Summary
Her beskriver vi oppsettet, programvare navigasjon, og dataanalyse for et romlig og tidsmessig nøyaktig metode for å måle tonic og fase-ekstracellulær glutamat endringer in vivo ved hjelp av enzym-bundet mikroelektrode arrays (MEA).
Abstract
Nevrotransmitter forstyrrelser er ofte en viktig del av sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), som spiller en rolle i patologien underliggende Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, depresjon og angst. Tradisjonelt har mikrodialyse har vært den mest vanlige (hyllet) teknikk for å undersøke nevrotransmitter endringer som oppstår i disse forstyrrelsene. Men fordi mikrodialyse har evnen til å måle langsomme 1-20 minutt endringer over store deler av vev, har den ulempen med invasivitet, potensielt ødelegge iboende forbindelser i hjernen og en langsom prøvetaking evne. En forholdsvis nyere teknikk, mikroelektroden array (MEA), har tallrike fordeler for måling av spesifikke nevrotransmitter endringer i diskrete hjerneområder etter hvert som de forekommer, noe som gir en romlig og tidsmessig nøyaktig tilnærming. I tillegg, ved bruk MEAs er minimal invasiv, slik at for måling av nevrotransmitteren endringer in vivo. I vårt laboratorium, vi hahar vært spesielt interessert i endringer i neurotransmitter, glutamat, relatert til patologien ved Alzheimers sykdom. Som sådan, er den fremgangsmåten som beskrives her er brukt til å vurdere potensielle hippokampale forstyrrelser i glutamat i en transgen musemodell for Alzheimers sykdom. I korthet, den metode som brukes omfatter belegning av et multi-site mikroelektrode med et enzym som er meget selektiv for den nevrotransmitter av interesse, og ved anvendelse av selvreferansesider for å trekke fra bakgrunnsstøy og interferenter. Etter utsåing og kalibrering, kan det MEA være konstruert med en mikropipette og senkes ned i hjerneområdet av interesse ved hjelp av en stereotaktisk anordning. Her er fremgangsmåten som er beskrevet innebærer bedøvelse RTG (TauP301L) 4510 og mus ved hjelp av en stereotaksisk anordning til nøyaktig å målrette subregioner (DG, CA1, og CA3) av hippocampus.
Introduction
Måling av nevrotransmitter endringer i hjernen er et viktig verktøy for å studere nevro sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), som kjennetegnes ofte av nevrotransmitter dysregulering. Selv om mikrodialyse i kombinasjon med høytrykks-væskekromatografi (HPLC / EC) har vært den mest anvendte metoden for å måle endringer i ekstracellulære nevrotransmitter nivåer 1, 2, 3, 4, den romlige og tidsmessige bestemte oppløsningen av mikrodialyse-probene kan ikke være ideell for nevrotransmittere , slik som glutamat, som er tett regulert i det ekstracellulære rom 5, 6. På grunn av den nylige fremskritt innen genetikk og billeddannelse, er det flere metoder som kan brukes til å kartlegge glutamat in vivo. Ved hjelp av genetisk kodede glutamat fluorescerende rapportører (iGluSnFR) etd to-foton avbildning, forskere er i stand til å visualisere glutamatfrigiving av neuroner og astrocytter både in vitro og in vivo 7, 8, 9. Spesielt, tillater dette tas opp fra et større synsfelt og ikke forstyrrer ikke den iboende forbindelsene til hjernen. Selv om disse nye optiske teknikker tillate visualisering av glutamatkinetikk og måling av sensoriske fremkalte responser og neuronal aktivitet, de mangler evnen til å kvantifisere mengden av glutamat i det ekstracellulære rom i diskrete hjerneområder.
En alternativ metode er den enzymbundne mikroelektrode array (MEA) som selektivt kan måle ekstracellulære nevrotransmitter nivåer, som for eksempel glutamat, ved bruk av en selv referert opptak ordningen. MEA teknikken har blitt brukt til å studere forandringer i ekstracellulær glutamat etter traumatisk hjerneskadeskade 10, 11, 12, aldring 13, 14, stresset 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimers sykdom 19, 20, og injeksjon av en viral etterligne 21 og representerer en forbedring i forhold til de rommessige og tidsmessige begrensninger som ligger i mikrodialyse. Mens mikrodialyse begrenser muligheten for å måle nær synapsen 22, 23, MEAs har en høy romlig oppløsning som gjør det mulig for selektive målinger av ekstracellulær glutamat overløp nær synapser 24, 25. For det andre, den lave tidsoppløsningen av mikrodialyse - begrenser (1 20 min) evnen til å undersøkeraske dynamikken i glutamatfrigjøring og klaringen som forekommer i millisekund til andre område 26. Fordi forskjeller i frigjørings eller klaring av glutamat kan ikke være innlysende på målinger av tonic, hviler glutamat nivå, kan det være nødvendig at glutamatfrigjøring og klaringen kan måles direkte. MEAs tillate for slike tiltak på grunn av deres høye tidsmessig oppløsning (2 Hz) og lave påvisningsgrenser (<1 um). For det tredje, MEAs muliggjøre undersøkelse av subregional variasjoner i nevrotransmittere i en bestemt hjerneområde, slik som rotte eller mus hippocampus. For eksempel, ved anvendelse av MEAs vi kan hver for målrette dentate gyrus (DG), ove ammonis 3 (CA3) og ove ammonis 1 (CA1) av hippocampus, som er forbundet via et trisynaptic krets 27, for å undersøke subregional forskjeller i ekstracellulær glutamat. På grunn av størrelsen på mikrodialyseprober (til 1 - 4 mm lengde), og skader forårsaket ved implantasjon 28 </ sup>, 29, subregionale forskjellene er vanskelig å ta opp. Videre er de optiske systemer bare tillater stimulering gjennom eksterne stimuli, slik som en whisker stimulering eller lys flimmer, som ikke tillater subregional stimulering 7. En endelig fordel med MEAs enn andre metoder er evnen til å studere disse subregioner in vivo uten å forstyrre deres ytre og indre forbindelser.
