Summary
ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。
Abstract
神経伝達物質の破壊は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、および不安の根底にある病理学において役割を果たし、多くの場合、中枢神経系（CNS）の疾患の重要な要素です。伝統的に、微小透析は、これらの疾患で発生する神経伝達物質の変化を調べるための最も一般的な（賞賛）技術となっています。微小透析は、組織の広い領域にわたる遅い1-20微細な変化を測定する能力を持っているので、しかし、それは潜在的に脳と低速サンプリング機能内の固有の接続を破壊し、侵襲性の欠点を持っています。比較的新しい技術は、微小電極アレイ（MEA）は、彼らが起こるように、空間的および時間的に正確なアプローチを行う、別個の脳領域内の特定の神経伝達物質の変化を測定するための多くの利点を有しています。また、MEAのを使用して、インビボでの神経伝達物質の変化の測定を可能にする、低侵襲性です。私たちの研究室では、我々ヘクタールアルツハイマー病の病理学に関連する神経伝達物質の変化、グルタミン酸、中に特に興味を持ってきまし。そのため、ここで説明する方法は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、グルタミン酸の潜在的な海馬の中断を評価するために使用されてきました。簡潔には、使用される方法は、対象の神経伝達物質のための非常に選択的な酵素によるマルチサイト微小電極を被覆し、バックグラウンドノイズと干渉を減算する自己参照サイトを使用することを含みます。めっき及び較正後、MEAは、マイクロピペットを用いて構築することができ、定位装置を用いて、関心のある脳領域に低下しました。ここで、この方法は、RTG（TauP301L）4510匹のマウスを麻酔し、正確海馬のサブ領域（DG、CA1およびCA3）を標的とするために、定位装置を使用することを含む説明しました。
Introduction
脳内の神経伝達物質の変化を測定することは、多くの場合、神経伝達物質調節不全によって特徴付けられる中枢神経系（CNS）の疾患を研究する神経科学のための不可欠なツールです。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC / EC）と組み合わせた微小透析は、細胞外神経伝達物質レベルの変化1、2、3、4を測定するために最も広く使用される方法であったが、微小透析プローブの空間的及び時間的分解能は神経伝達物質のために理想的ではないかもしれませんこのようなしっかり外空間5,6に調節されるグルタミン酸塩、など。なぜなら遺伝学および画像化における最近の進歩により、 生体内でグルタミン酸をマッピングするために使用することができる追加の方法があります。遺伝的にコードされたグルタミン酸蛍光レポーターを用いて（iGluSnFR）AND二光子イメージング、研究者らは、in vitroおよびin vivo 7、8、9 の両方のニューロン及び星状細胞によってグルタミン酸放出を可視化することができます。注目すべきは、これはより広い視野からの録音を可能にし、脳の固有の接続が中断されることはありません。これらの新しい光学技術は、グルタミン酸動態および感覚誘発反応と神経活動の測定の可視化を可能にするが、それらは個別の脳領域における細胞外空間にグルタミン酸の量を定量化する能力を欠いています。
別の方法は、選択的に自己参照記録方式の使用を介して、例えば、グルタミン酸などの細胞外神経伝達物質レベルを、測定することができる酵素結合微小電極アレイ（MEA）です。 MEA技術は、外傷性脳以下の細胞外グルタミン酸の変化を研究するために使用されてきました損傷10、11、12、13、14、老化 、ストレス15、16、癲癇17、18、アルツハイマー病19、20、及びウイルス模倣21の注入および微小透析に固有の空間的および時間的な制限を超える改善を示します。微小透析は、シナプス22、23の近くに測定する能力を制限し、一方、MEAがシナプス24、25近くの細胞外グルタミン酸スピルオーバーの選択的測定を可能にする高い空間分解能を有しています。第二に、マイクロダイアリシスの低い時間分解能（1 - 20分）を調査する能力を制限します第二の範囲26にミリ秒で発生したグルタミン酸放出およびクリアランスの速いダイナミクス。グルタミン酸のリリースやクリアランスの違いは強壮剤の対策では明らかではないかもしれないので、グルタミン酸レベルを休んで、グルタミン酸放出およびクリアランスを直接測定することが不可欠かもしれません。 MEAは、その高い時間分解能（2ヘルツ）及び検出の下限（<1μM）にこのような対策を可能にします。第三に、MEAのは、ラットまたはマウスの海馬のような特定の脳領域内の神経伝達物質で小地域変動の検査を可能にします。例えば、細胞外グルタミン酸で小地域の違いを調べるために、我々は別々に歯状回（DG）、trisynaptic回路27を介して接続され、海馬のアンモン角3（CA3）およびアンモン角1（CA1）を標的とすることができるのMEAを使用。移植28 <によって引き起こさ- （4mmの長さ1）及び損傷ため微小透析プローブのサイズの/ SUP>、29、小地域の違いが対処するのは困難です。また、光学系は、小地域刺激7を許可しないようなウィスカ刺激または光のちらつきなどの外部刺激を介して刺激を可能にします。他の方法に比べてのMEAの最終利益は、彼らの外因性および内因性の接続を中断することなく、生体内でこれらの小領域を研究する能力です。
