Summary
在这里,我们描述了用于测量补药和采用酶联微电极阵列(MEA) 在体内阶段性细胞外谷氨酸的变化的空间和时间上精确的方法的设置,软件导航,和数据分析。
Abstract
神经递质的破坏往往是中枢神经系统(CNS)疾病的一个重要组成部分,发挥着病理阿尔茨海默氏症,帕金森氏症,抑郁症和焦虑潜在的作用。传统上,微透析一直是最常见的(赞美)技术检测发生在这些疾病中神经递质的变化。但由于微透析具有测量跨组织的大面积慢1-20分钟变化的能力,它具有侵袭性的缺点,可能会破坏大脑和慢速采样能力范围内的内在联系。一个相对较新的技术中,微电极阵列(MEA),具有用于所发生的测量的离散的大脑区域中的特定神经递质的变化,使得用于空间和时间上精确的方法的许多优点。此外,使用的MEA是微创,允许体内的神经递质的改变的测量。在我们的实验室,我们哈去过在神经递质谷氨酸,与阿尔茨海默氏病的病理变化特别感兴趣。这样,这里所描述的方法已经被用于评估在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中的潜在谷氨酸海马中断。简言之,该方法涉及使用涂布用酶对感兴趣,并使用自参照位点以减去背景噪声和干扰神经递质非常有选择性的多站点微电极。电镀和校准之后,可以MEA用微量被构造和使用立体定位设备下降到感兴趣的大脑区域。在此,所描述的方法涉及麻醉RTG(TauP301L)4510只小鼠和使用立体定位装置精确地定位子区域海马(DG,CA1,CA3和)。
Introduction
在大脑中的神经递质测量改变为神经科学家研究中枢神经系统(CNS),其通常的特征在于神经递质失调的疾病的重要工具。虽然微透析在用高压液相色谱法(HPLC / EC)组合已经以测量细胞外神经递质水平1,2,变化的最广泛使用的方法3, 图4,微透析探针的空间和时间分辨率可能不是理想的神经递质,如谷氨酸,被在细胞外空间5,6紧密调节。因为在遗传学和成像的最新进展,存在可用于在体内映射谷氨酸的其他方法。使用基因编码谷氨酸荧光记者(iGluSnFR)的ð双光子成像,研究人员能够通过在体外和体内 7,8,9的神经元和星形胶质细胞可视化的谷氨酸释放。值得注意的是,这允许从更大的视场记录和不破坏大脑的内在联系。尽管这些新的光学技术允许谷氨酸动力学和感官诱发反应和神经元活性的测量可视化,它们缺乏量化离散脑区域外空间的谷氨酸的量的能力。
另一种方法是酶联微电极阵列(MEA),其可以选择性地测量细胞外神经递质水平,如谷氨酸盐,通过使用自参考记录方案。该MEA技术已用于研究创伤性脑细胞外谷氨酸的变化损伤10,11,12,老化13,14,应力15,16,癫痫17,18,阿尔茨海默氏病19,20,和病毒模拟物21的注射和代表了在微透析中固有的空间和时间限制的改进。而微透析限制测量突触22,23附近的能力,具有的MEA具有高的空间分辨率,其允许细胞外谷氨酸溢出的选择性措施附近突触24,25。第二,微透析的低时间分辨率(1 - 20分钟)限制了调查的能力谷氨酸释放和清除的快速动力学在毫秒发生的第二范围26。因为谷氨酸的释放或间隙差异补品的措施,休息谷氨酸水平可能并不明显,这可能是必要的谷氨酸释放和间隙直接测量。 MEA的允许这样的措施,由于其高的时间分辨率(2赫兹)和检测的下限(<1微米)。第三,允许的MEA用于特定脑区域内神经递质分区域变型中,如大鼠或小鼠海马的检查。例如,使用的MEA我们可以分别针对齿状脑回(DG),海马,它们经由trisynaptic电路27连接的大角ammonis 3(CA3)以及大角ammonis 1(CA1),以检查细胞外谷氨酸的分区域的差异。造成通过植入28 < - (4毫米的长度1)和损坏,因为微透析探针的大小的/ SUP>,29,分区域的差异是难以解决。此外,光学系统仅允许通过刺激的外部刺激,例如晶须刺激或光的闪烁,这不允许分区域的刺激7。比其他方法的多边环境协定的最后一个好处是研究在体内这些次区域没有打乱他们的外在和内在联系的能力。
