurgi
- Anvendelse isofluran (4% flow i oxygen), bedøver dyret i en induktion kammer indtil respirationsfrekvens faldet signifikant og dyret ikke reagerer på tåen eller hale knivspids. Optag respirationsfrekvens og kropstemperatur hver 15 min.
- Placer dyret i stereotaktisk apparat ved hjælp af øre barer at stabilisere hovedet. Sørg for, at dyret er sikker og hovedet bevæger sig ikke. Sænk isofluran flow til 1,5 - 3% i oxygen. Sikre, at varmepuden er korrekt placeret under dyret og indstillet til 37 ° C for at tilvejebringe supplerende varme. Undladelse af at give supplerende varme kan resultere i dyb hypotermi og for tidlig død af dyret.
- Anvend øjensalve ved hjælp af en steril bomuld applikator og registrere respirationsfrekvens oglegemstemperatur. Ved hjælp af en batteridrevet trimmer, barbere toppen af hovedet. Brug de små kirurgiske sakse til at fjerne pelsen nær ørerne.
- På dette tidspunkt, sat på de sterile kirurgi handsker. Anvende iod og derefter alkohol (tre gange) til hovedbunden.
- Ved hjælp af en skalpel, foretage et snit lige ned midt i hovedbunden og sprede huden ved hjælp af bull hunde klemmer. Tag en steril vatpind til at opsuge noget blod. Bruge hydrogenperoxid at lette forekomsten af bregma og lambda.
- Kontrollere, at hovedet er placeret korrekt ved at måle D / V og M / L koordinater bregma og lambda. Koordinat ændringer bør være nul, hvis hoved er på en flad plan. Juster hoved og øre barer som er nødvendigt for at sikre et fladt plan.
- Find bregma, og nul koordinaterne. Under anvendelse af de ønskede koordinater, bevæge sig mod venstre og højre og gøre et mærke ved hjælp af en permanent markør. Ved hjælp af en cauterizer / markør, gør en stor firkant rundt om mærket med plads nok til at nå denønskede område.
- Anvendelse af en steril roterende værktøj, bore omkring pladsen mærket. Opsuge blod under anvendelse af en steril bomuld applikator. Grundigt desinficere boret før hver brug.
- Fastgør MEA til hovedtrin og efterfylde pipetten med den første ønskede opløsning. Vær sikker efterlade et hul i pipetten uden løsning, så der kan blive undersøgt løsningen bliver udvist. Fastgør slangen til glasmikropipette.
- Tænde nitrogentanken og trykket ejektoren (psi = 5, tid = 0,6 s). Test (tryk manuel røde knap) for at sikre pipetten ikke er tilstoppet, før du begynder.
- Kalibrer mikropipette. Start ved 0 på reticle og lægge et stykke blå tape på hovedtrin at angive startpunktet. Tænd for den digitale læser og nulstille den til nul. Gå ned 1 mm (DV) og tælle antallet af flåter løsningen er flyttet på sigtet. 10 flåter skal være lig 1 mm (1 mm = 250 nL), så 1 tick = 25 nL.
- Placer referenceelektroden i enfjernplacering fra MEA, således at det stadig er i flydende kontakt med hjernen at slutte kredsløbet.
- Find bregma med MEA vedhæftet og nul den digitale læser. Flyt MEA til de ønskede koordinater. Sænk langsomt MEA indtil spidsen rører hjernen. Nul DV koordinere og sænk langsomt MEA ind i hjernen.
- På optagelsen program, skal du klikke på den ønskede kalibrerede elektrode og derefter klikke på "Udfør eksperimentet." Systemet vil så begynde at optage toniske niveauer for analytten af interesse, mens dyret er bedøvet.
- Ind til en akse, der vil hjælpe med at observere basislinje og tillade elektroden til baseline for 20 - 45 min.
- Efter basislinjen er stabil, indstille trykket ejektoren til .6 s og 5 psi og tryk på den røde knap på tryk ejector at skubbe. Registrere den tid og tryk samt volumen / tæger fremdrevet på injektion ark (figur 2). Foretag eventuelle noter, der er nødvendige (dvs.større toppe, fortyndingsvirkninger, tilstoppet pipette, støjende baseline / o-scope).
- For glutamat injektioner, vente 3 - 5 min mellem injektionerne. For KCI injektioner vente 1 - 2 ud min mellem injektionerne. Injicer anvendelse af samme tryk og tid mindst 3 gange. Skift tid og gentag. Prøv ikke at ændre trykket medmindre mikropipetten er tilstoppet.
- Hvis mikropipetten er tilstoppet, øge presset op til 30 psi.
