Summary
Aqui, descrevemos a configuração, navegação software e análise de dados para um método espacial e temporalmente precisa de medir a tônica e fásica mudanças glutamato extracelulares in vivo utilizando matrizes de microeletrodos ligado a enzima (MEA).
Abstract
interrupção neurotransmissor é muitas vezes um componente-chave de doenças do sistema nervoso central (CNS), desempenhando um papel na patologia subjacente a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, depressão e ansiedade. Tradicionalmente, microdiálise foi o mais comum (louvado) técnica para examinar as alterações de neurotransmissores que ocorrem nestes distúrbios. Mas porque microdiálise tem a capacidade de medir as alterações lentas 1-20 minutos através de grandes áreas de tecido, ele tem a desvantagem de invasividade, potencialmente destruir as ligações intrínsecas dentro do cérebro e uma capacidade de amostragem lenta. Uma técnica relativamente nova, a matriz de microeléctrodos (MEA), tem numerosas vantagens para a medição de alterações de neurotransmissores específicos dentro de regiões cerebrais discretas à medida que ocorrem, para fazer uma abordagem espacialmente e temporalmente preciso. Além disso, utilizando AAM é minimamente invasivo, permitindo a medição de alterações de neurotransmissores in vivo. Em nosso laboratório, nós have sido especificamente interessados em mudanças no neurotransmissor, glutamato, relacionada com a patologia da doença de Alzheimer. Como tal, o método descrito aqui foi usado para avaliar as perturbações do hipocampo potenciais em glutamato em um modelo de rato transgénico da doença de Alzheimer. Resumidamente, o método utilizado envolve o revestimento de um microeléctrodo de multi-local com uma enzima muito selectiva para o neurotransmissor de interesse e utilizando locais de auto-referenciar para subtrair o ruído de fundo e os interferentes. Depois de plaqueamento e de calibração, o MEA pode ser construído com uma micropipeta e reduzido para a região do cérebro de interesse utilizando um dispositivo estereotáxico. Aqui, o método descrito envolve a anestesiar RTG (TauP301L) 4510 e ratinhos utilizando um dispositivo estereotáxico para alvejar com precisão sub-regiões (DG, CA1, e CA3) do hipocampo.
Introduction
Medindo alterações de neurotransmissores no cérebro é uma ferramenta essencial para neurocientistas o estudo de doenças do sistema nervoso central (SNC) que são muitas vezes caracterizados por desregulao de neurotransmissores. Embora microdiálise em combinação com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC / CE) tem sido o método mais amplamente utilizado para medir alterações nos níveis de neurotransmissores extracelulares 1, 2, 3, 4, a resolução espacial e temporal de sondas de microdiálise pode não ser ideal para neurotransmissores , tais como o glutamato, que são estreitamente regulada no espaço extracelular 5, 6. Devido aos recentes avanços na genética e na imagem, existem métodos adicionais que podem ser utilizadas para mapear glutamato in vivo. Usando repórteres glutamato fluorescentes geneticamente codificados (iGluSnFR) umd de dois fotões imagiologia, os investigadores são capazes de visualizar a libertação de glutamato por neurónios e astrócitos, tanto in vitro e in vivo, 7, 8, 9. Notavelmente, este permite a gravação de um maior campo de visão e não perturbar as ligações intrínsecas do cérebro. Enquanto estas novas técnicas ópticas permitem a visualização da cinética de glutamato e medição de respostas evocadas sensoriais e actividade neuronal, eles não têm a capacidade para quantificar a quantidade de glutamato no espaço extracelular em regiões cerebrais discretas.