在这里,我们描述了如何在组合的记录系统( 例如 ,FAST16mkIII)用的MEA,其由基于陶瓷的多点微电极,可以有差别地涂覆在记录位点以允许干扰试剂要被检测和从分析物信号中除去。我们还证明这些阵列可用于麻醉RTG的CA1海马亚区的DG,CA3内体内谷氨酸调节基于电流分析法研究,和(TauP301L)4510只小鼠中,通常使用的米阿尔茨海默病的乌斯模型。此外,我们通过用利鲁唑小鼠提供MEA系统对谷氨酸释放和清除的快速动力学的敏感性的确认, 在体外所示的药物以减少谷氨酸释放和增加谷氨酸盐摄取30,31,32,33,并展示在 TauP301L小鼠模型中的体内这些相应的改变。
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Protocol
1.涂层用酶或矩阵层的微电极阵列
- 制备蛋白质基质溶液
- 称出10毫克的牛血清白蛋白(BSA)和转移到1.5毫升离心管中。
- 添加去离子水985μL含有BSA的微量离心管中。混合通过人工搅拌溶液(使用1000μL吸管〜3次重新移液,直到BSA溶解)。
注:请不要使用涡的解决方案,因为这样做可能会导入空气的混合溶液。另外,吸液管设定为体积<1000μL( 例如 700μL),以避免引入气泡。该溶液可以,如果必要被放置在微量。 - 一旦BSA溶液溶解,加入5μL25%戊二醛溶液。 5倍 - 通过反转封闭管3混合溶液中。将得到的溶液在1%BSA与0.125%戊二醛。
- 抛开蛋白基质SOLU和灰5分钟。该解决方案将出现在颜色浅黄色。
- 制备所需的酶溶液( 例如 ,谷氨酸盐氧化酶)
- 通过添加过滤的DI水至冻干制备谷氨酸氧化酶溶液,纯化的酶( 例如 ,添加到25个单位的谷氨酸氧化酶的50微升去离子水,得到0.5U /μL)。
注意:分装储液( 例如 ,1微升),并在-20℃下,在适当大小的容器( 例如 ,500个微升的微量离心管)的等分试样储存。等分试样可被存储在这些条件下长达6个月。 - 添加BSA /戊二醛溶液含有谷氨酸氧化的离心管等分的4μL。混合通过人工搅拌的溶液(再吸移用10μL移液器。移液管应设置为体积<5μL)。将得到的溶液在1%BSA,0.125%戊二醛和0.1U /μL谷氨酸氧化酶。使用该解决方案为立即涂层。
注意:谷氨酸氧化酶涂布液可以仅在15分钟内使用。虽然若干MEA可以与一个制备的溶液被涂覆,建议不超过谷氨酸氧化酶的可用时间窗口。可以在15分钟内进行涂覆的电极的数量而变化。一般地,4至6个电极可同时被涂覆。
- 通过添加过滤的DI水至冻干制备谷氨酸氧化酶溶液,纯化的酶( 例如 ,添加到25个单位的谷氨酸氧化酶的50微升去离子水,得到0.5U /μL)。
- 涂层MEA
- 典型地,涂层的一对记录位点(S)上与所需的酶(谷氨酸氧化酶)一个MEA和一对不同的记录部位(一个或多个)(“前哨”位点(一个或多个))的涂有非活性蛋白基质。
- 使用钝尖汉密尔顿microsyringes(例如,10微升)以涂覆的MEA与L-谷氨酸氧化酶或无活性蛋白基质溶液(BSA +戊二醛)。用于酶或无活性蛋白的基质涂层的步骤是相同的。
- 使用前后清洁注射器(3个冲洗用DI水,冲洗3次用甲醇,5次漂洗用DI水)。
注:专用注射器用于施加酶(谷氨酸氧化酶)或蛋白质基质的涂层。 不要使用同一个注射器的不同的解决方案。建议的酶的涂层之前进行蛋白质基质的涂层。 - 制定谷氨酸氧化酶或蛋白质基质用10μLHamilton注射器。轻轻按下柱塞在注射器尖端(使用解剖显微镜可视化)以分配的溶液中的小珠。