ここでは、セラミックベースのマルチサイト微小電極からなる膜電極アッセンブリと組み合わせて、どのように記録システム（ 例えば 、FAST16mkIII）記述、示差検体信号から検出して除去する干渉物質を可能にするために、記録部位に塗布することができます。我々は、これらのアレイは、麻酔RTG（TauP301L）4510匹のマウスのDG、CA3およびCA1海馬の小領域内のin vivoグルタミン酸調節、一般的に使用されるM個の電流測定に基づく研究のために使用することができ、また性を実証しますアルツハイマー病のウーズモデル。また、我々はリルゾールでマウスを処理することによりグルタミン酸放出およびクリアランスの速いダイナミクスへのMEAシステムの感度の確認を提供し、in vitroで示された薬物は、グルタミン酸放出を減少させ、グルタミン酸の取り込み30、31、32、33を高めるために、そして、TauP301Lマウスモデルにおけるin vivoでのこれらのそれぞれの変化を実証します。
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Protocol
1.酵素で微小電極アレイまたはマトリックス層をコーティング
- タンパク質マトリックス溶液を準備します
- ウシ血清アルブミン（BSA）10mgを秤量し、1.5mLのマイクロ遠心チューブに移します。
- BSAを含むマイクロチューブにDI水の985μLを追加します。 （再ピペットBSAが溶解するまで1,000μLピペット〜3回使用して）手動撹拌によって溶液を混合します。
注：液中に空気を導入することができるそうするように、溶液を混合するために渦を使用しないでください。また、気泡を導入することを避けるためにボリューム<千μL（ 例えば、700μL）にピペットを設定します。必要に応じて溶液を微量に配置することができます。 - BSA溶液が溶解したら、25％グルタルアルデヒド溶液5μLを加えます。 5回 - 閉じられたチューブ3を反転させることによって溶液を混合。得られた溶液を0.125％グルタルアルデヒドの1％BSAです。
- タンパク質マトリックスのソリューを脇に置きます5分間ション。解決策は、色が淡黄色に表示されます。
- 所望の酵素溶液を調製する（ 例えば 、グルタミン酸オキシダーゼ）
- 凍結乾燥され、精製された酵素を濾過し、DI水を添加することにより、グルタミン酸オキシダーゼ溶液を調製し（0.5 U /μLを得グルタミン酸オキシダーゼの25個の単位に加え、例えば 、50μLのDI水）。
注：アリコートストック溶液（ 例えば 、1μL）を-20℃で適切なサイズの容器（ 例えば 、500μLのマイクロ遠心チューブ）にアリコートを格納します。アリコートは、これらの条件の下で最大6ヶ月間保存することができます。 - グルタミン酸オキシダーゼを含有する微量遠心チューブに等分BSA /グルタルアルデヒド溶液の4μLを加えます。手動撹拌によって溶液を混合（10μLピペットで再ピペッティング。ピペットボリューム<5μLに設定しなければなりません）。得られた溶液を、1％BSA、0.125％グルタルアルデヒドおよび0.1 U /μLグルタミン酸オキシダーゼです。すぐにコーティングするためのソリューションを使用してください。
注：グルタミン酸オキシダーゼコーティング溶液は、15分以内のみを使用することができます。いくつかのMEAは、1つの調製した溶液でコーティングすることができるが、グルタミン酸オキシダーゼのための使用可能な時間窓を超えないことをお勧めします。 15分以内にコーティングすることができる電極の数は変わります。一般に、4〜6電極は、一度にコーティングすることができます。
- 凍結乾燥され、精製された酵素を濾過し、DI水を添加することにより、グルタミン酸オキシダーゼ溶液を調製し（0.5 U /μLを得グルタミン酸オキシダーゼの25個の単位に加え、例えば 、50μLのDI水）。
- MEAをコーティング
- 典型的には、コート所望の酵素（グルタミン酸オキシダーゼ）とMEA上の記録部位（単数または複数）の組と記録部位（単数または複数）（「センチネル」サイト（S））の異なる対は不活性なタンパク質マトリックスで被覆されています。
- l-グルタミン酸オキシダーゼまたは不活性タンパク質マトリックス溶液（BSA +グルタルアルデヒド）を用いてコートのMEAに鈍い先端ハミルトンマイクロシリンジ（例えば 、10μL）を使用します。酵素または不活性タンパク質マトリックスコーティングのために使用される手順は同じです。
- 使用前と後の注射器をきれいに（3回のすすぎでDI水、メタノールで3回リンス、DI水で5回すすぎました）。
注：専用シリンジは、酵素（グルタミン酸オキシダーゼ）又はタンパク質マトリクスのコートを適用するために使用されます。 別のソリューションに同じ注射器を使用しないでください。酵素コーティングの前にタンパク質マトリックスコーティングを行うことが推奨されます。 - 10μLハミルトンシリンジを使用して、グルタミン酸オキシダーゼまたはタンパク質マトリックスを描画します。穏やか（解剖顕微鏡を用いて可視化）をシリンジ先端に溶液の小ビーズを分配するようにプランジャを押します。
- 解剖顕微鏡を使用して、MEAの記録部位を標的に簡単に一つの層を表す液滴/ビーズ、との記録部位を接触させることによって、適切な記録部位に溶液を適用します。 3つの層は、タンパク質マトリックスおよび酵素コートの両方のために十分です。厚い層は、MEAの感度を低下させることができます。
- まっすぐソリューション滴を上げて、レコーディング現場オフ（ すなわち syrinGEの先端）はMEA表面全体にこすりべきではありません。
- 1分間のタイマーを設定します。これは、記録部位（単数または複数）へのコーティング用途の間の最小時間要件です。酵素でコーティングされたMEAは、5〜7日間4℃で硬化させます。
- それは実験ノートにコーティング、電極の数、および名前と日付を適用するためにかかった時間、適用されるコートの数を記録します。
改善された選択のためのm-フェニレンジアミンと2電気めっき
- m-フェニレンジアミン二塩酸塩（MPD）溶液を調製