Um método alternativo é a matriz de microeléctrodos ligado a enzima (MEA), que pode medir selectivamente níveis de neurotransmissores extracelulares, tais como o glutamato, através da utilização de um esquema de gravao por auto-referenciados. A técnica MEA tem sido usado para estudar alterações na glutamato extracelular seguintes cerebral traumáticalesão 10, 11, 12, envelhecimento 13, 14, estresse 15, 16, epilepsia 17, 18, doença de Alzheimer 19, 20, e a injecção de um mímico viral 21 e representa um aperfeiçoamento em relação às limitações espaciais e temporais inerentes microdiálise. Considerando microdiálise restringe a capacidade de medir perto da sinapse 22, 23, AAM têm uma alta resolução espacial que permite a medidas selectivas de transbordamento glutamato extracelular perto sinapses 24, 25. Em segundo lugar, a resolução temporal baixa de microdiálise (1-20 min) limita a capacidade para investigar odinâmica rápida de liberação de glutamato e desembaraço que ocorrem no milésimo de segundo para a segunda faixa de 26. Como as diferenças na libertação ou alívio de glutamato pode não ser evidente em medidas de tónico, descansando os níveis de glutamato, pode ser essencial que a libertação de glutamato e depuração ser directamente medido. AAM permitir tais medidas, devido à sua alta resolução temporal (2 Hz) e baixos limites de detecção (<1 um). Em terceiro lugar, AAM permitir a análise de alterações em sub neurotransmissores dentro de uma região particular do cérebro, tais como o hipocampo de rato ou de ratinho. Por exemplo, usando MEAs que pode ter como alvo, separadamente, o giro dentado (DG), cornu Ammonis 3 (CA3) e cornu Ammonis 1 (CA1), do hipocampo, as quais estão ligadas através de um circuito trisynaptic 27, para examinar as diferenças sub em glutamato extracelular. Por causa do tamanho das sondas de microdiálise (1 - 4 mm) de comprimento e o dano causado pela implantação 28 </ sup>, 29, as diferenças sub-regionais são difíceis de abordar. Além disso, os sistemas ópticos de só permitir a estimulação através de estímulos externos, tais como uma estimulação suiça ou cintilação luz, que não permite a estimulação sub-7. Um benefício final de AAM em relação a outros métodos, é a capacidade para estudar estas sub-regiões in vivo, sem perturbar as ligações extrínsecos e intrínsecos.
Aqui, descrevemos a forma como um sistema de gravação (por exemplo, FAST16mkIII) em combinação com AAM, que consiste de um microeléctrodo de vários locais de cerâmica à base, pode ser diferencialmente revestido sobre os locais de gravação para permitir a agentes interferentes a ser detectado e removido o sinal de analito. Nós também demonstrar estas matrizes podem ser utilizadas para estudos baseados em amperometria de glutamato in vivo regulação dentro da DG, CA3, e sub-regiões do hipocampo CA1 de RTG anestesiado (TauP301L) 4510 ratinhos, um m utilizadamodelo ouse da doença de Alzheimer. Além disso, nós fornecemos confirmação da sensibilidade do sistema de MEA com a dinâmica rápidas de libertação de glutamato e depuração por tratamento dos ratinhos com o riluzol, uma droga demonstrado in vitro para diminuir a libertação de glutamato e aumentar a captação de glutamato 30, 31, 32, 33, e demonstrando essas respectivas alterações in vivo no modelo do rato TauP301L.
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Protocol
1. Revestimento da rede de microeletrodos com enzimas ou camada de matriz
- Preparando a solução de matriz proteica
- Pesar 10 mg de albumina de soro bovino (BSA) e transferir para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicionar 985 mL de água Dl para o tubo de microcentrífuga contendo BSA. Misture a solução por agitação manual do (re-pipetagem usando 1000 mL pipeta ~ 3 vezes, até que a BSA é dissolvido).
NOTA: Não use vórtice para misturar a solução pois isso pode introduzir ar na solução. Além disso, defina a pipeta para um volume de <1000? L (por exemplo, 700 mL) para evitar a introdução de bolhas de ar. A solução pode ser colocada numa microcentrífuga, se necessário. - Uma vez que a solução de BSA é dissolvido, adicionam-se 5 mL de solução de glutaraldeído a 25%. Misture a solução invertendo o tubo fechado de 3 - 5 vezes. A solução resultante é BSA a 1% com 0,125% de glutaraldeído.
- Separe a solu matriz proteicação durante 5 minutos. A solução aparecerá amarelo claro na cor.