- 使用解剖显微镜定位的MEA记录点,通过短暂地接触与溶液液滴/小珠,它代表一个层中的记录点的溶液应用到相应的记录点。三个层是足够实现该蛋白质 - 基质和酶的外套。厚的层可降低MEA的灵敏度。
- 升高溶液滴直线上升和关闭录音的网站( 即 syrinGE尖端不应跨越MEA表面刮去)。
- 设定计时器1分钟。这是涂层应用到记录站点(多个)之间的最小时间要求。允许涂覆酶的MEA,在4℃下固化5-7天。
- 记录应用大衣的数量,花了多长时间来应用涂料,电极数量和名称和日期在实验室笔记本。
2.电镀与间苯二胺为改善的选择性
- 制备间苯二胺二盐酸盐(MPD)溶液
注:板排斥层,的mPD,以防止多巴胺等大,干扰分子( 例如 ,抗坏血酸)的氧化,从而提高了传感器,用于谷氨酸/ H 2 O 2过其他潜在-干扰分子的选择性。- 在容量瓶中测量50毫升的0.05M磷酸盐缓冲盐水(PBS)和转移的0.05 50mL的的PBS至更大(150mL)中的锥形瓶中。
- 使用连接到一个氮气罐( 例如 ,使用管连接的喷射器的压力)的管路,附加一个移液管尖端( 例如 P200尖端)到管道的开口端。放置用在PBS溶液中的附枪头管和覆盖用封口膜松散的溶液。打开氮气,轻轻泡液20分钟。
- 权衡0.045克的mPD。
注意:主水平基准是一种潜在的致癌物质。的mPD称重应该使用包含在通风橱内的规模进行。使用主水平基准时,戴上手套和口罩。确保油烟机是功能和窗框被拉到合适的工作水平。可能已被污染的mPD立即清洁表面,以避免永久性染色。 - 冒泡后,所有的MPD的转移到脱气PBS液。盖上开瓶封口膜,轻轻漩涡溶液溶解的mPD在溶液中。避免aggressivë混合或使用涡流的,因为这样做可能引入气体到溶液中。
- 将溶液转移到一个50毫升烧杯中。搅拌棒,是没有必要的。
- 电镀电极
- 获得参考电极。使用专用于只的mPD电镀参考电极。用于校准程序不同的参考电极。
- 在烧杯中的参比电极保持器的塑料臂位置。检查在玻璃参考电极气泡(可能不能够看到)。轻轻拂去参考电极的远端处的尖端,以除去任何气泡。
- 放置参考电极通过在塑料臂的开口和下部到含有PBS的烧杯中。确保参考电极不接触烧杯的底部。
- 参考电极连接到探头( 例如,2 PA / MV)和连接( 例如 DIP连接器)的MEA为板的mPDd发送到探头。
- 降低MEA放入烧杯溶液使得仅MEA尖端在溶液淹没。不超过所述黑色“泡沫”(黑色绝缘位于MEA尖端以上)液体浸没MEA提示。这样做可能会损坏MEA。
- 运行“测试”校准验证电极通道和连接到探头的功能。
注:虽然硬件设置应体现设备正在使用,涉及到被分析物/干扰类型和浓度细节没有为“测试”校准输入。再编码模式应该是“电流分析法”和“V-施加”应该是-0.7V。验证的典型记录对于所有信道。 - 通过选择“取消”在所有的记录点的连接进行验证取消。这是没有必要保存校准数据。
- 选择桌面上的“电镀”图标。电镀要OL菜单会出现。确认被输入了正确的设置:
PP振幅:0.25
偏移:-0.5
频率:0.05
持续时间(分钟):20 - 选择“暂停”按钮,开始电镀。已用时间字段应该开始倒计时。
- 完成后(所有经过的时间),选择在弹出菜单中的“另一个MEA”开始的mPD电镀附加的MEA。更换待镀的mPD与MEA镀MEA和使用电镀工具重复电镀过程。
注:建议使用不超过2倍或1个小时的时间内将制备的mPD的解决方案。准备一个新的解决方案,准备2周以上的多边环境协定。 - 选择“退出软件”来完成电镀。校准之前冲洗用DI水(以避免盐残基)和存储(24小时)的mPD镀电极尖端。
- 从溶液中去除所述参考电极和放置到适当的S前用DI水冲洗torage溶液( 例如 3M NaCl的)。确保参考电极尖端被浸没在溶液中。慢慢下玻璃参比电极到该溶液中,以避免损坏玻璃。
- 处置在适当标记的有害废物容器中的mPD溶液。