- Optag fra de ønskede områder af hjernen, gentaget på begge sider af hjernen ved hjælp af forskellige løsninger. Optage en basislinie i hver ny region i 20 min.
- Tag MEA med mikropipette fastgjort, skylles med deioniseret vand og lægges i blød i PBS natten over, indtil alt det blod er væk.
- Aflive dyret og gemme hjernen i en præ-mærket rør og opbevares i -80 ° C fryser eller beholde den ene side til fiksering. At aflive dyret, overdosis med isofluran (inhalation). Udfør halshugning hjælp kirurgiske sakse og dissekere de ønskede områder.
7. Rengøring Coated MEA'er efter brug
- Må ikke rene MEA'er hvis ubrugt. Hvis der er fnug eller støv på overfladen, ren med methanol og lad tørre i 24 timer før belægning.
- Tænd for vandbad (80 ° C) og suge spidsen af MEA i 30 minutter. Tør forsigtigt spidsen af elektroden med en bomuld applikator for at fjerne eventuelt snavs, der kan være efterladt på elektrodespidsen. Må ikke få den sorte "isolering del" af MEA våd.
- Anvendelse af tre forskellige sonikatorer, sættetid spidsen af MEA i (1) Citrisolv, et kommercielt opløsningsmiddel og klaringsmiddel (2) isopropyl, og (3) deioniseret vand i 5 minutter. Tør forsigtigt spidsen af elektroden med bomuld applikator for at fjerne eventuelt snavs, der kan være efterladt på elektrodespidsen.
- Undersøg tip under et dissektionsmikroskop for at sikre lagene er blevet fjernet.
8. Analyse
- For at analysere dataene,først eksportere den ønskede eksperiment ved at dobbeltklikke på den færdige eksperiment og vælge "eksport af data" fra drop-down menuen fil.
- Gem disse data til den ønskede fil placering og åbne analyseprogrammet. Klik på "åben" i analysen programmet og vælg den nyligt gemte fil.
- Giv programmet et par øjeblikke til at uploade filen og derefter kontrollere eksperiment under fanebladet event markører. Under output Marker felterne for de ønskede parametre. For eksempel baseline, amplitude, areal af toppen (areal under kurven), T stige, og T 80.
- Klik opdateringshastighed og derefter analysere for at eksportere data til et regneark (det kan tage et par minutter). Programmet vil give en prompt for at gemme filen på den ønskede placering. Når den er gemt, kan filen redigeres i et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens denne teknologi kan bruges til at måle ændringer i glutamaterge signalering i mange typer af dyremodeller, såsom traumatisk hjerneskade, aldring, stress og epilepsi, her viser vi, hvordan MEA teknologi kan bruges til at undersøge glutamaterge ændringer i transgen musemodel af human tauopati 19, 20. RTG (TauP301L) 4510 mus udtrykker P301L mutationen i tau forbundet med frontotemporal demens og parkinsonisme koblet til kromosom 17, og er almindeligt anvendt til at studere tau patologi associeret med Alzheimers sygdom, neurodegenerative tauopatier og frontotemporal demens. Vi viser også, at glutamaterge signalering kan ændres af farmakologisk intervention. Vi behandlede TauP301L mus med riluzol, en FDA-godkendt sygdomsmodificerende lægemiddel til amyotrofisk lateral sklerose (ALS), der modulerer glutamatergisk signalering ved at stabilisereinaktivere tilstand af spændingsafhængige natriumkanaler, hvilket fører til et fald i glutamat frigivelse og en potensering af glutamat optagelse via en stigning i glutamat transportør ekspression, hvilket fører til øget glutamat feltet 30, 31, 32, 33.
Vi har valgt denne særlige datasæt for demonstrative formål af fire grunde. Først dette datasæt viser den tidsmæssige opløsning af systemet, som det fremgår af vores evne til at måle de hurtige dynamik forbigående frigivelse og optagelse af glutamat. Desuden er denne prækliniske dyremodel udviser ændringer i tonic glutamat, glutamat frigivelse og glutamat clearance, hvilket giver et eksempel på ændringer i hver foranstaltning. For det andet, at udnytte denne datasæt, den høj rumlig opløsning, der giver mulighed for måling af subregionens forskelle i GD, CA3, ennd CA1 af hippocampus påvises. For det tredje, disse data giver mulighed for demonstration af, hvordan farmakologisk intervention kan bruges til at afbøde glutamaterge ændringer observeret i prækliniske dyremodeller. Endelig fordi denne præklinisk model har ændringer i glutamat frigivelse, behovet for omhyggelig fortolkning af glutamat clearance ved tilstedeværelse af ændret glutamat frigivelse kan forklares.