- Preparar a solução de enzima desejada (por exemplo, glutamato-oxidase)
- Preparar a solução de oxidase de glutamato pela adição de água desionizada filtrada para o liofilizado, enzima purificada (por exemplo, 50 mL de água DI adicionado a 25 unidades de oxidase de glutamato, para se obter 0,5 U / microlitro).
NOTA: solução estoque alíquota (por exemplo, 1 mL) e armazenar as alíquotas em recipientes de tamanho apropriado (por exemplo, tubos de 500 mL de microcentrífuga) a -20 ° C. As alíquotas podem ser armazenadas por até 6 meses sob estas condições. - Adicionar 4 mL da solução de BSA / glutaraldeído para o tubo de microcentrífuga contendo aliquotas glutamato-oxidase. Misture a solução por agitação manual do (re-pipetagem com uma pipeta de 10 uL. A pipeta deve ser definido como o volume <5 mL). A solução resultante é de 1% de BSA, 0,125% de glutaraldeído e 0,1 U / mL de glutamato-oxidase.Usar a solução para revestir imediatamente.
Nota: solução de revestimento de oxidase de glutamato só pode ser usada dentro de 15 min. Embora vários MEAs podem ser revestidos com uma solução preparada, é recomendado que não exceda a janela de tempo utilizável para a oxidase de glutamato. O número de eléctrodos que pode ser revestido no prazo de 15 min variar. De um modo geral, de 4 a 6 eléctrodos podem ser revestidos de cada vez.
- Preparar a solução de oxidase de glutamato pela adição de água desionizada filtrada para o liofilizado, enzima purificada (por exemplo, 50 mL de água DI adicionado a 25 unidades de oxidase de glutamato, para se obter 0,5 U / microlitro).
- Revestimento da MEA
- Tipicamente, o revestimento de um par de local de gravação (s) em um MEA com a enzima pretendida (oxidase de glutamato) e um par diferente de sítio (s) de gravação (local 'sentinela' (s)) é revestido com a proteína de matriz inactivo.
- Use de ponta romba Hamilton microseringas (por exemplo, 10 ul) a AAM revestimento com oxidase de L-glutamato ou solução matriz de proteína inactiva (BSA + glutaraldeído). Os procedimentos utilizados para revestimentos de proteína de matriz de enzimas ou inactivos são os mesmos.
- Limpe as seringas antes e após o uso (3 lavagens comUa DI, 3 lavagens com metanol, 5 lavagens com água Dl).
NOTA: Dedicado seringas são usados para a aplicação de revestimentos de enzima (oxidase de glutamato) ou a proteína de matriz. Não utilize a mesma seringa para uma solução diferente. Recomenda-se a realização de revestimentos de proteína de matriz antes de revestimentos de enzimas. - Desenha-se oxidase de glutamato ou matriz de proteína utilizando uma seringa de 10 pL de Hamilton. Suavemente pressionar o êmbolo para dispensar uma pequena gota de solução na ponta de seringa (visualizado usando um microscópio de dissecção).
- Utilizando o microscópio de dissecação para atingir os locais de gravação MEA, aplicam-se a solução para os locais de gravação adequadas contactando brevemente os locais de gravação com a solução gota / grânulo, o que representa uma camada. Três camadas são suficientes tanto para a proteína de matriz e o revestimento enzima. camadas espessas podem reduzir a sensibilidade do MEA.
- Elevar a gotícula de solução para cima e para fora dos locais de gravações (isto é, o Syringe ponta não deve raspar toda a superfície da MEA).
- Definir um temporizador para 1 min. Este é o requisito mínimo de tempo entre aplicações de revestimento para o sítio (s) de gravação. Permitir MEAs revestidas com enzima de curar a 4 ° C durante 5-7 dias.
- Grave o número de demãos aplicadas, quanto tempo levou para aplicar os revestimentos, o número eletrodo, e um nome e data em um caderno de laboratório.