Her beskriver vi hvordan et opptakssystem (f.eks FAST16mkIII) i kombinasjon med MEAs, som består av et keramikk-baserte multisite mikroelektrode, kan differensielt belegges på opptakssider for å gi rom for forstyrrende stoffer som skal detekteres og fjernes fra analytten signal. Vi viser også disse matriser kan benyttes for amperometry baserte studier av in vivo-glutamat regulering innenfor DG, CA3, og CA1 hippocampus-subregioner av bedøvet RTG (TauP301L) 4510 mus, en vanlig brukt mouse modell for Alzheimers sykdom. I tillegg gir vi bekreftelse av følsomheten av MEA-systemet til den raske dynamikken i glutamatfrigjøring og klaring ved behandling av musene med riluzol, til et medikament in vitro vist å redusere glutamatfrigjøring og øke glutamat opptak 30, 31, 32, 33, og demonstrerer disse respektive endringer in vivo i TauP301L musemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coating microelectrode Array med enzymer eller Matrix Layer
- Klargjøring proteinmatriksen løsningen
- Vei opp 10 mg bovint serumalbumin (BSA) og overføre til 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Legg 985 mL DI vann til mikrosentrifugerør inneholdende BSA. Bland løsningen ved manuell røring (gjen pipettering ved anvendelse av 1,000 ul pipette ~ 3 ganger, inntil de BSA oppløst).
MERK: Ikke bruk vortex for å blande løsningen da dette kan introdusere luft inn i løsningen. Sett også pipetten til et volum <1,000 ul (for eksempel 700 ul) for å unngå innføring av luftbobler. Oppløsningen kan være plassert i en mikrosentrifuge ved behov. - En gang BSA-oppløsningen er oppløst, tilsett 5 ul av 25% glutaraldehyd-løsning. Blande oppløsningen ved å snu den lukkede rør 3 - 5 ganger. Den resulterende oppløsning er 1% BSA med 0,125% glutaraldehyd.
- Sett til side proteinmatrisen solusjon i 5 min. Løsningen vil vises lys gul i fargen.
- Fremstilling av den ønskede enzymløsning (f.eks, glutamat oksidase)
- Klargjør glutamat-oksidase oppløsning ved tilsetning filtrert DI vann til det frysetørkede, rensede enzym (f.eks, 50 mL DI vann ble tilsatt til 25 enheter av glutamat-oksydase for å tilveiebringe 0,5 U / pl).
MERK: Alikvoter stamløsning (f.eks, 1 pl) og lagre aliquoter i passende dimensjonerte beholdere (f.eks, 500 mL mikrosentrifugerør) ved -20 ° C. Porsjoner kan oppbevares i inntil 6 måneder under disse forholdene. - Tilsett 4 mL av BSA / glutaraldehydløsning til mikro alikvotert røret som inneholder glutamat oksidase. Bland løsningen ved manuell omrøring (re-pipettering med en 10 ul pipette. Pipetten skal settes til volum <5 ul). Den resulterende oppløsning er 1% BSA, 0,125% glutaraldehyd og 0,1 U / ul glutamat oksidase.Bruke løsningen for belegg umiddelbart.
Merk: Glutamat oksidase beleggsløsning kan bare anvendes innen 15 min. Selv om flere MEAs kan være belagt med en klar løsning, anbefales det ikke å overskride den brukbare tidsvinduet for glutamat-oksidase. Antallet av elektroder som kan belegges i løpet av 15 min variere. Generelt kan 4 til 6 elektroder belegges på en gang.
- Klargjør glutamat-oksidase oppløsning ved tilsetning filtrert DI vann til det frysetørkede, rensede enzym (f.eks, 50 mL DI vann ble tilsatt til 25 enheter av glutamat-oksydase for å tilveiebringe 0,5 U / pl).
- Belegg MEA
- Typisk belegge et par av registreringsstedet (e) på en MEA med det ønskede enzym (glutamat oxidase) og et annet par av registreringsstedet (er) ( 'Sentinel' site (e)) er belagt med det inaktivt protein-matriks.
- Bruk butt-tip Hamilton Mikro (f.eks 10 mL) for å belegge MEAs med L-glutamat oksydase eller inaktivt protein matriseoppløsning (BSA + glutaraldehyd). Prosedyrene anvendt for enzym eller inaktive protein-matriks-belegg er de samme.
- Rengjør sprøytene før og etter bruk (3 skyllinger medDI vann, 3 skyllinger med metanol, 5 skyllinger med avionisert vann).
MERK: Dedikert sprøyter benyttes for å påføre lag med enzymet (glutamat oxidase) eller protein-matriks. Ikke bruk samme sprøyte for en annen løsning. Det anbefales å utføre protein-matriks-belegg før enzym belegg. - Utarbeide glutamat oksydase eller proteinmatrise ved å bruke en 10 pl Hamilton-sprøyte. trykker stempelet forsiktig for å avgi en liten perle av oppløsningen ved sprøytespissen (visualisert ved anvendelse av et disseksjonsmikroskop).
- Ved hjelp av dissekere mikroskop for å målrette MEA opptaks områder, gjelder løsningen av de aktuelle opptaks områdene ved kort kontakt med opptakssteder med løsningen dråpe / perle, som representerer ett lag. Tre lag er tilstrekkelig for både protein-matriks og enzymet strøk. Tykke lag kan redusere følsomheten av MEA.
- Hev løsningen dråpe rett opp og av opptakene nettsteder (dvs. syringe spiss ikke skal skrape på tvers av MEA overflaten).
- Sett en timer i 1 min. Dette er den minimale tidskravet mellom belegganvendelser til registreringsstedet (e). Tillat enzym-belagt MEAs å herde ved 4 ° C i 5-7 dager.