3.校准为谷氨酸检测和选择性的MEA(图1)21
- 准备需要校准的解决方案。
注:请参阅表1。 - 在恒定搅拌下进行校准,在37°C(磁性电池操作的搅拌器)。打开加热垫或循环水浴,将获得一个小的搅拌棒。慢慢搅拌,但速度不够快,当除了由(如下图),很快达到了新的高度。
- 的探头(2 PA /毫伏)连接到记录控制系统,并插入MEA尖成40毫升搅拌的0.05M的PBS(使用50毫升的烧杯中)。
- 连接Reference电极。弗里克结束,以确保有没有气泡。
- 打开记录程序,并单击“校准”。确保设置正确(检查哨点选择,因为这可能与不同的电极改变),选择MEA号码并按下“开始”。
- 允许5 - 10分钟以达到平衡;开始一旦基线已经稳定(<0.004 NA /分钟变化)。
- 选择“基线”,并添加500 20μL1mM抗坏血酸(干扰;终[250μM])并选择“干扰物”(AA被认为是脑宽干扰)一旦电流达到了新的,稳定的平台期,如果任何。允许0.5 - 加入之间1分钟。如果MEA正常电镀,几乎没有变化应得到遵守。
- 添加20mM的L-谷氨酸(最终[20μM])的40μL,并且一旦电流达到一个新的,稳定的高原,标记1 次加法“分析物”。重复三次,总共3 glutamat的Ë补充。
- 加入40微升DA。 不要选择 “分析物”;选择“测试物质” - DA可能只包含DA方面的干扰。
- 加入40微升过氧化物。 不要选择 “分析物”;选择“测试物质”。
- 一旦校准完成后单击“停止”按钮。
- 为了确定MEA的功能,单击计算选项卡,并记录在实验室笔记本下面的参数。
- 在这些校准中使用的MEA的设计(3000微米2),使用MEA与≥0.004 NA /μM的斜率,但较低的斜坡可用于某些实验。如果有小于在酶包衣和未包衣站点之间斜率的10%的差异,然后利用这些的MEA用于诱发释放仅或清洁/丢弃该MEA。
- 使用检测(LOD)的限制≤1.5微米。如果LOD大于1.5微米时,则使用这些多边环境协定的诱发release和只摄取。不要使用这些电极记录进补水平。
- 使用的选择性超过> 20个任意单位的干扰的期望的分析物( 即 ,谷氨酸)。如果选择性小于20,则清洁/丢弃MEA。
- 使用≥0.90的校准曲线的线性度(R 2)。如果线性度小于0.90,则清洁或丢弃MEA。
- 保存与MEA,日期#文件,和人的校准缩写。
4.组装的微
注:微量移液器(毛细管玻璃)应具有的尖端具有10的内径 - 15微米。
- 将微量集中所有的四个铂记录点之间,并使用粘蜡和橡皮泥装50-100微米以上的MEA。
- 加载微量,使用1mL注射器填充有谷氨酸或KCl溶液,用0.22μm的无菌注射器过滤接r和97姆·隆恩,28号移液管填料,回填微量。也就是说,插入针在微管的顶部和微量(朝MEA结束)的底部填充,确保没有气泡。
- 附加微量到压力喷射系统在2 - 20psi下约1秒。
5.板的微型参比电极在体内使用
- 制备电镀液(50克NaCl / 90毫升的1摩尔HCl的100mL烧杯(镀浴))并切断浴电极(〜铂的10cm长(Pt)的金属丝(〜直径0.02" ))。
- 切断10 - 15cm长片Teflon涂层的银线(0.008" 裸)的,并使用刀片从银线的端部的每一端刮掉约1cm聚四氟乙烯涂层的。
- 焊接在一端具有金引脚和裸露的银导线的一端放入镀浴。
- 使用DC适配器(仅使用具有〜9的输出端的DC适配器 - 15 VDC最大),夹紧“红”(+)上的金销侧线到制备的银线(参比电极)。夹住“黑”( - )导线铂浴阴极。
- 插上DC适配器。寻找正确的电镀工艺 - 泡沫应该出现在浴电极;参考电极变成银/灰色。
注意:不要开关引线部分黑色( - )对红(+) -镀液会发生这种情况时和新鲜的电镀液需要进行毁了。一个坏的解决方案将在颜色变黄: 不要使用!