2. galvanização com m-fenilenodiamina para uma selectividade melhorada
- Preparação de dicloridrato de m-fenilenodiamina solução (MPD)
NOTA: Placa a camada de exclusão, mPD, para evitar a oxidação da dopamina e outros, moléculas interferentes grandes (por exemplo, ácido ascórbico), melhorando assim a selectividade do sensor em glutamato / H 2 O 2 em relação a outras moléculas potencialmente interferentes.- Medir 50 mL de 0,05 M de tampão fosfato salino (PBS) em um balão volumétrico e transferir 50 mL de 0,05H PBS para uma maior (150 mL) num Erlenmeyer.
- Usando a tubagem ligada a um tanque de azoto (por exemplo, utilizando o tubo ligado um ejector de pressão), anexar uma ponta de pipeta (ex ponta P200) para a extremidade aberta do tubo. Colocar o tubo com a ponta da pipeta em anexo em solução de PBS e cobrir a solução ligeiramente com parafilm. Ligue azoto e suavemente bolha solução durante 20 min.
- Pesar 0,045 g de mPD.
Cuidado: mPD é uma substância potencialmente cancerígena. Pesagem de mPD deve ser realizada utilizando uma escala contido dentro de um extractor de fumo. Usar luvas e máscara ao utilizar mPD. Garantir o capô é funcional e que a folha seja puxado para o nível de trabalho apropriado. Imediatamente superfícies limpas que possam ter sido contaminadas com mPD para evitar a coloração permanente. - Depois de borbulhar, transferir todo o mPD para a solução de PBS desgaseificado. Cobrir a abertura do frasco com parafilm e suavemente solução agitar para dissolver mPD em solução. Evite aggressive a mistura ou utilização de um vórtice pois isso pode introduzir gases para dentro da solução.
- Transferir a solução para um copo de 50 mL. A barra de agitação não é necessária.
- Galvanoplastia o eléctrodo
- Obter um eléctrodo de referência. Utilizar eléctrodos de referência dedicados a mPD plaqueamento única. Utilizar um eléctrodo de referência para os procedimentos de calibração.
- Posicionar o braço de plástico do suporte do eléctrodo de referência durante a proveta. Verificar por bolhas de ar no eléctrodo de referência de vidro (pode não ser capaz de ver). Agite suavemente a extremidade distal do eléctrodo de referência para remover quaisquer bolhas de ar na ponta.
- Colocar o eléctrodo de referência, através da abertura no braço de plástico e inferior no tubo de ensaio contendo PBS. Certifique-se de que o eléctrodo de referência não entra em contacto com o fundo da proveta.
- Ligue o eléctrodo de referência para o andar de entrada (por exemplo, 2, pA / mV) e ligar (por exemplo conector DIP) MEA a ser placa mPDd para o andar de entrada.
- Diminuir a MEA na solução proveta de tal modo que apenas a ponta MEA é submerso na solução. Não submergir as pontas MEA no estado líquido para além da 'bolha' negro (o negro de isolamento localizado acima da ponta MEA). Isso pode danificar o MEA.
- Executar uma calibração 'teste' para verificar a funcionalidade dos canais de eléctrodos e ligação para o andar de entrada.
NOTA: Embora as configurações de hardware deve refletir o equipamento a ser utilizado, os detalhes relacionados com analito / tipo interferente ea concentração não precisa ser digitado para a calibração 'test'. O modo de recodificação deve ser 'amperometria' e o 'V-aplicada' deve ser -0,7 V. Verificar gravação típico para todos os canais. - Cancele seleccionando 'Cancelar' quando a conectividade de todos os locais de registro é verificada. Não é necessário para salvar os dados de calibração.
- Selecione o ícone "Galvanoplastia" no ambiente de trabalho. A Galvanoplastia ParaMenu de ol aparecerá. Verifique as configurações corretas são inseridas:
PP amplitude de: 0,25
Offset: -0.5
Frequência: 0,05
Duração (min): 20 - Selecione o botão 'pause' para começar chapeamento. O campo de tempo decorrido deve começar a contagem regressiva.
- Após a conclusão (todo o tempo decorrido), selecione 'outro MEA' no menu apareceu para começar mPD chapeamento um MEA adicional. Substitua o MEA banhado com um MEA a ser mPD banhado e repita o procedimento de galvanoplastia utilizando a ferramenta de galvanoplastia.