Efter at have nået en stabil basislinje, som angivet ved <0,004 nA / min ændring i hældning (10 - 20 min), vi først målte tonic glutamatniveauer (uM) ved midling ekstracellulære glutamatniveauer over 10 s forud for enhver anvendelse af løsninger. Vi observerede øgede tonic glutamatniveauer i CA3 og CA1-regionerne TauP301L mus, og riluzol restaureret toniske glutamatniveauer med den for kontrollen (figur 3A). Næste, KCI var lokalt leveret (via en mikropipette) til hver af de tre subregioner i en hemisphførend hver 2 - 3 i min. Efter 10 reproducerbare signaler, hvilket er indikativt for et intakt glutamat neuronsystemet 34, blev gennemsnittet af resultaterne for hver gruppe og den gennemsnitlige amplitude sammenlignet. Repræsentative spor (figur 3B) viste øget glutamatfrigivelse i TauP301L mus efter indgivelse af KCl i alle tre delregioner (kun CA3 er vist), en virkning, der blev reddet af riluzole behandling (figur 3C).
MEA blev derefter flyttet til den modsatte halvkugle og lov til at nå en stabil basislinie (10 - 20 min) før exogent glutamat blev anvendt til at under- glutamat clearance (Figur 4). Varierende mængder (50 - 250 nL) på 200 pM sterilfiltreret glutamat opløsning blev påført i det ekstracellulære rum hver 2 - 3 i minutter, og netto areal under kurven (AUC) blev anvendt som et mål for glutamatoptagelse. Denne hurtige anvendelse af glutamat i than ekstracellulære rum giver mulighed for at efterligne af endogent glutamat frigivelse og måling af glutamat optagelse. Fordi glutamat transportører udviser Michaelis-konstanten 35, en række volumener - er (50 250 nL) af exogent glutamat injiceres at blotlægge forskelle i optagelse. For at gøre dette, hvert dyr modtager 1 - 2 injektioner på 50 nL intervaller inden de 50 - 250 nL rækkevidde. Selvom man altid skal bekræfte, at volumenet injiceret pr gruppe pr region er ikke statistisk forskellige ved p ≤ 0,05 niveau, den bedste måde at sikre netto AUC er relateret til optagelse, og ikke mængden af glutamat anvendt eller diffusion, er at sikre, både amplitude (figur 4A) og T stigning (et mål for diffusion fra punktkilden (mikropipette) til MEA i figur 4B) ikke afviger 10, 11, 19, 20. Denne allows for "peak matchende" amplituderne (figur 4C), således at forskelle i netto AUC antages at skyldes forskelle i optagelse og ikke den påførte mængde eller diffusion. Peak matchning er især vigtigt, når dyr har eksisterende forskelle i glutamat frigivelse. Fordi en række volumener injiceres, variansen for både amplitude og T stigning er ofte store og tilføje yderligere dyr ikke falde variansen for disse foranstaltninger, da de er forbundet til design. Fordi amplituden og T stigning var ens blandt grupperne i hver subregion (figur 4A, 4B), antager vi, at forskelle i netto AUC (figur 4C, 4D) skyldes forskelle i glutamatoptagelse. Riluzol forbedret glutamat clearance sammenlignet med kontroller i alle tre delregioner (figur 4D). Endelig er en MEA med en vedhæftet mikropipette anvendes til lokalt at anvende et farvestof for at bekræfte MEA placering efter hjerne sektioneringSom vist i figur 3D.
Disse data viser, at MEA teknologi kan måle neurotransmitterfrigivelse inden for små delområder i hippocampus 24, 25, i modsætning til tidligere teknikker (fx mikrodialyse), som kun er optaget fra store forsøgsområder og ofte beskadigede neuronkredsløb 28, 29. Derudover MMA os høj tidsmæssig opløsning for at måle de hurtige kinetik for glutamatfrigivelse og feltet 25.