- Registrere antall strøk påført, hvor lang tid det tok å bruke belegg, elektrodenummer og et navn og dato i et laboratorium notatbok.
2. Elektroplettering med m-fenylendiamin for forbedret selektivitet
- Klar m-fenylendiamin-dihydroklorid (MPD) løsning
MERK: Plate utelukkelse lag, MPD, for å forhindre oksydasjon av dopamin og andre store, interferens molekyler (for eksempel askorbinsyre), for derved å forbedre selektiviteten til sensoren for glutamat / H 2 O 2 fremfor andre potensielt-interferens molekyler.- Måle 50 ml 0,05 M fosfatbufret saltløsning (PBS) i en volumetrisk kolbe og overfører 50 ml av 0,05M PBS til en større (150 ml) Erlenmeyer-kolbe.
- Bruk av rør forbundet med et nitrogentank (for eksempel ved bruk av røret er koblet en trykk ejektor), feste en pipettespiss (f.eks P200 tip) til den åpne enden av røret. Plasser røret med den vedlagte pipettespissen i PBS-oppløsning og dekker oppløsningen løst med parafilm. Slå på nitrogen og forsiktig boble løsning i 20 minutter.
- Veie 0,045 g av MPD.
Forsiktig: MPD er et potensielt kreftfremkallende stoff. Veiing av MPD bør utføres ved hjelp av en skala som finnes i en avtrekkshette. Bruk hansker og maske ved bruk av MPD. Sikre hetten er funksjonell og at vindusrammen trekkes til passende arbeidshøyde. Umiddelbart rene overflater som kan ha blitt forurenset med trykkbalansert for å unngå permanent farging. - Etter bobling, overføre alle MPD til den de-gasset PBS-løsning. Dekk kolben åpning med parafilm og forsiktig virvel for å oppløse MPD i oppløsning. unngå aggressive blanding eller anvendelse av en vortex ettersom dette kan innføre gasser i oppløsningen.
- Overfør løsningen til et 50-ml begerglass. En rørepinne er ikke nødvendig.
- Electroplating elektroden
- Oppnå en referanseelektrode. Bruk referanseelektroder som er dedikert til MPD plating bare. Bruk en annen referanseelektrode for kalibrering.
- I plast arm av referanseelektrodeholderen over begerglasset. Kontroller for luftbobler i glassreferanseelektrode (kanskje ikke være i stand til å se). Knips forsiktig den distale ende av referanseelektroden for å fjerne eventuelle luftbobler på spissen.
- Plassere referanseelektroden gjennom åpningen i plast armen og inn i det nedre beger inneholdende PBS. Sikre at referanseelektroden ikke er i berøring med bunnen av begerglasset.
- Forbinder referanseelektroden til den heads (for eksempel 2 PA / mV) og kobles (f.eks DIP-kontakt) MEA å være MPD plated til heads.
- Senk MEA i begerglasset løsning, slik at bare den MEA ytterende er nedsenket i løsningen. Ikke senk MEA-tips i væsken utenfor den sorte 'boble' (den sorte isolasjon plassert over MEA spissen). Dette kan skade MEA.
- Kjøre en 'test' kalibrering for å verifisere funksjonaliteten til elektrode kanaler og tilkobling til heads.
MERK: Selv om maskinvareinnstillingene bør reflektere utstyret som brukes, detaljer knyttet til analytt / interferens typen og konsentrasjonen trenger ikke å legges inn for 'test' kalibrering. Opptaket modus skal være 'Amperometry' og 'V-anvendes' bør være -0,7 V. Kontroller typisk opptak for alle kanaler. - Avbryt ved å velge 'Avbryt' når tilkobling av alle opptaks nettstedene er bekreftet. Det er ikke nødvendig å lagre kalibreringsdata.
- Velg "Electroplating" ikonet på skrivebordet. Den Electroplating Åol Menyen vises. Kontroller de riktige innstillingene er lagt inn:
PP amplitude: 0,25
Offset: -0,5
Frekvens: 0,05
Varighet (min): 20 - Velg 'pause' knappen for å starte platekledning. Medgått tid feltet skal begynne å telle ned.
- Ved ferdigstillelse (all medgått tid), velger du 'annet MEA' i poppet opp menyen for å begynne MPD plating en ekstra MEA. Erstatte den belagt med et MEA MEA som skal MPD belagt og gjenta prosedyren elektroplettering ved hjelp av elektroplettering verktøyet.
MERK: Det anbefales å bruke forberedt MPD løsningen ikke mer enn to ganger eller innen en time tidsperiode. Fremstill en frisk oppløsning for å fremstille mer enn 2 MEAs. - Velg 'exit programvare for å fullføre galvanisering. Skyll MPD-belagt elektrodespissene med DI-vann (for å unngå en saltrest) og lagring (24 timer) før kalibrering.
- Fjern referanseelektroden fra oppløsningen og skyll med DI vann før de legges inn i de egnede storage oppløsning (for eksempel 3 M NaCl). Sørge for referanseelektroden ytterende er nedsenket i løsningen. Sakte nedre glassreferanseelektrode inn i løsningen for å unngå skade på glasset.
- Kast det MPD oppløsning i et passende merket farlig avfallsbeholder.
3. Kalibrer MEA for Glutamat Detection og selektivitet (figur 1) 21
- Fremstilling av de løsningene som er nødvendig for kalibrering.
MERK: Se tabell 1. - Kalibrere under konstant omrøring (magnetrører batteridrevne) ved 37 ° C. Slå på varmeputen eller sirkulerende vannbad og oppnå en liten rørestav. Rør sakte men fort nok til at når et tillegg er laget (under), er det nye platået nås raskt.
- Koble heads (2 PA / mV) til opptaksstyresystemet, sett MEA spiss inn i 40 ml rørt 0,05 M PBS (bruke en 50-ml begerglass).