注:电镀反应进行2-5分钟通常:AG 0 + Cl -的氯化银→+ E - - 测试参考电极。
- 设置一个万用表到100 - 200 mV的DC设置。
- 放置一个基准(即,已知的可正常工作的先前测试的电极)在3M NaCl的参比电极和测试对新镀参考电极。
注意:如果我们荷兰国际集团一个新的参考电极,浸泡在3M NaCl的使用前(12个小时推荐)。 - 放置“ 红 ”(+)引线的参考电极的金销上进行测试。将“ 黑 ”( - )对基准电极引线。可接受的读出范围为±10毫伏。 0毫伏是跨越2个参考电极理想。
6.一般动物手术治疗MEA录音
- 准备手术
- 前一天晚上将手术工具消毒。
- 从消毒液中取出工具,彻底冲洗后放入工具,在无菌手术垫。获得一个加热垫。
- 校准两个电极和作为程序3和4所述连接微量。
- 使参比电极如第5中描述。
- 让200μM谷氨酸和70毫米氯化钾。请参阅表1。
- 获取动物并记录手术床单它的重量。
- 准备麻醉并打开加热垫。
- 执行MEA手术
- 使用异氟烷(在氧4%的流量),麻醉动物在感应室,直到所述呼吸速率已显著下降,动物不到脚趾或尾巴捏响应。记录呼吸频率和体温,每15分钟。
- 使用耳酒吧稳定头放置动物的立体定位装置。确保动物的安全性和头部不动。降低异氟烷流动到1.5 - 在氧为3%。确保加热垫被适当地定位在动物和下设定为37℃,以提供补充的热量。未能提供补充热量可能导致深低温和动物的过早死亡。
- 用消毒棉签应用眼膏,并记录呼吸频率和体温。使用电池供电的修剪器,刮头顶。使用小型手术剪,除去耳朵附近的皮毛。
- 在这一点上,戴上无菌手套手术。应用碘再用酒精(三次)到头皮。
- 使用手术刀,做一个切口直降头皮的中间,用斗牛犬夹波及皮肤。以无菌棉签来吸收任何血液。使用过氧化氢以促进前囟和lambda的外观。
- 检查头被适当地定位,通过测量D / V和前囟和lambda的M / L坐标。坐标的变化应该是零,如果头是在一个平面。调整头部和耳朵酒吧,既要保证一个平面。
- 查找前囟和零坐标。使用所需的坐标,移动到左侧和右侧,并用永久性记号笔做一个记号。使用cauterizer /标记,使周围的标志的大广场有足够的空间来达到所希望的区域。
- 使用无菌旋转刀具,钻头周围的方形标记。用消毒棉签吸收任何血液。彻底消毒钻头在每次使用前。
- 附加MEA到探头和回填与所述第一期望的溶液移液管。请务必留在吸管差距不解决方案,使被驱逐的解决方案可以参考一下。连接管的玻璃微。
- 打开氮气罐和压力喷射器(PSI = 5,时间= 0.6秒)。测试(按手动红色按钮),以确保吸管开始之前没有堵塞。
- 校准微量。从0开始到刻线,并放置了一块蓝色胶带上的探头,以表明启动点。打开数字阅读器,并将其重置为零。下井1毫米(DV)和计数蜱该解决方案已在光罩移动的数目。 10个蜱应等于1毫米(1 mm相当于250 nL)的,所以1个滴答= 25纳升。
- 放置在一个参比电极从MEA远程位置,使得它仍然在与大脑以完成电路液体接触。
- 查找前囟门附带的MEA和零的数字阅读器。移动MEA到所需的坐标。慢慢放下MEA直到尖端接触大脑。零的DV协调,慢慢放下MEA进入大脑。
- 在记录程序中,点击所需的校准的电极,然后点击“执行实验。”然后,系统将开始录制的目标分析物进补水平,而动物麻醉。
- 放大到一个轴,这将在观察基线帮助和允许电极与基线20 - 45分钟。
- 基线稳定之后,喷射器压力设定为0.6秒和5磅,然后按上的压力喷射器喷射的红色按钮。记录移动的喷射片( 图2)上的时间和压力以及体积/蜱。做任何必要的票据( 即较大峰值,稀释效应,堵塞的移液管,嘈杂基线/邻范围)。
- 谷氨酸注射,等待3 - 注射之间5分钟。对于氯化钾注射等待1 - 注射之间2分钟。注射使用相同的压力和时间的至少3倍。更改时间和重复。尝试除非微量堵塞不改变的压力。
- 如果微管堵塞,增加压力可达30磅。
- 从期望的大脑区域的记录,重复使用不同的解决方案的大脑的两侧。记录在每一个新的区域的基线20分钟。
- 采取与微管的MEA连接,用去离子水冲洗,并在PBS浸泡一夜,直到所有的血就没了。
- 安乐死动物并保存脑在预标记的管和储存在-80℃冰箱或保持一侧,用于固定。安乐死的动物过量异氟醚(吸入)。用手术剪刀执行斩首并剖析了期望的区域。
7.清洁涂层多边环境协定后使用
- 不干净的多边环境协议,如果不使用。如果有棉绒或灰尘的表面上,清洁用甲醇和让干燥涂布前24个小时。
- 放水浴(80℃)浸泡在MEA的尖端30分钟。小心地擦拭用棉花在电极的尖端涂药器以去除可能在电极尖端留下任何碎屑。不要让MEA湿的黑“绝缘部分”。