Figur 1: In vitro Kalibrering af en Self-henvisninger mikroelektrode måle ændringen i Current (PA) på en Glutamat oxidase site (GluOx; rød) vs. en Sentinel site (Sendt; blå). Den forstyrrende ascorbinsyre (AA: 250 uM) og dopamin (DA: 2 uM) ændrede ikke strømmen ved enten glutamat oxidase eller kontroldyr sites. Tilsætning af glutamat (Glu: 20, 40, 60 uM) producerede en trinvis strømforøgelse på glutamat oxidase site, men ingen ændring på sentinel site. Hydrogenperoxid (H2O 2: 8,8 uM) producerede en stigning i strøm på begge sider. Følsomhed, hældning, detektionsgrænse, og R2-værdier blev beregnet efter kalibrering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. En prøve Elektrokemi arbejdsark. Dette arbejdsark omfatter kolonner til tidspunktet for injektion eller injektion nummer (TIME / TTL), hjerne koordinater (AP, ml, DV),mængden af tryk, der påføres (nitrogen), længden af tryk (tid), og den injicerede volumen af trykket ejektor. Eventuelle noter, såsom ulige signaler eller tilstopning af mikropipetten skal registreres i kolonnen noter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Ekstracellulær Tonic og kaliumchlorid (KCl) -evoked Frigivelse af glutamat i GD, CA3 og CA1 Regioner af Hippocampus. (A) I CA3 og CA1-regionerne i hippocampus, styrkende glutamatniveauer var signifikant forhøjede i vehikelbehandlede TauP301L mus (Veh-TauP301L), en effekt dæmpet af riluzol behandling. (B) Baseline-matchede repræsentative optagelser af KCI-fremkaldt glutamatfrigørelse i CA3 viste r iluzole behandling (Ril-TauP301L) svækkede signifikant stigning i amplituden af glutamatfrigivelse observeret i Veh-TauP301L mus. Lokal indgivelse af KCl (↑) frembragte en robust stigning i ekstracellulær glutamat, der hurtigt tilbage til toniske niveauer. (C) Den signifikant forøget KCI-evoked glutamatfrigivelse observeret i Veh-TauP301L mus i GD, CA3 og CA1 efter lokal indgivelse af KCl var svækket med riluzol behandling. (D) cresylviolet-farvet 20 um snit af hippocampus viser placering af MEA spor i CA3 og CA1 (Middelværdi ± SEM; ** p <0,01 Veh-Control vs Veh-TauP301L, # p <0,05 Ril-tau- P301L vs Veh-tauP301L, ## p <0,01 Ril-tauP301L vs Veh-tauP301L; n = 14 - 19 / gruppe). Dette tal genoptrykt med tilladelse fra John Wiley and Sons 19, 20.rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. glutamatoptagelse Efter Eksogen Glutamat Anvendelse i GD, CA3 og CA1 Regioner af Hippocampus. (A) Amplituden af den lokalt påførte glutamat signal var ens blandt grupper i hver region. (B) T stige, en indikator for glutamat diffusion fra mikropipetten, var ens blandt grupperne i hver region. (C) Repræsentative glutamat signaler i CA3 fra lokal påføring af glutamat i VEH-Controls, Veh-TauP301L, og Ril-TauP301L mus. (D) Riluzol behandling reducerede den markante stigning i netto areal under kurven (AUC) observeret i Veh-TauP301L mus i alle 3 regioner i hippocampus, hvilket indikerer forbedret glutamatoptagelse i riluzol-behandlede TauP301L mus (Middelværdi ± SEM; * p <0,05 Veh-Control vs Veh-TauP301L, ** p <0,01 Veh-Control vs Veh-TauP301L, # p <0,05 Ril-TauP301L vs. Veh- TauP301L, ## p <0,01 Ril-TauP301L vs Veh-TauP301L; n = 13 - 15 / gruppe). Dette tal blev genoptrykt med tilladelse fra John Wiley and Sons 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 0,05 M PBS | 2 L DI vand: |
| Opbevares i glasbæger omviklet med tin folie. Bringe pH til 7,4 med KOH om nødvendigt. | NaH 2 PO4 · H2O: 2,8 g Na2HPO 4: 11,34 g natriumchlorid: 11,68 g |
| 20 mM Ascorbinsyre 50 ml deioniseret vand: | |
| Foretag frisk hver dag. | Ascorbinsyre: 0,18 g |
| 20 mM L-glutamat | 50 ml deioniseret vand: |
| Foretag frisk ugentligt. | L-glutamat mononatriumsalt hydrat: 0,15 g |
| 2 mM Dopamin | Dopamin-hydrochlorid: 0,038 g |
| Foretag frisk månedligt. | 0,1 M Perchlorsyre: 10 ml Bring volumen til 100 ml med deioniseret vand |
| 8,8 mM Hydrogenperoxid | 50 ml deioniseret vand: |
| Foretag frisk ugentligt. | Hydrogenperoxid: 500 pi |
| 70 mM kaliumchlorid | 100 ml deioniseret vand: |
| Lav frisk dag i eksperimentet. | Kaliumchlorid: 0,08 g Natriumchlorid: 0,07 g Calciumchlorid: 0,004 g |
| 200 μ; M Glutamat | 20 mM glutamat: 100 pi |
| Lav frisk dag i eksperimentet. | Sterilt saltvand: 10 ml |