- Koble reference elektrode. Flick slutten for å sikre at det ikke er luftbobler.
- Åpne registreringsprogrammet og klikk på "Kalibrering". Sørg for at innstillingene er riktige (sjekk at sentinel områder er valgt ut som dette kan endre seg med ulike elektroder), velger MEA antall og trykk "Start".
- Tillat 5 - 10 min for ekvilibrering; begynner når grunnlinjen har stabilisert seg (<0,004 nA / min endring).
- Velg "Baseline" og tilsett 500 ul av 20 mM askorbinsyre (interferens; endelig [250 uM]) og velge "interferens" (AA er tenkt som hjerne-bred interferens) når strømmen har nådd et nytt, stabilt platå, hvis noen. Tillat 0,5 til 1 min mellom tilsetningene. Hvis MEA er riktig galvanisert, bør nesten ingen endring holdes.
- Legg 40 ul av 20 mM L-glutamat (slutt [20 uM]), og når strømmen har nådd et nytt, stabilt platå, mark 1 m tilsetning "Analytt". Gjenta tre ganger for totalt 3 glutamate tilføyelser.
- Legg 40 mL DA. Ikke velg "Analyte"; velge "Test substans" - DA kan bare være en interferens i områder med DA.
- Legg 40 mL Hydrogenperoksid. Ikke velg "Analyte"; Velg "Test Substance".
- Klikk på "Stop" -knappen når kalibreringen er ferdig.
- For å bestemme funksjonaliteten til MEA, klikk på fanen beregning og spille inn følgende parametere i en lab notatbok.
- For MEA design (3000 mikrometer 2) som brukes i disse kalibreringer ved å bruke en MEA med en helling på ≥ 0,004 nA / iM, men lavere bakker kan benyttes for visse eksperimenter. Dersom det er mindre enn en 10% forskjell i helning mellom enzym belagte og ubelagte områder, og deretter bruke disse MEAs for fremkalt frigivelse bare eller rent / forkaste MEA.
- Bruk en deteksjonsgrense (LOD) ≤ 1,5 uM. Dersom LOD er større enn 1,5 uM, og deretter bruke disse MEAs for fremkalte utgivelse og opptak bare. Ikke bruk disse elektrodene for innspilling tonic nivåer.
- Bruk en selektivitet for det ønskede analytt (det vil si glutamat) over interferens på> 20 arbitrære enheter. Hvis selektiviteten er mindre enn 20, og deretter ren / forkaste MEA.
- Bruke en linearitet (R 2) i kalibreringskurve ≥ 0,90. Hvis linearitet er mindre enn 0,90, og deretter ren eller forkaste MEA.
- Lagre filen med # av MEA, dato og initialene til personen kalibrering.
4. Monter Mikropipette
MERK: Mikropipetter (kapillar glass) bør ha en spiss med en innvendig diameter på 10 - 15 um.
- Plasser mikropipette sentralt mellom alle fire platinaopptakssider og montere 50-100 um ovenfor MEA ved hjelp av klebe-voks og modelleringsleire.
- For å laste mikropipette, bruke en 1 mL sprøyte fylt med glutamat eller KCl-oppløsning, en 0,22 mikrometer steril sprøyte filter, og en 97 mm long, 28-gauge pipette fyllstoff, fylle mikropipette. Det er, sett inn kanylen i toppen av mikropipette og fyll på bunnen av mikropipette (enden mot MEA), noe som gjør at det ikke er noen bobler.
- Fest mikropipette til trykkutstøtningssystemet ved 2-20 psi i ca. 1 sek.
5. Plate Miniature Referanseelektrode for bruk in vivo
- Klargjør pletteringsoppløsning (50 g NaCl / 90 ml 1 M HCl i et 100 ml begerglass (pletteringsbad)) og kuttet badekaret elektrode (~ 10 cm lengde av platina (Pt) ledningen (~ 0,02" i diameter)).
- Skjær et 10 - 15 cm langt stykke av teflonbelagt sølv wire (0,008" bart) og bruke et barberblad til å skrape av ~ 1 cm teflonbelegg fra hver ende av enden av sølvtråd.
- Loddetinn en gull tapp på den ene ende og plassere den ene ende av eksponerte sølvtråd inn i pletteringsbadet.
- Ved hjelp av en DC-adapter (bruke bare en DC-adapter med en utgang på ~ 9 -. 15 VDC maks),klemme den "røde" tråd (+) til den preparerte sølvtråd (referanseelektrode) på gull pin side. Klem "svart" (-) til Pt bad katode.
- Plugg i DC-adapter. Se etter riktig plating prosessen - bobler skal vises på bad elektrode; referanse-elektrode svinger en sølv / grå farge.
FORSIKTIG: Ikke slå den fører [Black (-) vs Red (+)] - plating bad vil bli ødelagt dersom dette skjer og frisk plating løsning må gjøres. En dårlig løsning blir gul i fargen: IKKE BRUK!
MERK: Pletterings Reaksjonen tar vanligvis 2-5 minutter: Ag 0 + Cl - → AgCl + e - - Test referanseelektroden.
- Still et multimeter til 100-200 mV DC innstilling.
- Plasser en referanse (det vil si en på forhånd testet elektrode kjent for å være arbeids) referanse-elektrode i 3 M NaCl og test mot den nylig belagt referanseelektrode.
MERK: Hvis ossing en ny referanseelektrode, suge den i 3 M NaCl før bruk (12 h anbefales). - Plasser "rød" (+) bly på gull pinnen til referanseelektroden som skal testes. Plasser "svart" (-) bly på referanseelektrode. Et akseptabelt avlesning område er ± 10 mV. 0 mV er ideell over 2 referanseelektroder.
6. Generelt Animal kirurgi for MEA Recordings
- Forberedelse til kirurgi
- Plasser kirurgi i desinfeksjonsmiddel natten før.