注：、排除層のmPDをプレートドーパミンおよび他の大きい、干渉分子（ 例えば 、アスコルビン酸）の酸化を防止するために、それによって他の潜在的に妨害する分子上のグルタミン酸/ H 2 O 2に対するセンサの選択性を向上させることができます。- メジャーメスフラスコに0.05 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の50 mLおよび0.05の50ミリリットルを転送しますより大きな（150 mL）を三角フラスコにM PBS。
- 窒素タンクに接続されたチューブを用いて（ 例えば 、チューブを使用して圧力エジェクタが接続されている）、管の開放端にピペットチップ（ 例えば、P200チップ）を取り付けます。 PBS溶液中に取り付けられたピペットチップを用いてチューブを配置し、パラフィルムで緩く溶液を覆います。 20分間窒素、静かに泡ソリューションをオンにします。
- MPD 0.045グラムの重量を量ります。
注意：のmPDは、潜在的に発癌性物質です。 MPD計量はヒュームフード内に含まれるスケールを使用して行われるべきです。 mPDを使用する際に手袋とマスクを着用してください。フードが機能的であり、サッシが適切な作業レベルに引っ張られることを確認してください。永久的な染色を避けるためのmPDで汚染された可能性があり、すぐにきれいな表面。 - バブリング後、脱気PBS溶液へのMPD全てを転送します。溶液中のmPDを溶解し、フラスコパラフィルムで開口し、穏やかに旋回溶液を覆います。 aggressiv避けてくださいE混合または溶液中に気体を導入することができるようにすることとして渦の使用。
- 50mLのビーカーに溶液を移します。撹拌棒は必要ありません。
- 電極を電気めっき
- 参照電極を取得します。唯一のメッキのmPD専用の参照電極を使用してください。較正手順のための異なる基準電極を用います。
- ビーカーの上に基準電極ホルダーのプラスチックアームを位置決めします。ガラス参照電極における気泡を確認（参照することができないかもしれません）。穏やか先端に気泡を除去するために、基準電極の遠位端をフリック。
- PBSを含有するビーカーにプラスチックアームと下部の開口部を通って参照電極を置きます。参照電極は、ビーカーの底に接触しないことを確認してください。
- ヘッドステージに基準電極を接続する（ 例えば、2 PA / Mv）は（ 例えば、DIPコネクタ）を接続プレートをMPDするMEAヘッドステージにD。
- のみMEA先端が溶液に浸漬されるようにビーカーの溶液にMEAを下げます。黒色「バブル」（MEAチップの上方に位置するブラック絶縁）を越えて液体中のMEAのヒントを水没していません。そうすることでMEAを損傷する恐れがあります。
- 電極チャネルとヘッドステージに接続の機能性を検証する「テスト」キャリブレーションを実行します。
注：ハードウェアの設定が使用されている機器を反映する必要がありますが、分析物/干渉種類や濃度に関連する詳細は、「試験」の校正のために入力する必要はありません。再符号化モードが「アンペロメトリー」であるべきであり、「V-印加」-0.7 V.すべてのチャネルのための典型的な記録を確認しなければなりません。 - 全ての記録部位の接続性が確認されたときに「キャンセル」を選択することによりキャンセル。校正データを保存する必要はありません。
- デスクトップ上の「電気めっき」アイコンを選択します。電気めっきへオールメニューが表示されます。正しい設定値が入力されていることを確認します
PP振幅：0.25
オフセット：-0.5
周波数：0.05
所要時間（分）：20 - メッキを開始するには「一時停止」ボタンを選択します。経過時間フィールドには、カウントダウンを開始する必要があります。
- 完了すると（すべての時間が経過）、追加のMEAをメッキのmPDを開始するポップアップメニューで「別のMEA」を選択します。メッキMPDと電気ツールを使用して電気めっき手順を繰り返すべきMEAとメッキMEAを交換してください。
注：これ以上2倍以下または1時間の時間内に準備されたのMPDソリューションを使用することをお勧めします。 2つ以上のMEAを製造するための新鮮な溶液を準備します。 - 電気めっきを終了する「終了ソフトウェア」を選択します。校正前にDI水（塩残留物を避けるために）及び店舗（24時間）を有するMPD-めっき電極チップをすすぎます。
- 溶液からの基準電極を除去して、適切なS内に配置する前にDI水ですすぎtorage溶液（ 例えば、3 MのNaCl）。基準電極先端が溶液に浸漬されていることを確認します。ガラスの損傷を防ぐために、溶液にゆっくりと下部ガラス基準電極。
- 適切に標識された有害廃棄物容器内のMPD溶液を処分します。
3.グルタミン酸検出及び選択のためのMEAをキャリブレーション（図1）21
- キャリブレーションのために必要なソリューションを準備します。
注： 表1を参照してください。 - 一定の攪拌の下でキャリブレーションを実行し、37℃で（磁気バッテリー攪拌機を操作しました）。加熱パッドや循環水浴をオンにして、小さな撹拌棒を得ます。ゆっくりと、しかしさらには、（下記）が行われたとき、新しいプラトーに急速に達していることを十分に速くかき混ぜます。
- 記録制御システムにヘッドステージ（2 PA / MV）を接続し、撹拌し、0.05M PBSの40mLの（50-mLのビーカーを使用）にMEAの先端を挿入してください。
- Rを接続しますリファレンス電極。気泡がないことを確認するためにエンドをフリック。
- 記録プログラムを開き、「キャリブレーション」をクリックしてください。設定は（センチネルサイトがこのように選択されていることを確認する別の電極を変更する場合があります）正しいことを確認し、MEAの番号を押し、「スタート」を選択します。
- ;平衡化のため10分 - 5を許可しますベースラインが（<0.004 NA /変更分）安定した時点で開始します。