NOTA: Recomenda-se usar a solução mPD preparado não mais de 2 vezes ou dentro de um período de 1 h. Prepare uma solução fresca para preparar mais de 2 AAM. - Selecione 'software saída' para concluir galvanoplastia. Lavar pontas de eléctrodos de MPD-chapeado com água DI (para evitar um resíduo de sal) e armazenar (24 h) antes de o calibrar.
- Remover o eléctrodo de referência a partir da solução e enxagua-se com água desionizada antes da colocação em os s adequadascumulação solução (por exemplo, 3 M de NaCl). Assegurar a ponta do eléctrodo de referência é submerso em solução. Lentamente inferior eléctrodo de referência de vidro para dentro da solução para evitar danificar o vidro.
- Descarte a solução mPD em um recipiente de resíduos perigosos adequadamente marcada.
3. Calibre o MEA para Detecção de glutamato e Selectividade (Figura 1) 21
- Preparar as soluções necessárias para a calibração.
NOTA: Consulte a Tabela 1. - Executar a calibragem sob agitação constante (bateria magnético operado agitador), a 37 ° C. Ligue a almofada de aquecimento ou banho de água circulante e obter uma pequena barra de agitação. Mexa devagar, mas rápido o suficiente para que quando uma adição é feita (abaixo), o novo patamar é alcançado rapidamente.
- Ligue o andar de entrada (2 pA / mV) ao sistema de controlo de registo e inserir a ponta MEA em 40 mL de PBS 0,05 M agitada (usar um copo de 50 mL).
- Ligue o referência eléctrodo. Flick a fim de assegurar que não existem bolhas de ar.
- Abra o programa de gravação e clique em "Calibração". Verifique se as configurações estão corretas (verificar que os sites de sentinela são selecionados como isso pode mudar com diferentes eletrodos), escolher o número MEA e pressione "Start".
- Permitir que 5 - 10 minutos para equilibração; começar uma vez que a linha de base ter estabilizado (<0.004 nA min mudança /).
- Seleccionar "linha de base" e adicionar 500 mL de 20 ácido ascórbico mM (interferente; final [250 ^ M]) e seleccionar "Interferente" (AA é pensado como interferente ampla-cérebro) uma vez que a corrente atingiu um novo patamar, firme, se qualquer. Permitir 0,5-1 min entre as adições. Se o MEA está devidamente galvanizados, quase nenhuma mudança deve ser observada.
- Adicionar 40 uL de 20 mM de L-glutamato (final de [20? M]) e uma vez que a corrente atingiu um novo, plateau estável, uma marca r adição "Analito". Repetir três vezes para um total de 3 Glutamate adições.
- Adicionar 40 mL DA. Não selecione "Analito"; seleccionar "Substância de Teste" - DA só pode ser um interferente nas zonas que contêm AD.
- Adicionar 40 ul de peróxido. Não selecione "Analito"; selecione "substância de ensaio".
- Clique no botão "Stop" uma vez que a calibração está concluída.
- Para determinar a funcionalidade do MEA, clique na guia cálculo e gravar os seguintes parâmetros em um caderno de anotações.
- Para a concepção MEA (3.000? M 2) utilizado nestes calibrações, usar um MEA com um declive de 0,004 ≥ nA / uM mas inclinações mais baixas podem ser usadas para certas experiências. Se houver menos do que uma diferença de 10% na inclinação entre locais de enzimas revestidos e não revestidos, em seguida, usar estes AAM para libertação evocada única ou limpo / descartar o MEA.
- Usar um limite de detecção (LOD) ≤ 1,5 uM. Se o LOD seja maior do que 1,5 uM, em seguida, utilizar estas para MEAs releas evocadose e absorção somente. Não use esses eletrodos para gravar níveis tónicos.
- Usar uma selectividade para o analito pretendido (ou seja, o glutamato) sobre o interferente de> 20 unidades arbitrárias. Se selectividade é inferior a 20, em seguida, limpo / descartar o MEA.