- 使用三种不同的超声波仪,浸泡在(1)Citrisolv,商业溶剂和清除剂(2)异丙基MEA的尖端,以及(3)去离子水5分钟。小心地擦拭用棉花电极的尖端涂药器以去除可能在电极尖端留下任何碎屑。
- 检查解剖显微镜下的提示,以确保该层已被成功删除。
8.分析
- 对数据进行分析,首先通过双击完成的实验,然后从文件下拉菜单中选择“导出数据”导出所需的实验。
- 这个数据保存到所需的文件位置和开拓分析程序。单击分析程序“打开”,然后选择刚刚保存的文件。
- 给节目几分钟上传的文件,然后将该事件标记标签下的实验。下输出,检查盒所需的参数。例如,基线,振幅,(曲线下面积)的峰面积,T 上升 ,和T 80。
- 点击刷新,然后进行分析,将数据导出到电子表格中(这可能需要几分钟)。该程序会提示将文件保存到所需位置。一旦保存,该文件可以在电子表格进行编辑。
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Representative Results
虽然这种技术可用于测量谷氨酸的改变在许多类型的动物模型,如创伤性脑损伤,衰老,压力和癫痫的信号,在这里我们展示了MEA技术如何可以用于检查转基因小鼠模型的谷氨酸改变的人tau蛋白病19,20。 RTG的(TauP301L)4510小鼠表达与额颞叶痴呆和帕金森综合征与染色体17相关的tau蛋白突变P301L,和通常用来研究与阿尔茨海默氏病,神经退行性tau蛋白病和额颞叶痴呆相关的τ病变的。我们还表明,谷氨酸信号可以通过药物干预来修改。我们处理的TauP301L小鼠利鲁唑,肌萎缩侧索硬化(ALS)的FDA批准的疾病修饰药物,它通过稳定调节谷氨酸能信号传导灭活电压门控钠通道的状态,导致谷氨酸释放的减少,并通过增加谷氨酸转运蛋白表达谷氨酸摄取的增强,从而增加了谷氨酸盐的间隙30,31,32,33。
我们选择了论证的目的这个特定的数据集有四个原因。首先,这个数据集演示了该系统的时间分辨率,如通过我们的测量瞬时释放和谷氨酸摄取的快速动态的能力。此外,此临床前动物模型中表现出补品谷氨酸盐,谷氨酸盐释放,和谷氨酸的间隙改变,从而允许在每个度量的变化的一个例子。第二,利用该数据集,该高空间分辨率,其允许在DG,CA3,子区域的差异的测量ND海马CA1是证明。第三,该数据允许对如何药物干预可用于减轻在临床前动物模型中观察到的改变的谷氨酸能示范。最后,由于该临床前模型在谷氨酸释放的变化,需要在改变谷氨酸释放的谷氨酸存在间隙进行细致的解释可以解释的。
达到稳定的基线后,通过<0.004 NA /斜率分钟变化所示(10 - 20分钟),我们首先由超过10秒之前的解决方案的任何应用程序均细胞外谷氨酸水平来测量补品谷氨酸水平(μM)。我们观察到在TauP301L小鼠的CA3和CA1区域增加补品谷氨酸含量,和利鲁唑恢复补品谷氨酸水平到对照组( 图3A)。接着,氯化钾被局部递送(通过微量吸管)至每一个hemisph的三个子区域的ERE每2 - 3分钟。经过10个再现的信号,其指示一个完整的谷氨酸神经系统34的,将结果平均为每个组和平均振幅进行比较。代表性迹线( 图3B)显示增加在所有三个子区域(仅CA3被示出)应用程序的KCl中TauP301L小鼠谷氨酸释放,这是通过利鲁唑治疗( 图3C)获救的效果。
然后将MEA被移动到相对的半球,并使其达到稳定的基线-之前施加外源性谷氨酸检查谷氨酸间隙( 图4)(10 20分钟)。不同体积 - 200μM无菌过滤谷氨酸溶液(50 250纳升)施加到细胞外空间,每2 - 3分钟,净面积的曲线(AUC)下用作谷氨酸摄取的测量。谷氨酸的这种快速应用带入到t他外空间允许内源性谷氨酸的释放和谷氨酸摄取的测量模仿。因为谷氨酸转运表现出的Michaelis-Menten动力学35,体积范围-外源性谷氨酸(50 250 nL)的注入,以暴露在摄取差异。在50内将50nL增量2次注射 - - 250纳升范围为了这样做,每个动物接受1。虽然要时常确认每个区域每组注射体积不在p≤0.05的水平,以确保净AUC的最佳方式统计学差异摄取是相关的,并且施加或扩散不谷氨酸盐的量,是确保振幅( 图4A)和T 上升 (从点源(微量),以图4B中的MEA的扩散的量度)没有区别10,11,19,20。这同种异体WS为“峰匹配”的幅度( 图4C),使得在净AUC差异被认为是由于在吸收和不施加的量或扩散的差异。当动物在谷氨酸释放存在的分歧峰匹配就显得尤为重要。由于体积的范围内注射,振幅和T 上升的差异往往很大,并增加额外的动物不减少方差这些措施,因为它们固有的设计。因为幅度和T 上升是在每个子区域( 图4A,4B)的组间相似,我们假定在净AUC( 图4C,4D)的差异是由于在谷氨酸摄取差异。相比在所有三个子区域( 图4D)控制利鲁唑提高谷氨酸的间隙。最后,有一个附加的微管的MEA用于本地应用的染料来确认脑部后MEA放置切片,这表现在图3D英寸