- 「ベースライン」を選択し、500μLの20mMアスコルビン酸（干渉を、最終[250μM]）を追加し、現在は新しい、安定したプラトーに達した時点と「妨害物」を選択した場合、（AAは、脳全体の干渉であると考えています）どれか。添加の間1分 - 0.5を可能にします。 MEAが適切に電気めっきされている場合は、ほとんど変化は観察されないはずです。
- 20 mMのL-グルタミン酸（最終[20μM]）の40μLを追加し、現在たら新しい、安定した高原、マーク1 回目の追加「分析物」に達しています。 3 glutamatの合計3回繰り返します電子の追加。
- 40μLDAを追加します。 「分析物」を選択しないでください 。 「被験物質」を選択 - DAは、DAを含む領域に干渉することができます。
- 40μL過酸化物を追加します。 「分析物」を選択しないでください 。 「試験物質」を選択します。
- キャリブレーションが終了すると、「停止」ボタンをクリックしてください。
- MEAの機能性を決定するために、計算タブをクリックし、実験ノートに次のパラメータを記録。
- これらのキャリブレーションに使用されるMEA設計（3,000 平方 μm）のために、≥0.004 NA /μMの傾きでMEAを使用するが、より低い傾斜は、特定の実験のために使用することができます。酵素コーティングし、コーティングされていない部位との間の傾きの10％未満の差がある場合、唯一またはクリーン/ MEAを破棄誘発放出のためのこれらのMEAを使用します。
- 1.5μM≤検出限界（LOD）を使用します。 LODが1.5μMよりも大きい場合、誘発RELEASのためにこれらのMEAを使用Eのみの取り込み。トニックレベルを記録するため、これらの電極を使用しないでください。
- > 20任意単位の干渉にわたって所望の分析物（ すなわち 、グルタミン酸）に対して選択性を使用。選択性が20未満である場合には、クリーン/ MEAを捨てます。
- ≥0.90の検量線の直線性（R 2）を使用します。直線性が0.90未満である場合には、クリーンまたはMEAを捨てます。
- MEA、日付の＃でファイルを保存し、人物校正の頭文字。
4.マイクロピペットを組み立てます
注： - 15μmのマイクロピペット（キャピラリーガラス）10の内径を有する先端を有するべきです。
- すべての4つのプラチナ記録部位間の中央でマイクロピペットを置き、粘着性ワックスと粘土を使用してMEAの上に50〜100ミクロンをマウントします。
- マイクロピペットをロードするには、グルタミン酸またはKCl溶液で満たされた1 mLの注射器、0.22μmの滅菌シリンジfilteを使用R、および97 ム・ロング、28ゲージのピペットフィラー、マイクロピペットをバックフィル。つまり、気泡がないことを確認すること、マイクロピペットの上部に針を挿入し、マイクロピペット（MEAに向けて終了）の一番下に埋めます。
- 約1秒間20 PSI - 2における圧力噴射システムにマイクロピペットを取り付けます。
5.プレートin vivoでの使用のためのミニチュア参照電極
- めっき液（100mLのビーカー中で50グラムのNaCl / 90 mLの1 MのHCl（めっき浴））を準備し、バス電極（白金（Pt）ワイヤ（〜0.02" 直径の〜10cmの長さ））を切断します。
- （0.008" 裸の）テフロンコーティングされた銀線の長さ15cm片と銀線の端部の各端からテフロンコーティングの約1センチ掻き取るカミソリの刃を使用する - 10を切断します。
- 一方の端に金のピンをハンダ付けし、めっき浴内に露出銀線の一端を配置します。
- 、 - （15 VDC最大〜9の出力を有する唯一のDCアダプタを使用）DCアダプタを使用してゴールドピン側で用意銀線（参照電極）に「赤」（+）線をクランプ。 （ - ）白金浴カソードへのワイヤ「黒」をクランプします。
- DCアダプタに差し込みます。正しいめっきプロセスを探して - 泡風呂電極で表示されます。参照電極は銀/灰色に変わり。
注意：リード[黒-赤（+）対を（）] -切り替えないでください、これが発生した場合、めっき浴を台無しにされ、新鮮なめっき液が行われる必要があります。悪い溶液の色に黄色になります： 使用しないでください！
注：めっき反応は、一般に2~5分を要する：のAg 0 + Clで- →のAgCl + eを- - 基準電極をテストします。
- 200 mVのDCの設定 - 100にマルチメータを設定します。
- 新たにメッキ参照電極に対して基準3 M NaCl中の電極とテスト（すなわち、作動されることが知られている、以前に試験された電極である）ベンチマークを置き。
注：お問い合わせの場合新しい基準電極をする、（12時間を推奨）使用前に3 M NaCl中に浸します。 - 試験される基準電極の金のピンの「 赤 」（+）リード線を配置します。 （ - ）ベンチマーク電極にリード「 黒 」 を置きます。許容される読み出し範囲は、±10 mVです。 0 MVは2つの基準電極間に理想的です。
MEA録音6.一般的な動物の手術
- 手術の準備
- 夜の前に消毒剤で手術ツールを置きます。
- 消毒剤からツールを外し、よくすすぐと無菌手術パッド上のツールを配置します。加熱パッドを入手します。
- 2つの電極を較正し、手順3および4に記載されているようにマイクロピペットを取り付けます。
- 第5節で説明したように参照電極を作成します。
- 200μMのグルタミン酸と70のKClを行います。 表1を参照してください。。
- 動物を取得し、手術シートにその重量を記録します。
- 麻酔を準備し、加熱パッドをオンにします。
- MEAの手術を行います
- 呼吸速度が大幅に低下していると動物がつま先又はテイルピンチに応答しないまでイソフルラン（酸素中4％の流量）を用いて、誘導チャンバ内に動物を麻酔。レコード呼吸数、体温15分毎。