- Usar uma linearidade (R2) da curva de calibração de ≥ 0,90. Se a linearidade é menos do que 0,90, em seguida, limpo ou descartar MEA.
- Salve o arquivo com o # da MEA, a data e as iniciais da pessoa calibragem.
4. Monte a micropipeta
NOTA: As micropipetas (capilar de vidro) deve ter uma ponta com um diâmetro interno de 10 - 15 um.
- Coloque a micropipeta centralmente entre todos os locais de gravação quatro platina e montar 50-100? M acima do MEA usando cera pegajoso e argila de modelagem.
- Para carregar a micropipeta, usar uma seringa de 1 ml, cheio com solução de KCl ou glutamato, um 0,22 um seringa estil filter, e um de 97 mm de comprimento, de calibre 28 pipeta de enchimento, repreencher da micropipeta. Ou seja, inserir a agulha no topo da micropipeta e preencher na parte inferior da micropipeta (o fim para o MEA), certificando-se que não há bolhas.
- Anexar a micropipeta para o sistema de ejecção de pressão a 2 - 20 psi durante cerca de 1 s.
5. Placa da Miniatura do eletrodo de referência para In Vivo Uso
- Preparar a solução de revestimento (50 g de NaCl / 90 mL de 1 M de HCl em um banho de 100 mL de proveta (plating)) e cortar o eléctrodo do banho (~ 10 cm de comprimento de platina (Pt) do fio (~ 0,02" de diâmetro)).
- Cortar uma 10 - 15 cm de comprimento da peça de Teflon revestido fio de prata (0,008" nu) e utilizar uma lâmina de barbear para raspar ~ 1 cm de revestimento de Teflon de cada extremidade da ponta do arame de prata.
- Soldar um pino de ouro sobre uma extremidade e colocar uma extremidade do fio de prata exposto no banho de chapeamento.
- Usando um adaptador DC (utilizar apenas um adaptador de corrente que tem uma saída de ~ 9 -. 15 VDC max),prender o fio de "vermelho" (+) para o fio de prata preparada (eléctrodo de referência), do lado do pino de ouro. Prender o "preto" (-) de fio de Pt banho de cátodo.
- Ligar o adaptador de DC. Olhe para o processo de revestimento correto - bolhas deve aparecer no eletrodo de banho; eletrodo de referência transforma uma prata / cor cinza.
CUIDADO: Não ligue os fios [preto (-) vs Red (+)] - chapeamento banho será arruinado se isso ocorrer e solução fresca chapeamento terá de ser feita. A má solução vai se transformar na cor amarela: não use!
NOTA: A reacção de chapeamento leva 2-5 min geral: Ag 0 + Cl - → AgCl + e - - Testar o eléctrodo de referência.
- Definir um multímetro para o 100 - configuração de 200 mV DC.
- Coloque um ponto de referência (isto é, um eléctrodo previamente testado conhecido para trabalhar) eléctrodo de referência em NaCl 3 M e teste contra o eléctrodo de referência recém-preparada.
NOTA: Se nósing um novo eléctrodo de referência, embeba-lo no seio de NaCl 3 M, antes de uso (12 h recomendado). - Coloque o chumbo "vermelho" (+) no pino de ouro do eléctrodo de referência para ser testado. Coloque o "preto" - liderança no eletrodo de referência (). Uma gama aceitável de leitura é de ± 10 mV. 0 mV é ideal entre os eléctrodos de referência 2.
Cirurgia 6. animal Geral de MEA Recordings
- Preparação para a cirurgia
- Coloque Equipamentos para a cirurgia em desinfetante na noite anterior.
- Retirar as ferramentas do desinfetante e enxaguar bem e colocar as ferramentas em uma almofada cirurgia estéril. Obter uma almofada de aquecimento.
- Calibrar dois eléctrodos e fixar a micropipeta como descrito nos procedimentos 3 e 4.
- Faça o eletrodo de referência conforme descrito na Seção 5.
- Adicione 200 uM de glutamato e KCl 70 mM. Consulte a Tabela 1.