- Fjern verktøy fra desinfeksjonsmiddel og skyll grundig og plassere verktøy på en steril kirurgi pad. Oppnå en varmepute.
- Kalibrer to elektroder og feste mikropipette som beskrevet i fremgangsmåtene 3 og 4.
- Gjør referanseelektrode som beskrevet i kapittel 5.
- Gjør 200 pM glutamat og 70 mM KCI. Se Tabell 1.
- Skaff dyret og registrere sin vekt på kirurgi ark.
- Klargjør anestesi og slå på varmeputen.
- Utfør MEA kirurgi
- Ved hjelp av isofluran (4% strøm i oksygen), bedøve dyret i en induksjonskammeret inntil pustefrekvensen er betydelig redusert, og dyret ikke svarer til tå eller hale klemme. Vanlig respirasjonsfrekvens og kroppstemperatur hvert 15 min.
- Plasserer dyret i den stereotaksiske enheten ved hjelp av øret stolpene for å stabilisere hodet. Pass på at dyret er sikker og hodet beveger seg ikke. Senk isofluran strøm til 1,5 til 3% i oksygen. Sørge for at varmeputen er korrekt plassert under dyr og satt til 37 ° C for å gi tilskuddsvarme. Unnlatelse av å gi ekstra varme kan føre til dyp hypotermi og for tidlig død av dyret.
- Påfør øye salve med en steril bomull applikator og registrere respirasjonsfrekvens ogkroppstemperatur. Ved hjelp av en batteridrevet trimmer, barbere toppen av hodet. Bruk små kirurgiske saks for å fjerne pelsen nær ørene.
- På dette punktet, satt på sterile kirurgiske hansker. Påfør jod og deretter alkohol (tre ganger) til hodebunnen.
- Ved hjelp av en skalpell, gjør et snitt rett ned på midten av hodebunnen og spre huden ved hjelp av bull dog klemmer. Ta en steril bomullspinne til å suge opp noe blod. Bruk av hydrogenperoksyd for å lette fremkomsten av bregma og lambda.
- Kontroller at hodet er riktig plassert ved måling av D / V og M / L koordinatene til bregma, og lambda. Koordinering forandringer bør være null hvis hodet er på et flatt plan. Juster hode og øret stenger som er nødvendig for å sikre et flatt plan.
- Finn bregma, og null koordinatene. Ved hjelp av de ønskede koordinater, flytte til venstre og høyre og lage et merke ved hjelp av en permanent markør. Ved hjelp av en cauterizer / markør, gjør en stor firkant rundt merket med nok plass til å nåønsket område.
- Ved hjelp av en steril roterende verktøy, bore rundt plassen mark. Suge opp blod med en steril bomull applikator. Grundig desinfisere borkronen før hver bruk.
- Fest MEA til heads og tilbakefylling pipetten med den første ønskede løsning. Være sikker på å få en åpning i pipetten uten oppløsningen slik at oppløsningen blir utvist kan undersøkes. Fest slangen til glasset mikropipette.
- Slå på nitrogen tanken og ejektoren trykk (psi = 5, tid = 0,6 s). Test (trykk manuell røde knappen) for å sikre pipetten ikke er tett før du begynner.
- Kalibrere mikropipette. Starter på 0 på retikkel og plassere et stykke blå tape på heads å angi startpunktet. Slå på den digitale leseren og tilbakestille den til null. Gå ned 1 mm (DV) og telle antall flått løsningen har beveget seg på trådkorset. 10 flått bør tilsvare 1 mm (1 mm = 250 nL), slik at en hake = 25 nL.
- Plassere referanseelektroden i enfjerntliggende sted fra den MEA slik at det fortsatt er i fluidkommunikasjon med hjernen for å fullføre kretsen.
- Finn bregma med MEA festet og null den digitale leseren. Flytt MEA til de ønskede koordinater. Senk MEA til spissen berører hjernen. Zero DV koordinere og sakte lavere MEA inn i hjernen.
- På opptaket program, klikk på ønsket kalibrert elektroden og klikk på "Utfør Experiment". Systemet vil da begynne å ta opp toniske nivåer for analytten av interesse, mens dyret er bedøvet.
- Zoomer til en akse som vil hjelpe i å observere basislinjen og tillate at lektroden til basislinjen etter 20 - 45 min.
- Etter at basislinjen er stabil, innstilling av trykk ejektoren til .6 s og 5 psi og trykk på den røde tasten på trykkutløseren for å utløse. Registrerer tiden og trykket samt volum / flått beveget på arket injeksjon (figur 2). Gjør eventuelle notater som er nødvendig (dvs.høyere topper, fortynning effekter, tett pipette, støyende baseline / o-scope).
- For glutamat injeksjoner, vent i 3 - 5 min mellom injeksjonene. For KCl injeksjoner vente 1 - 2 minutter mellom injeksjonene. Injiser anvendelse av samme trykk og tid på minst 3 ganger. Endre tid og gjenta. Prøv å ikke endre trykk mindre mikropipette er tett.
- Dersom mikropipette er tilstoppet, øke trykket opp til 30 psi.
- Ta opp fra de ønskede områder av hjernen, gjentatt på begge sider av hjernen ved hjelp av ulike løsninger. Ta opp en grunnlinje i hver ny region i 20 min.
- Ta MEA med mikropipette festet, skyll med DI vann og suge i PBS over natten før alt blodet er borte.
- Avlive dyret og lagre hjernen i en pre-merket rør og lagre i -80 ° C fryseren eller holder den ene siden for fiksering. For å avlive dyret, overdose med isofluran (inhalering). Utføre halshogging ved hjelp av kirurgisk saks og dissekere ut de ønskede områdene.
7. Rengjørings Belagte MEAs etter Bruk
- Ikke rengjør MEAs hvis ubrukt. Hvis det er lo eller støv på overflaten, vask med metanol og lar tørke i 24 timer før belegging.