Tabel 1: kalibereringsopløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MEA teknik muliggør måling af hurtige kinetik for neurotransmitterfrigivelse og optagelse in vitro og in vivo. Derfor er teknologi frembringer en lang række data output herunder tonisk neurotransmitterniveauer, fremkaldt neurotransmitterfrigivelse, og neurotransmitter clearance. Men fordi brug af multilaterale miljøaftaler er en forholdsvis kompliceret procedure, der er mange faktorer, der kan have brug for at være optimeret til succesfuld brug. For eksempel under kalibrering, kan man konstatere, at der ikke er nogen signalbølgeformer (oscilloskop skærm) eller at reaktioner på stimulering er minimale, eller fraværende. Sandsynligvis på grund af en systemfejl, genstart af registreringssystemet, eller computer, kan løse problemet. Derudover kan problemet være en forbindelse fejl. Før kalibrering, er det relevant at dobbelttjekke, at MEA og referenceelektroderne elektrodernes forbindelser er tilsluttet korrekt. Udskiftningen af DIP-stikket på hovedtrin kan løse MEA forbindelsesproblemer.Hvis MEA ikke er helt i opløsning eller en dårligt vedligeholdt referenceelektrode anvendes, kan disse også forstyrre optagelsen under kalibreringen. Langsommere signalrespons under kalibrering er et andet fælles problem, der kan følge af en tykkere end nødvendigt BSA / glutaraldehyd blanding eller en langsomt spinning omrører. I tilfælde af at forstyrrende giver et signal under kalibrering, er det muligt, at der var en fejl i galvanisering (f.eks ikke elektroplettere længe nok) MPD udelukkelse lag. I et sådant tilfælde, gentage galvanisering procedure er nødvendig.
Under kirurgi kan den ene bedøvelsesmiddel niveau ikke tilstrækkelig til alle mus; nogle mus kan kræve højere niveauer af anæstesi til "gå under", og nogle mus kan kræve mindre. Det er vigtigt at starte på et lavt niveau af anæstesi og langsomt hæve den, indtil musen er under let anæstesi. Dybe anæstesi kan testes, når musen er i stereotaktisk anordning med enhale eller tå knivspids. Når du vælger koordinater til implantering MEA, er det også vigtigt at bemærke, og korrigere for eventuel hjerne atrofi, der kan forekomme i mange neurodegenerative dyremodeller 36, 37, 38. Desuden er det bydende nødvendigt under kirurgi, at blodet ikke akkumuleres på MEA, da dette kan påvirke optagelsen egenskaber af MEA og resultere i langsom tidsopløsning eller stærkt minimerede signalrespons. Hvis blodpropper omkring elektroden, blot fjerne MEA og skyl med saltopløsning.
Under optagelse, en af de mest almindelige problemer, der kan opstå, er, at for et støjende signal. Forstyrrelser fra andre elektroniske enheder, såsom ekstra belysning, yderligere instrumenter, og øvelser er de overvejende sandsynlige syndere, så det er bedst at undgå at tilslutte dem til samme elektriske kredsløb og / eller udløbet som registreringssystem. Desuden, hvis optagelsen system er ikke jordet korrekt, vil man observere svingninger på oscilloskopet af registreringssystemet samt støj stammer fra alle sider, og ikke kun optagelsen sites. Den anbefalede jordforbindelse måtten under registreringssystemet skal tilsluttes en jordet rør for at undgå disse problemer. Hvis det bestemmes, at ingen af disse er de fejl, kan fejlen ligge med referenceelektroden, eller MEA selv. Når støder støj problemer, ved hjælp af en ny, ubrugt MEA at kontrollere driften af systemet kan være et nyttigt fejlfinding tilgang. Hvis frakobling eller udskiftning af henvisningen elektrode, resulterer i lidt at ingen ændring, kan referenceelektroden eller halvcelle ikke fungerer korrekt. Ændring af referenceelektroden kan være den eneste måde at løse problemet. Når optagelsen er færdig, en sidste fordel ved MEA er evnen til at rense og genbruge dem. MEA kan genbruges cirka tre gange så lang som den MEA fortsat udføre tilstrækkeligt under kalibrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GG er eneejer af Quanteon, LLC, der gør det FAST-16-optagelse, der anvendes til glutamat målinger i denne undersøgelse. JEQ er en betalt konsulent for Quanteon.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences (MNR, U54GM104942), NIA (MNR, R15AG045812), Alzheimers Association (MNR, NIRG-12-242.187), WVU Faculty Research Senatet Grant (MNR), og WVU PSCOR Grant (MNR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