- Obter o animal e registar o peso em folhas de cirurgia.
- Prepare a anestesia e ligar a almofada de aquecimento.
- Realizar a cirurgia MEA
- Utilizando isoflurano (fluxo 4% em oxigénio), anestesiar o animal numa câmara de indução até que a taxa respiratória diminuiu significativamente e o animal não responder ao dedo do pé ou de aperto da cauda. taxa respiratória da ficha e da temperatura corporal a cada 15 min.
- Colocar o animal no dispositivo estereotáxico utilizando as barras de ouvido para estabilizar a cabeça. Certifique-se de que o animal está seguro e a cabeça não se move. Reduzir o fluxo de isoflurano a 1,5-3% em oxigénio. Certifique-se de que a almofada de aquecimento está devidamente posicionado sob o animal e ajustado para 37 ° C para fornecer calor suplementar. A falha em fornecer calor suplementar pode resultar em hipotermia profunda e morte prematura do animal.
- Aplicar pomada utilizando um aplicador de algodão estéril e gravar a frequência respiratória etemperatura corporal. Usando um aparador alimentado por bateria, raspar a parte superior da cabeça. Use as pequenas tesouras cirúrgicas para remover a pele perto das orelhas.
- Neste ponto, colocar as luvas cirúrgicas estéreis. Aplicar o iodo e, em seguida, álcool (por três vezes) para o couro cabeludo.
- Usando um bisturi, fazer uma incisão linha reta no meio do couro cabeludo e espalhar a pele com pinças bull dog. Dê uma dica de algodão estéril para absorver todo o sangue. Usar peróxido de hidrogénio para facilitar o aparecimento de bregma e lambda.
- Verificar que a cabeça está devidamente posicionado através da medição da D / V e M / L de coordenadas bregma e lambda. Coordenar as alterações devem ser zero se a cabeça está em uma superfície plana. Ajustar as barras de cabeça e da orelha, conforme necessário para assegurar uma superfície plana.
- Encontrar bregma, e zero as coordenadas. Usando as coordenadas desejadas, mover para a esquerda e para a direita e faça uma marca com um marcador permanente. Usando um cauterizador / marcador, fazer uma grande praça em torno da marca, com espaço suficiente para alcançar oregião desejada.
- Usando uma ferramenta rotativa estéril, perfurar em torno da marca quadrada. Deixe-se envolver todo o sangue usando um aplicador de algodão estéril. Completamente desinfectar a broca antes de cada utilização.
- Anexar o MEA para o andar de entrada e aterrar a pipeta com a primeira solução desejada. Certifique-se de deixar uma lacuna na pipeta sem solução para que a solução ser expulso pode ser examinado. Conectar o tubo para a micropipeta de vidro.
- Ligar o tanque de azoto e o ejector de pressão (psi = 5, tempo = 0,6 s). Test (pressione o botão vermelho manual) para garantir a pipeta não está entupido antes de começar.
- Calibrar a micropipeta. Comece no 0 no retículo e coloque um pedaço de fita azul no headstage para indicar o ponto de início. Ligue o leitor digital e redefini-la para zero. Ir para baixo de 1 mm (DV) e contagem do número de tiques da solução mudou-se o retículo. 10 carrapatos deve ser igual a 1 mm (1 mm = 250 nL), para que um tique = 25 nL.
- Colocar o eléctrodo de referência numalocalização remota a partir da MEA de tal modo que ainda está em contacto com o líquido com o cérebro para completar o circuito.
- Encontrar bregma com o MEA ligado e zero o leitor digital. Mover o MEA para as coordenadas desejadas. Lentamente, abaixe o MEA até que a ponta toca o cérebro. Zero DV coordenar e lentamente o MEA no cérebro.
- No programa de gravação, clique no eletrodo calibrado desejado e clique em "Executar Experiment". O sistema irá iniciar a gravação de níveis tónicos para o analito de interesse, enquanto o animal é anestesiado.
- Aumentar a um eixo que vai ajudar na observação da linha de base e permitir que o eléctrodo de linha de base para 20 - 45 min.