这些数据表明,在MEA技术能够测量海马24,25的小的子区域内的神经递质释放,不像先前的技术( 例如 ,微透析),其中只有从大样品区域记录并经常损坏神经元回路28,29的。此外,多边环境协定为我们提供了高时间分辨率的测量谷氨酸释放和清除25的快速动力学。
图1: 在自引用的微电极测量电流(PA)的变化体外校准对谷氨酸氧化网站(GluOx;红色) 与一个监测点(送;蓝色)。的干扰抗坏血酸(AA:250μM)和多巴胺(DA:2μM)并没有改变在任谷氨酸氧化酶或监控地点的电流。谷氨酸(谷氨酸:20,40,60μM)的加成产生的谷氨酸氧化现场逐步电流增加,但在监测点没有变化。过氧化氢(H 2 O 2:8.8μM)产生在两个位点的电流增加。校准后,计算灵敏度,坡度,检测限,和R 2个值。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. A样本电化学工作表。此工作表包括用于注射或喷射次数(时间/ TTL)的时间脑坐标(AP,毫升,DV)列,施加的压力量(氮)的压力(时间)的长度,以及由压力喷射器喷射出的体积。任何注释,如奇数信号或微量的堵塞应记录在备注栏。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.细胞外的滋补和氯化钾(KCl)中在海马的DG,CA3,CA1和地区谷氨酸-evoked推出。 (A)在海马,补药谷氨酸水平的CA3和CA1区域在媒介物处理的小鼠TauP301L(VEH-TauP301L)的显著上升利鲁唑治疗衰减的效果。 (B)在CA3基线匹配的KCl诱发谷氨酸盐释放的代表性记录显示ř iluzole处理(RIL-TauP301L)衰减在VEH-TauP301L小鼠中观察到的谷氨酸释放的振幅显著增加。氯化钾的本地应用程序(↑)产生的细胞外谷氨酸一强劲增长能快速返回到补药水平。 (C)的显著增加在DG,CA3在VEH-TauP301L小鼠中观察到的KCl诱发谷氨酸盐释放,和CA1的KCl后局部应用用利鲁唑治疗衰减。 (D)甲酚紫染色的海马为20μm部分显示在CA3和CA1 MEA磁道的位置(平均值±SEM; ** P <0.01 VEH -控制与 VEH-TauP301L,#P <0.05的rIL-Tau- P301L 与 VEH-TauP301L,## p <0.01的rIL-TauP301L 与 VEH-TauP301L; N = 14 - 19 /组)。这个数字与再版从John Wiley和Sons 19,20许可。rget =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图4.谷氨酸摄取继海马DG,CA3和CA1区外源性谷氨酸应用。 (A)的局部施加的谷氨酸信号的幅度是在每个区群中是相似的。 (B)笔上升 ,谷氨酸扩散从微量的指标,在每个区域中的组之间类似。 (C)在从VEH -控制谷氨酸的本地应用程序,VEH-TauP301L,并且R11-TauP301L小鼠CA3代表谷氨酸信号。 (D)治疗的利鲁唑减少了净面积的显著增加在海马的所有3个区域VEH-TauP301L小鼠中观察到的曲线(AUC)下,指示利鲁唑-处理的T提高谷氨酸的摄取auP301L小鼠(平均值±SEM; * P <0.05 VEH -控制与 VEH-TauP301L,** P <0.01 VEH -控制与 VEH-TauP301L,#P <0.05的rIL-TauP301L 与 Veh- TauP301L,## p <0.01的rIL-TauP301L 与 VEH-TauP301L; N = 13 - 15 /组)。这一数字与约翰·威利父子20许可转载。 请点击此处查看该图的放大版本。
0.05M的PBS | 2升去离子水: |
在玻璃烧杯中商店包裹锡箔。如果有必要使pH至7.4,用KOH。 | 加入NaH 2 PO 4·H 2 O:4.5克Na 2 HPO 4:11.34克氯化钠:11.68克 |
20mM的抗坏血酸 | 50mL的DI水:|
让每日新鲜。 | 抗坏血酸:0.18克 |
20mM的L-谷氨酸盐 | 50mL的DI水: |
请每周新鲜。 | L-谷氨酸单钠盐水合物:0.15克 |