- ヘッドを安定化するために耳のバーを使用して定位装置に動物を置きます。動物が安全であると頭が動かないことを確認してください。酸素中3％ - 1.5イソフルランの流れを下げます。加熱パッドが適切に動物の下に配置され、補助的熱を提供するために、37℃に設定されていることを確認。補足的な熱を提供するために失敗すると、深遠な低体温症と動物の早死をもたらすことができます。
- 滅菌綿棒を用いて眼軟膏を適用し、呼吸数を記録し、体温。バッテリ駆動トリマーを使用して、頭の上を剃ります。耳の近くに毛皮を削除するには、小さな手術用ハサミを使用してください。
- この時点で、無菌手術用手袋の上に置きます。ヨウ素を適用して、アルコール（3回）、頭皮へ。
- メスを使用して、ストレート頭皮の真ん中切開部を作り、牛、犬クランプを使用して皮膚を広げます。すべての血液を吸収するために滅菌綿棒を取ります。ブレグマとラムダの外観を容易にするために、過酸化水素を使用してください。
- ヘッドが適切にD / VとブレグマとラムダのM / Lの座標を測定することにより位置決めされることを確認してください。ヘッドは、平面上にある場合座標の変化はゼロであるべきです。平坦面を確保するために必要なヘッドと耳バーを調整します。
- ブレグマを検索し、座標をゼロ。所望の座標を用いて、左右に移動し、永久的なマーカーを用いてマークを作ります。焼灼器/マーカーを使用して、到達するために十分な部屋でマークの周りに大きな広場を作ります所望の領域。
- 無菌の回転工具を使用して、四角のマークの周りにドリル。滅菌綿棒を使って任意の血をお楽しみください。徹底的に各使用前にドリルビットを消毒。
- ヘッドステージにMEAを取り付け、第一の所望の溶液でピペットを埋め戻します。排出される解決策を検討することができるように解決することなく、ピペットのギャップを残していることを確認してください。ガラスマイクロピペットにチューブを取り付けます。
- 窒素タンクと圧力エジェクタ（PSI = 5、時間= 0.6秒）をオンにします。ピペットを確保するためのテスト（押して手動赤いボタン）が開始する前に目詰まりしていません。
- マイクロピペットのキャリブレーションを行います。レチクル上0で開始し、開始点を示すために、ヘッドステージ上の青いテープ片を置きます。デジタルリーダーの電源を入れて、それをゼロにリセットします。ダウン1ミリメートル（DV）移動して、解決策は、レチクル上を移動したダニの数を数えます。 10ティックを1mm（1ミリメートル= 250 NL）のため、1ティック= 25株NL等しくなければなりません。
- に基準電極を配置しますそれは回路を完成するために、脳と液体接触したままであるように、MEAから離れた位置。
- 付属のMEAとブレグマ見つけ、デジタルリーダーをゼロ。所望の座標にMEAを移動します。先端が脳に触れるまでゆっくりとMEAを下げます。ゼロDV座標、ゆっくりと脳にMEAを下げます。
- 記録プログラムでは、必要な校正電極をクリックし、クリックして「実験を行います。」動物を麻酔している間システムは、目的の検体のための強壮剤のレベルの記録を開始します。
- 45分 - ベースラインを観察するのに役立つと20のためのベースラインに電極を可能にする軸にズーム。
- ベースラインが安定した後、0.6秒と5 psiの圧力エジェクタを設定し、排出する圧力エジェクタ上の赤いボタンを押してください。注射用シート（ 図2）上を移動時間及び圧力並びに体積/ティックを記録します。 つまり、（必要なメモを作成し、より大きなピーク、希釈効果、詰まったピペット、ノイズの多いベースライン/ Oスコープ）。
- 注射の間に5分 - グルタミン酸注射のために、3を待ちます。注射の間に2分 - KClのための注射剤は、1を待ちます。少なくとも3回同じ圧力と時間を使って注入します。時間を変更して繰り返します。マイクロピペットが目詰まりしている場合を除き、圧力を変更しないようにしてください。
- マイクロピペットが目詰まりしている場合は、30 psiの圧力を高めます。
- 所望の脳領域からレコード、異なる溶液を用いて脳の両側に繰り返します。 20分間それぞれの新しい領域におけるベースラインを記録します。
- 、付属のマイクロピペットでMEAを取るDI水ですすぎ、すべての血液がなくなるまで一晩PBSに浸します。
- 動物を安楽死させると、-80℃の冷凍庫に予め標識チューブやストアに脳を保存したり、固定のために片側を保ちます。動物を安楽死させるために、イソフルラン（吸入）と過剰摂取。手術用ハサミを使用して断頭を行い、所望の領域を解剖します。
7.クリーニングコーティングされたMEAの後に使用
- 未使用の場合はクリーンではないのMEAを行います。糸くずやほこり表面に、メタノールできれいにし、コーティングの前に24時間乾燥させてくださいがある場合。
- 水浴（80°C）をオンにして、30分間MEAの先端を浸します。注意深く電極チップ上に残されてもよい任意の破片を除去するために綿先端アプリケーターを用いて、電極の先端部を拭きます。湿ったMEAの黒「絶縁部」を取得しないでください。
- 三つの異なる超音波処理器を用いて、5分間（1）Citrisolv、商業溶媒及びクリアリング剤（2）イソプロピルにおけるMEAの先端、及び（3）DI水を浸します。注意深く電極チップ上に残されてもよい任意の破片を除去するために、綿アプリケータ先端と電極の先端部を拭きます。
- 層が正常に削除されていることを確認するために解剖顕微鏡下のヒントを調べます。
8.分析
- データを分析するために、最初に完成した実験をダブルクリックし、ファイルのドロップダウン・メニューから「エクスポートデータ」を選択することで、必要な実験をエクスポートします。
- 目的のファイルの場所にこのデータを保存し、分析プログラムを開きます。解析プログラムで「開く」をクリックし、最近保存したファイルを選択します。