- Slå på vannbad (80 ° C) og suge tuppen av MEA i 30 min. Tørk forsiktig tuppen av elektroden med en bomulls tippet applikator for å fjerne eventuelle rester som kan være igjen på elektrodespissen. Får ikke svart "isolasjon del" av MEA våt.
- Ved hjelp av tre forskjellige sonikatorer, suge spissen av MEA i (1) Citrisolv, et kommersielt oppløsningsmiddel og klarings-middel (2) isopropyl, og (3) DI vann i 5 min. Tørk forsiktig spissen av elektroden med bomull tippet applikator for å fjerne eventuelle rester som kan være igjen på elektrodespissen.
- Undersøke tipsene under ett dissekere mikroskop for å sikre lagene har blitt fjernet.
8. Analyse
- For å analysere dataene,først eksportere ønsket eksperiment ved å dobbeltklikke det ferdige eksperimentet og velge "eksportere data" fra rullegardinmenyen fil.
- Lagre disse dataene til den ønskede filen plassering og åpne opp analyseprogram. Klikk "Open" i analyseprogrammet og velg den nylig lagrede filen.
- Gi programmet en liten stund å laste opp filen, og deretter sjekke eksperiment under kategorien hendelsesmarkører. Under produksjonen, sjekk av for de ønskede parametere. For eksempel, skriftlinje, amplitude, topparealet (areal under kurven), T stiger, og T 80.
- Klikk på refresh og deretter analysere for å eksportere dataene til et regneark (dette kan ta noen minutter). Programmet vil gi en melding om å lagre filen på ønsket sted. Når du har lagret, kan filen redigeres i et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Selv om denne teknologien kan brukes til å måle endringer i glutamatergic signalanlegg i mange typer dyremodeller, for eksempel traumatisk hjerneskade, aldring, stress, og epilepsi, her viser vi hvordan MEA teknologien kan brukes til å undersøke glutamat endringer i transgen musemodell av menneskelig tauopati 19, 20. Den RTG (TauP301L) 4510 mus uttrykker P301L mutasjon i tau forbundet med frontotemporal demens og Parkinsons sykdom knyttet til kromosom 17, og blir ofte brukt til å studere tau patologi assosiert med Alzheimers sykdom, neurodegenerative tauopatier og frontotemporal demens. Vi viser også at glutamatergisk kan modifiseres ved farmakologisk intervensjon. Vi behandlet TauP301L mus med riluzol, et FDA-godkjent sykdomsmodifiserende medikament for amyotrofisk lateral sklerose (ALS) som modulerer signalering glutamatergisk ved å stabilisereinaktivere tilstanden til spenningsstyrte natriumkanaler, noe som fører til en reduksjon av glutamatfrigjøring, og en forsterkning av glutamat opptak via en økning av glutamat transporter uttrykk, som fører til økt glutamat klaring 30, 31, 32, 33.
Vi har valgt denne datakilden for demonstrative formål for fire grunner. Først demonstrerer dette datasettet tidsoppløsningen av systemet, som vist ved vår evne til å måle den raske dynamikken i forbigående frigjøring og opptak av glutamat. Dessuten oppviser denne prekliniske dyremodell forandringer i tonic glutamat, glutamatfrigjøring, og glutamat klaring, slik at for et eksempel på endringer i hver takt. Sekund, benytter dette datasettet, med høy romlig oppløsning som tillater måling av subregion forskjeller i DG, CA3, ennd CA1 av hippocampus er demonstrert. For det tredje tillater denne data for demonstrasjon av hvordan farmakologisk intervensjon kan gis for å redusere glutamat forandringer observert i prekliniske dyremodeller. Til slutt, fordi dette preklinisk modell har endringer i glutamatfrigjøring, er behovet for forsiktig tolkning av glutamat klaring i nærvær av endrede glutamatfrigjøring kan forklares.
Etter å ha nådd en stabil basislinje, som indikert ved <0,004 nA / min endring i skråning (10 - 20 min), vi først målte tonic glutamat nivåer (pM) ved å beregne gjennomsnittet ekstracellulær glutamat nivåer over 10 s før enhver anvendelse av løsninger. Vi har imidlertid observert øket tonic glutamat nivået i CA3 og CA1 regioner av TauP301L mus, og riluzol gjen toniske glutamat nivåer til den for kontrollgruppen (figur 3A). Deretter KCl lokalt ble levert (ved hjelp av en mikropipette) til hver av de tre underregioner i en hemisphere hver 2-3 min. Etter 10 reproduserbare signaler, noe som er en indikasjon på en intakt glutamat neuronal systemet 34, ble resultatene gjennomsnitt av for hver gruppe og den gjennomsnittlige amplitude sammenlignet. Representative spor (figur 3B) viste økt glutamatfrigiving i TauP301L mus etter påføringen av KCl i alle tre underregioner (bare CA3 er vist), en effekt som ble reddet av riluzol behandling (Figur 3C).