2mM的多巴胺 | 多巴胺盐酸盐:0.038克 |
做出新的月度。 | 0.1M的高氯酸:10毫升带体积至100毫升的去离子水 |
8.8毫米的过氧化氢 | 50mL的DI水: |
请每周新鲜。 | 过氧化氢:500微升 |
的70mM氯化钾 | 100毫升DI水: |
做实验的新的一天。 | 氯化钾:0.08克氯化钠0.07克氯化钙:0.004克 |
200μ; M谷氨酸 | 的20mM谷氨酸盐:100μL |
做实验的新的一天。 | 无菌盐水:10毫升 |
表1:校准解决方案。
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Discussion
所述MEA技术允许在体外和体内神经递质的释放和摄取的快速动力学的测量。因此,该技术产生了各种各样的数据输出包括补品神经递质水平,诱发神经递质释放,和神经递质的间隙。然而,由于采用多边环境协定是一个相对复杂的过程,有可能需要为成功使用进行优化许多因素。例如,在校准期间,人们可能注意到,不存在的信号波形(示波器屏幕),或者对刺激的响应是最小的或不存在。可能是由于系统故障,重新开始记录系统或计算机,可以解决这个问题。此外,该问题可能是连接错误。校准之前,它是恰当的仔细检查的是,MEA和参考电极的连接是否正确连接。更换的探头的DIP插座可以解决MEA连接问题。如果MEA不是完全在溶液或维护不良参考电极使用的,这些也可能干扰校准期间记录。校准期间减慢信号响应是另一个常见的问题,这可能导致从比所需BSA /戊二醛混合物,或慢慢地旋转搅拌棒的更厚。在校准过程中的干扰是给一个信号的情况下,可能的是,有在电镀的错误( 例如,没有电镀足够长的时间)MPD中排除层。在这样的情况下,重复该过程电镀是必需的。
在手术过程中,一种麻醉水平可能不足以对所有小鼠;一些小鼠可能需要更高水平的麻醉,以“去下”,有的老鼠可能需要较少。它开始在麻醉的低水平,慢慢抬高,直到鼠标是浅麻醉下是必需的。一旦鼠标是在立体设备通过深麻醉可以测试尾或脚趾捏。当植入MEA选择坐标,它也是可以发生在许多神经退行性动物模型36,37,38可能脑萎缩需要注意的和正确的。另外,是手术后血液不会积聚在MEA,因为这会影响到MEA的记录性能,并导致缓慢的时间分辨率或最大程度地降低信号响应期间势在必行。如果血块周围的电极,只要将MEA和用生理盐水冲洗。
在记录期间,可能会发生的最常见的问题之一是,有噪信号的。来自其他电子设备,如辅助照明,附加仪器,和钻头干扰是最有可能的罪魁祸首,所以最好避免它们插入到相同的电电路和/或出口作为记录系统。此外,如果记录SYSTEM没有正确接地,将观察到的记录系统的示波器振动以及噪音的所有网站所产生,而不仅仅是记录点。记录系统下,建议使用接地衬垫必须连接到接地的管道,以避免这些问题。如果确定没有的这些都是错误,错误可以位于与所述参比电极,或MEA本身。当遇到噪声问题,采用了全新的,未使用的MEA,以验证系统的操作可以成为一个有用的故障排除方法。如果断开或在小更换参考电极结果没有变化,参比电极或半电池可能出现故障。更改参考电极可能是解决问题的唯一途径。一旦录制完成后,MEA的最后一个好处是清洁并重新使用它们的能力。的MEA可以只要MEA继续校准期间充分地进行再使用的大约三倍。
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Disclosures
GG是Quanteon,LLC,使得用于这项研究谷氨酸测量的FAST-16录音系统独资经营。 JEQ是Quanteon付费顾问。
Acknowledgments
(; U54GM104942 MNR),NIA(MNR; R15AG045812),阿尔茨海默氏症协会(MNR; NIRG-12-242187),西弗吉尼亚大学学院研究参议院拨款(MNR),西弗吉尼亚大学和格兰特PSCOR这项工作是由普通医学科学研究所的支持(MNR)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
Picospritzer III | Parker | ||
Silver wire | AM systems | #786500 | |
Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
Drill | Dremel | Micro | |
Metricide | Metrex | 102800 | |
Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).