- プログラムにファイルをアップロードして、イベントマーカー]タブの下で実験を確認するためのいくつかの瞬間を与えます。出力の下で、必要なパラメータのチェックボックスをオンに。例えば、ベースライン、振幅、ピーク面積（曲線下面積）、T 上昇 、及びT 80。
- （これは数分かかる場合があります）リフレッシュをクリックして、スプレッドシートにデータをエクスポートするために分析します。プログラムは、目的の場所にファイルを保存するためのプロンプトを与えます。保存したら、ファイルは、スプレッドシートで編集することができます。
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Representative Results
この技術は、このような外傷性脳損傷、加齢、ストレス、およびてんかんなどの動物モデル、多くの種類のシグナリンググルタミン酸の変化を測定するために使用することができますが、ここでは、MEAの技術は、トランスジェニックマウスモデルにおけるグルタミン酸作動性の変化を調べるために使用することができる方法を示し人間タウオパチー19、20の。 RTG（TauP301L）4510マウスは、第17染色体にリンクされた前頭側頭型認知症及びパーキンソン関連付けられたタウにおけるP301L突然変異を表し、一般にアルツハイマー病、神経変性タウオパチーおよび前頭側頭型認知症に関連したタウ病理を研究するために使用されます。我々はまた、グルタミン酸作動性シグナル伝達は、薬理学的介入によって変更することができることを示しています。我々は、リルゾールで安定化することによりグルタミン酸作動性シグナル伝達を調節する筋萎縮性側索硬化症（ALS）のためのFDA承認疾患修飾薬をTauP301Lマウスを処置しました増加グルタミン酸クリアランス30、31、32、33に至る、グルタミン酸放出の減少、およびグルタミン酸トランスポーターの発現の増大を介してグルタミン酸取り込みの増強につながる、電位依存性ナトリウムチャネルの状態を不活性化します。
私たちは4つの理由のための実証の目的のために、この特定のデータセットを選択しました。まず、このデータセットは一時解除し、グルタミン酸の取り込みの速いダイナミクスを測定する当社の能力によって示されるように、システムの時間分解能を示しています。また、この前臨床動物モデルは、各尺度の変化の一例を可能にする、トニックグルタミン酸、グルタミン酸放出、及びグルタミン酸クリアランスの変化を示します。第二に、このデータセット、DG、CA3、A内の部分領域差の測定を可能にする高い空間分解能を利用ND海馬のCA1が実証されています。第三に、このデータは、前臨床動物モデルにおいて観察されたグルタミン酸作動性の変化を緩和するために使用することができますどのように薬理学的介入のデモンストレーションが可能になります。この前臨床モデルは、グルタミン酸放出の変化を持っているので、最後に、変更されたグルタミン酸放出の存在下でグルタミン酸クリアランスの慎重な解釈の必要性を説明することができます。
安定なベースラインに達した後、傾斜の<0.004 NA /分の変化によって示されるように（10から20分）、まず従来の解決策の任意のアプリケーションに10秒かけて細胞外グルタミン酸レベルを平均化することによりトニックグルタミン酸レベル（μM）を測定しました。我々は、コントロール（ 図3A）のものにTauP301LマウスのCA3およびCA1領域における増加したトニックグルタミン酸レベル、およびリルゾール復元トニックグルタミン酸レベルを観察しました。次いで、KClを局所的に1 hemisphの三つのサブ領域のそれぞれに（マイクロピペットを介して）送達しましたEREごとに2から3分。インタクトなグルタミン酸神経システム34を示す10の再現信号の後、結果は各群について平均し、平均振幅を比較しました。代表的なトレース（ 図3B）は、すべての3つのサブ領域（CA3のみが示されている）、リルゾール治療（ 図3C）によって救出された効果でのKClの適用後TauP301Lマウスにおける増加したグルタミン酸放出を明らかにしました。
MEAは、次いで、反対の半球に移動し、安定なベースラインに到達させた-外因性グルタミン酸をグルタミン酸クリアランス（ 図4）を調べるために適用される前（10〜20分）。変化ボリュームグルタミン酸取り込みの尺度として使用した曲線（AUC）下で3分間、及び正味面積 - - 200μM滅菌濾過グルタミン酸溶液（50~250 NLが）、細胞外空間にすべての2を適用しました。トンへのグルタミン酸のこの迅速なアプリケーション彼外空間は、内因性グルタミン酸放出とグルタミン酸取り込みの測定を模倣することができます。グルタミン酸トランスポーターは、ミカエリス・メンテン式35を示しているので、ボリュームの範囲-外因性グルタミン酸（50 nLの250）は、取り込みの差を露出させるために注入されます。 250 nLの範囲 - 50内の50のnLの増分で2回注射 - そうするために、各動物は、1を受信します。一つは常に領域ごとにグループごと注入体積は0.05レベル≤Pで統計学的に異ならないことを確認すべきであるが、正味AUCが適用グルタミン酸の量または拡散を取り込み、かつないように関連されていることを確認する最良の方法は、それを保証することです両方の振幅（ 図4A）及びT 上昇 （ 図4BにMEAに点光源（マイクロピペット）からの拡散の測定値）が10、11、19、20は異なりません。このアロ正味のAUCの違いを吸収における差異はなく量が塗布または拡散に起因すると仮定されているような「ピークマッチング」のWS振幅（ 図4C）。動物はグルタミン酸放出における既存の相違がある場合、ピークマッチングは特に重要です。ボリュームの範囲が注入されているので、振幅およびT 上昇の両方のための分散は、多くの場合、大型であり、彼らは設計に固有であるように、追加の動物を追加すると、これらの対策のための分散を減少させません。振幅およびTの上昇が各サブ領域（ 図4A、4B）に群間で同様であったので、我々はネットAUC（ 図4C、4D）の差がグルタミン酸取り込みの違いによるものであると仮定する。リルゾールは、すべての3つのサブ領域（ 図4D）で対照と比較してグルタミン酸クリアランスを改善しました。最後に、付属のマイクロピペットとのMEAは、ローカル切片脳後のMEAの配置を確認するために染料を適用するために使用されます、 図3Dに示されているように。