MEA ble deretter beveget til den motsatte halvkule og tillatt å nå en stabil basislinje (10 - 20 min) før eksogent glutamat ble anvendt for å undersøke glutamat klaring (figur 4). Varierende volumer (50 til 250 NL) på 200 pm sterilfiltrert glutamat-oppløsning ble påført til det ekstracellulære rom hver 2 - 3 minutter, og den netto areal under kurven (AUC) ble anvendt som et mål på glutamat-opptak. Denne raske anvendelse av glutamat i than ekstracellulære rom, gjør det mulig å etterligne av endogent glutamat-frigjøring og måling av glutamat-opptak. Fordi glutamattransportører oppviser Michaelis-Menten-kinetikk 35, et volumområde - er (50 250 nL) av eksogent glutamat injiseres for å eksponere forskjeller i opptak. For å gjøre dette, mottar hvert dyr 1 - 2 injeksjoner på 50 Nl intervaller innenfor 50 til 250 nL rekkevidde. Selv om man bør alltid bekrefte at det injiserte volum per gruppe per region er ikke statistisk forskjellige ved P ≤ 0,05 nivå, er den beste måten å sikre nett AUC er relatert til opptak, og ikke mengden av glutamat påført eller diffusjon, er å sikre at både amplitude (figur 4A) og T stigning (et mål for diffusjon fra punktkilden (mikropipette) til den MEA i figur 4B) ikke avviker 10, 11, 19, 20. dette allows for "peak matchende" amplitudene (figur 4c), slik at forskjeller i netto AUC antas å være på grunn av forskjeller i opptak og ikke påført mengde eller diffusjon. Topptilpasning er særlig viktig når dyrene har eksisterende forskjeller i glutamatfrigjøring. Fordi en rekke volumer injiseres, er variansen for både amplitude og T stigning er ofte store og tilsetning av ytterligere dyr nedsetter ikke variansen for disse tiltakene, som de er iboende i konstruksjonen. På grunn av at amplituden og T økning var lik mellom gruppene i hvert underområde (figur 4A, 4B), antar vi at forskjeller i netto AUC (figur 4C, 4D) er på grunn av forskjeller i glutamat opptak. Riluzol forbedret glutamat klaring sammenlignet med kontroller i alle tre underregioner (Figur 4D). Endelig er en MEA med en vedlagt mikropipette brukes til lokal bruke et fargestoff for å bekrefte MEA plassering etter hjerne seksjoneringDette er vist i figur 3D.
Disse data indikerer at den MEA teknologi er i stand til å måle nevrotransmitterfrigivelse i løpet av mindre underområder i hippocampus 24, 25, i motsetning til tidligere teknikk (for eksempel, mikrodialyse), som bare er tatt opp fra store prøve områder og ofte skadet nervekretser 28, 29. I tillegg MEAs gir oss høy tidsmessig oppløsning for å måle den raske kinetikk for glutamatfrigjøring og klaring 25.
Figur 1: In Vitro Kalibrering av en selvreferer microelectrode måle endringen i Current (PA) på en Glutamat oksidase nettsted (GluOx, rød) kontra en Sentinel nettstedet (Sendt; blå). Den interfererende askorbinsyre (AA: 250 uM) og dopamin (DA: 2 uM) endret ikke strømmen til enten glutamat oksydase eller fast punkt områder. Tilsetning av glutamat (Glu: 20, 40, 60 pM) ga en trinnvis strømøkning på glutamat oksydase området, men ingen endring på fast punkt området. Hydrogenperoksyd (H 2 O 2: 8,8 uM) frembragte en økning i strøm på begge sider. Følsomhet, helling, deteksjonsgrensen, og R2-verdier ble beregnet etter kalibrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempel på et Elektroarbeidsskjemaet. Dette regnearket omfatter kolonner for tidspunktet for injeksjon eller injeksjon nummer (TIME / TTL), hjerne koordinater (AP, ml, DV),mengden av trykk som utøves (nitrogen), lengden av trykket (tid), og det injiserte volum ved trykket ejektoren. Merknader, slik som odde signaler eller tilstopping av mikropipette bør registreres i notene kolonne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Ekstracellulær tonic og kaliumklorid (KCl) -evoked frigjøringen av glutamat i DG, CA3, og CA1 Regioner av Hippocampus. (A) I de CA3 og CA1 regioner av hippocampus, toniske glutamat nivåene var signifikant økt i vehikkelbehandlede TauP301L mus (Veh-TauP301L), en effekt svekket ved riluzol behandling. (B) Basislinje-matchet representative opptak av KCl-fremkalt glutamatfrigiving i CA3 viste r iluzole behandling (Ril-TauP301L) reduserte den betydelige økningen i amplituden av glutamatfrigiving observert i Veh-TauP301L mus. Lokal påføring av KCl (↑) ga en sterk økning i ekstracellulær glutamat som raskt tilbake til spenningsnivåer. (C) Den betydelig økt KCl-fremkalt glutamatfrigiving observert i Veh-TauP301L mus i DG, CA3, og CA1 etter lokal påføring av KCl ble svekket med riluzol behandling. (D) kresylfiolett-farget 20 pm snitt av hippocampus viser plassering av MEA spor i CA3 og CA1 (Gjennomsnitt ± SEM; ** p <0,01 vs. Kontroll Veh-Veh-TauP301L, # p <0,05 Ril-Tau- P301L vs. Veh-TauP301L, ## p <0,01 Ril-TauP301L vs. Veh-TauP301L; n = 14 - 19 / gruppe). Dette tallet gjengitt med tillatelse fra John Wiley and Sons 19, 20.rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Glutamat Uptake Etter Eksogent Glutamat Anvendelse i DG, CA3, og CA1 Regioner av Hippocampus. (A) Amplituden av lokalt påførte glutamat signal var lik mellom grupper i hver region. (B) T stige, en indikator på glutamat diffusjon fra mikropipette, var lik mellom gruppene i hver region. (C) Eksempler på glutamat signaler i CA3 fra lokal applikasjon av glutamat i Veh-kontroller, Veh-TauP301L, og Ril-TauP301L mus. (D) Riluzol behandling reduserte signifikant økning i nettoarealet under kurven (AUC) observert i Veh-TauP301L mus i alle 3 områder i hippocampus, som indikerer forbedret glutamat opptak i riluzol-behandlede TauP301L mus (Gjennomsnitt ± SEM; * p <0,05 vs. Kontroll Veh-Veh-TauP301L, ** p <0,01 vs. Kontroll Veh-Veh-TauP301L, # p <0,05 Ril-TauP301L vs. Veh- TauP301L, ## p <0,01 Ril-TauP301L vs. Veh-TauP301L; n = 13-15 / gruppe). Dette tallet ble gjengitt med tillatelse fra John Wiley and Sons 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 0,05 M PBS | 2 l DI-vann: |