これらのデータは、MEA技術のみ大きなサンプル領域から記録され、しばしば神経回路28,29を破損前の技術（ 例えば 、微小透析）とは異なり、海馬24、25の小さな小領域内の神経伝達物質の放出を測定することが可能であることを示しています。また、MEAがグルタミン酸放出およびクリアランス25の速い反応速度を測定するために、高い時間分解能を提供してくれる。
図1：グルタミン酸オキシダーゼサイト上の現在（PA）の変化を測定する自己参照微小電極のin vitroキャリブレーション（GluOx;赤） に 対センチネルサイト（送信;青）。干渉のアスコルビン酸（AA：250μM）およびドーパミン（DA：2μM）は、グルタミン酸オキシダーゼまたはセンチネル部位のいずれかで電流を変化させませんでした。 （Gluの：20、40、60μM）のグルタミン酸の添加は、グルタミン酸オキシダーゼサイト上の段階的な電流増加が、センチネルサイト上の変更なしを生産しました。過酸化水素（H 2 O 2：8.8μM）は、両方のサイト上の電流の増加を生じました。感度、傾き、検出限界、及びR 2つの値は、キャリブレーション後に計算しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.サンプルの電気化学ワークシート。このワークシートは、注射または注入回数（TIME / TTL）の時間の列、脳座標（AP、ML、DV）を含みます適用される圧力の量（窒素）、圧力（時間）の長さ、および圧力エジェクタによって注入体積。例えば奇数信号またはマイクロピペットの詰まりなどの任意のメモは、メモ欄に記録されるべきです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.外トニック及び塩化カリウム（KClを）海馬のDG、CA3およびCA1領域におけるグルタミン酸の放出-evoked。 （A）海馬のCA3およびCA1領域において、トニックグルタミン酸レベルは有意に、ビヒクル処置TauP301Lマウス（VEH-TauP301L）にリルゾール治療によって減衰効果を増加させました。 CA3中のKCl誘発グルタミン酸放出の（B）は、ベースラインが一致した代表的な記録は、rを示しました iluzole処理（RIL-TauP301L）は、VEH-TauP301Lマウスで観察されたグルタミン酸放出の振幅の有意な増加を弱めました。塩化カリウム（↑）のローカルアプリケーションが急速にトニックのレベルに戻った細胞外グルタミン酸で堅牢な増加をもたらしました。 （C）は有意のKClの局所適用はリルゾール治療で減衰した後DG、CA3およびCA1にVEH-TauP301Lマウスで観察されたのKCl誘発グルタミン酸放出を増加させました。 （D）海馬のクレシルバイオレットで染色した20μmの部分は、CA3及びCA1にMEAトラックの位置を示す（平均±SEM; VEH-TauP301L 対 ** P <0.01 VEH-コントロール、＃はP <0.05 RIL、タウP301L VEH-TauP301L 対 、## VEH-TauP301L 対 P <0.01のrIL-TauP301L; N = 14から19 /群）。この図は、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ19、20からの許可を得て転載します。目標確認=「_空白」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
海馬のDG、CA3、CA1および地域における外因性グルタミン酸アプリケーションを次の図4.グルタミン酸取り込み。 （A）局所適用グルタミン酸信号の振幅は、各領域内のグループ間で同様でした。 （B）T 上昇 、マイクロピペットからグルタミン酸拡散の指標は、各領域内のグループ間で同様でした。ローカルVEH-対照におけるグルタミン酸のアプリケーション、VEH-TauP301L、及びRIL-TauP301LマウスからCA3における（C）代表的なグルタミン酸シグナル。 （D）リルゾール治療はリルゾールで処置したTにおける改善されたグルタミン酸の取り込みを示し、海馬のすべての3つの領域でVEH-TauP301Lマウスで観察された曲線（AUC）下の正味面積の有意な増加を減少させauP301Lマウス（平均±SEM;＃pをVeh- 対 <0.05 RIL-TauP301L VEH-TauP301L、 対 ** P <0.01 VEH-コントロール、VEH-TauP301L 対 * P <0.05 VEH-コントロールTauP301L、## P <VEH-TauP301L 対 0.01のrIL-TauP301L; N = 13から15 /群）。この図は、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ20からの許可を得て転載しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 0.05 M PBS | 2LのDI水： |
| スズ箔で包んだガラスビーカーに保管してください。必要に応じて、KOHでpHを7.4に持参。 | NaH 2 PO 4・H 2 O：2.8グラムのNa 2 HPO 4：11.34グラムの塩化ナトリウム：11.68グラム |
| 20mMのアスコルビン酸 50mLのDI水： | |