| Lagres i begerglass omviklet med aluminiumsfolie. Bringe pH til 7,4 med KOH om nødvendig. | NaH 2PO 4-H 2O: 2,8 g Na 2HPO 4: 11,34 g Natriumklorid: 11.68 g |
| 20 mM askorbinsyre 50 mL DI vann: | |
| Gjør fersk daglig. | Askorbinsyre: 0,18 g |
| 20 mM L-glutamat | 50 mL DI vann: |
| Lage fersk ukentlig. | L-glutamat-mononatriumsalt-hydrat: 0,15 g |
| 2 mM Dopamin | Dopamin-hydroklorid: 0,038 g |
| Lage fersk månedlig. | 0,1 M Perchlorsyre: 10 ml bringe volumet til 100 ml med DI-vann |
| 8,8 mM Hydrogen Peroxide | 50 mL DI vann: |
| Lage fersk ukentlig. | Hydrogenperoksyd: 500 ul |
| 70 mM kaliumklorid | 100 mL DI vann: |
| Gjør frisk dag eksperiment. | Kaliumklorid: 0,08 g Natriumklorid 0,07 g Kalsiumklorid: 0,004 g |
| 200 μ; M Glutamat | 20 mM glutamat: 100 ul |
| Gjør frisk dag eksperiment. | Steril saltoppløsning: 10 mL |
Tabell 1: Kalibrerings Solutions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MEA teknikk tillater måling av raske kinetikk for nevrotransmitter-frigjøring og opptak in vitro og in vivo. Derfor frembringer den teknologi en rekke datautgangs inkludert tonisk nevrotransmitter nivåer fremkalt frigjøring av nevrotransmittere og nevrotransmitter klaring. Men fordi bruk av MEAs er en relativt komplisert prosedyre, er det mange faktorer som kan trenge å være optimalisert for vellykket bruk. For eksempel, i løpet av kalibreringen, kan man være oppmerksom på at det ikke er noen signalbølgeformer (oscilloskopskjermen) eller som respons på stimulering er minimale, eller fraværende. Trolig på grunn av en systemfeil, starte innspillingen system, eller en datamaskin, kan det løse problemet. I tillegg kan problemet være en tilkoblingsfeil. Før kalibrering, er det relevant å dobbelt kontrollere at MEA og referanseelektrodetilkoblinger er riktig tilkoblet. Utskifting av DIP-kontakten på heads kan løse MEA tilkoblingsproblemer.Dersom MEA er ikke fullstendig i oppløsning eller en dårlig vedlikeholdt referanse-elektrode blir brukt, kan disse også innvirke på opptaks under kalibrering. Avtok signalreaksjoner under kalibrering er et annet vanlig problem, som kan resultere fra en tykkere enn nødvendig BSA / glutaraldehyd blanding, eller en langsomt roterende rørestav. I det tilfelle at interfererende gir et signal under kalibrering, er det mulig at det var en feil i elektroplettering (for eksempel ikke electro lenge nok) MPD utelukkelse lag. I et slikt tilfelle, gjentar galvanisering prosedyre er nødvendig.
Under operasjonen, kan en bedøvelse nivå ikke være tilstrekkelig for alle mus; noen mus kan kreve høyere nivåer av anestesi for å "gå under" og noen mus kan kreve mindre. Det er viktig å starte på et lavt nivå av anestesi og langsomt øke det til musen er under lett bedøvelse. Dyp anestesi kan testes etter at mus er i den stereotaksiske anordning ved enhale eller tå klemme. Ved valg av koordinater for implantering av MEA, er det også viktig å legge merke til og korrigere for mulige hjerne atrofi som kan forekomme i mange neurodegenerative dyremodeller 36, 37, 38. I tillegg er det viktig under operasjonen at blodet ikke samler seg på MEA, da dette kan påvirke registrerings egenskaper av MEA og resulterer i langsom tidsmessig oppløsning eller i stor grad minimalisert signalreaksjoner. Hvis blodpropper rundt elektroden, fjerner MEA og skyll med saltvann.
Under opptak, er en av de vanligste problemene som kan oppstå som en støyende signal. Interferens fra andre elektroniske enheter, som utvendig lys, flere instrumenter, og øvelser er det for det meste sannsynlige årsaker, slik at det er best å unngå å plugge dem inn i samme elektriske krets og / eller utløp som registreringssystemet. I tillegg, hvis de system er ikke jordet på riktig måte, vil man observere svingninger på oscilloskop av opptaket systemet samt støy stammer fra alle områder, og ikke bare de innspillingssteder. Den anbefalte jordingsmatte i henhold til opptakssystemet må være koblet til en jordet rør for å unngå disse problemene. Dersom det blir bestemt at ingen av disse er den feil, kan feilen ligge med referanseelektroden eller den MEA selv. Når møter problemer med støy, ved hjelp av en ny, ubrukt MEA for å kontrollere driften av systemet kan være en nyttig tilnærming feilsøking. Dersom frakobling eller skifte referanse elektrode resulterer i liten eller ingen forandring, kan referanseelektroden eller halvcellen har en feil. Skifte referanseelektrode kan være den eneste måten å løse problemet. Når opptaket er fullført, en endelig fordel med den MEA er evnen til å rengjøre og bruke dem på nytt. MEAs kan brukes på nytt omtrent tre ganger så lang som den MEA fortsetter å virke tilfredsstillende under kalibrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GG er den eneste eier av Quanteon, LLC som gjør FAST-16 registreringssystemet som brukes for glutamat målinger i denne studien. JEQ er en betalt konsulent for Quanteon.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences (MNR, U54GM104942), NIA (MNR, R15AG045812), Alzheimers Association (MNR, NIRG-12-242187), WVU fakultet Forskning Senatet Grant (MNR), og WVU PSCOR Grant (MNR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