| 新鮮な毎日を行います。 | アスコルビン酸：0.18グラム |
| 20mMのL-グルタメート | 50mLのDI水： |
| 毎週新しくしてください。 | Lグルタミン酸一ナトリウム塩水和物：0.15グラム |
| 2mMのドーパミン | ドーパミン塩酸塩：0.038グラム |
| 新鮮毎月してください。 | 0.1 M過塩素酸：10 mLの脱イオン水で100mlにボリュームをもたらします |
| 8.8 mMの過酸化水素 | 50mLのDI水： |
| 毎週新しくしてください。 | 過酸化水素：500μL |
| 70mMの塩化カリウム | 100mLのDI水： |
| 実験の新鮮な一日を確認します。 | 塩化カリウム0.08グラムの塩化ナトリウム：0.07グラムの塩化カルシウム：0.004グラム |
| 200μ; Mグルタミン酸 | 20mMのグルタミン酸：100μL |
| 実験の新鮮な一日を確認します。 | 滅菌生理食塩水：10mLの |
表1：キャリブレーションソリューション。
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Discussion
MEA技術は、in vitroおよびin vivoでの神経伝達物質の放出と吸収の速い反応速度を測定することができます。したがって、この技術は強壮、神経伝達物質のレベルを含むデータ出力、誘発神経伝達物質の放出、および神経伝達物質のクリアランスのさまざまなを生成します。 MEAの使用は、比較的複雑な手順であるため、しかし、成功した使用に最適化される必要があるかもしれない多くの要因があります。例えば、キャリブレーション時に、一方が無信号波形（オシロスコープ画面）または刺激に対する応答が最小の、または存在しないことがないことに注意してもよいです。システムの誤動作の可能性が高いが、記録システム、またはコンピュータを再起動し、問題を解決することがあります。また、問題が接続エラーである可能性があります。校正前に、MEAおよび基準電極接続が正しく接続されていることを再確認することが適切です。ヘッドステージ上のDIPソケットの交換は、MEA接続の問題を解決することができます。MEAは、溶液中に完全にないか、または不十分維持基準電極が使用される場合、これらは、また、キャリブレーション時の記録を妨害し得ます。キャリブレーション時減速信号応答が必要なBSA /グルタルアルデヒド混合物、またはゆっくり紡糸攪拌棒より厚いから生じ得る別の共通の問題です。妨害物は、キャリブレーション時に信号を与えている場合には、それが電気に誤りがあったことがあるのMPD除外層を（ 例えば、十分な長電気めっきしませんでした）。このような場合には、電気めっき手順を繰り返すことが必要です。
手術中、麻酔薬1つのレベルは、すべてのマウスには十分ではないかもしれません。いくつかのマウスは「下に行く」ために麻酔の高いレベルを必要とするかもしれないし、いくつかのマウスは少ないが必要な場合があります。麻酔の低レベルで開始し、ゆっくりとマウスは軽い麻酔下になるまでそれを上げることが不可欠です。マウスによって定位装置になると深い麻酔を試験することができます尾やつま先のピンチ。 MEAを移植するための座標を選択するとき、多くの神経変性の動物モデル36、37、38に発生する可能性の脳萎縮のために注意し、正しいことも重要です。また、これは、MEAの記録特性に影響を与え、遅い時間分解能又は大幅に最小化シグナル応答をもたらすことができるように、血液は、MEA上に蓄積しないことを手術中に不可欠です。電極の周りに血の塊場合は、単にMEAを削除し、生理食塩水ですすいでください。
録音中に発生する可能性が最も一般的な問題の一つは、ノイズの多い信号です。そのような補助照明、追加の器具、およびドリルのような他の電子機器からの干渉はほとんどありそうな原因であるので、記録システムと同じ電気回路及び/又は出口にそれらを差し込む回避することが最良です。また、記録SYS場合TEMが適切に接地されていない、1は記録システムのオシロスコープ上の振動だけでなく、すべてのサイトに起因するノイズだけではなく、記録部位を観察します。記録システムの下で推奨アースマットは、これらの問題を回避するために、接地されたパイプに接続する必要があります。それはこれらのどれもエラーでないと判定された場合、エラーが基準電極、又はMEA自体に存在してもよいです。システムの動作を検証するために、新しい、未使用のMEAを用いて、ノイズの問題に遭遇したときに有用なトラブルシューティングの手法であってもよいです。変化なしに少しの参照電極結果を取り外すまたは交換する場合は、参照電極または半電池が故障している可能性があります。参照電極を変更すると、問題を解決する唯一の方法かもしれません。録音が完了すると、MEAの最終利益は、それらをきれいにし、再利用する機能です。 MEAのであれば、MEAは、校正中に適切に機能し続けるように約3回再使用することができます。
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Disclosures
GGは、本研究では、グルタミン酸の測定に使用FAST-16記録システムを作るQuanteon、LLCの個人事業主です。 JEQはQuanteonのための有給コンサルタントです。
Acknowledgments
（; U54GM104942 MNR）、NIA（MNR; R15AG045812）、アルツハイマー病協会（MNR; NIRG-12から242187）、WVU学部研究上院グラント（MNR）、およびWVU PSCORグラントこの作品は、国立総合医科学研究所によってサポートされていました（MNR）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
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