- Depois a linha de base é estável, definir o ejector de pressão para .6 s e 5 psi e pressionar a tecla vermelha sobre o ejector de pressão para ejectar. Gravar o tempo e pressão, assim como de volume / carrapatos movido sobre a folha de injecção (Figura 2). Faça quaisquer notas que são necessárias (ie,picos maiores, efeitos de diluição, pipeta entupido, barulhento linha de base / o-escopo).
- Para injecções de glutamato, esperar 3-5 min entre as injecções. Para injecções de KCl esperar 1 - 2 min entre as injecções. Injectar usando a mesma pressão e tempo de pelo menos 3 vezes. Alterar a hora e repita. Tente não alterar a pressão a menos que o micropipeta está entupido.
- Se a micropipeta está entupido, aumentar a pressão até 30 psi.
- Gravar a partir das regiões cerebrais desejados, repetindo-se em ambos os lados do cérebro utilizando soluções diferentes. Gravar uma linha de base em cada nova região, durante 20 min.
- Tomar o MEA com micropipeta em anexo, enxaguar com água DI e embeber em PBS durante a noite até que todo o sangue é ido.
- Eutanásia o animal e guardar o cérebro num tubo pré-rotulados e armazenados no congelador de -80 ° C ou manter um lado para a fixação. Para sacrificar o animal, sobredosagem com isoflurano (inalação). Execute decapitação usando uma tesoura cirúrgica e dissecar as regiões desejadas.
7. AAM Limpeza revestidos depois de Uso
- Fazer AMA não limpa se não utilizado. Se houver cotão ou de pó sobre a superfície, limpa com metanol e deixar secar durante 24 horas antes do revestimento.
- Ligar o banho de água (80 ° C) e embeber a ponta da MEA, durante 30 min. Cuidadosamente limpar a ponta do eléctrodo com um aplicador com ponta de algodão para remover quaisquer detritos que pode ser deixada na ponta do eléctrodo. Não fique com a "porção de isolamento" preto do MEA molhado.
- Usando três sonicadores diferentes, embeber a ponta da MEA em (1) Citrisolv, um comercial de solvente e agente de compensação (2) isopropílico, e (3) água desionizada, durante 5 min. Cuidadosamente limpar a ponta do eléctrodo com aplicador com ponta de algodão para remover quaisquer detritos que pode ser deixada na ponta do eléctrodo.
- Examine as sugestões em um microscópio de dissecação para garantir as camadas foram removidas com sucesso.
8. Análise
- Para analisar os dados,primeiro exportar a experiência desejada clicando duas vezes o experimento acabado e selecionando "exportar dados" a partir do menu drop-down arquivo.
- Salvar esses dados para o local do arquivo desejado e abrir o programa de análise. Clique em "abrir" no programa de análise e escolha o arquivo recentemente salvo.
- Dê o programa de alguns momentos para fazer o upload do arquivo e, em seguida, verificar experimento sob a guia marcadores de eventos. Sob saída, verificar as caixas para os parâmetros desejados. Por exemplo, linha de base, a amplitude, a área de pico (área sob a curva), t origem, e T-80.
- Clique em Atualizar e, em seguida, analisar para exportar os dados para uma planilha (isso pode levar alguns minutos). O programa dará um prompt para salvar o arquivo para o local desejado. Uma vez salvo, o arquivo pode ser editado em uma planilha.
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Representative Results
Embora esta tecnologia pode ser usada para medir alterações na glutamatérgica sinalização em muitos tipos de modelos animais, tais como lesão traumática cerebral, envelhecimento, estresse e epilepsia, aqui vamos demonstrar como a tecnologia MEA pode ser usado para examinar alterações glutamatérgicos no modelo de rato transgénico de taupatia humano 19, 20. O RTG (TauP301L) 4510 ratinho expressa a mutao P301L em tau associada a demência fronto-temporal e parkinsonismo ligados ao cromossoma 17, e é geralmente utilizada para estudar patologia tau associada com a doença de Alzheimer, tauopatias neurodegenerativas e demência fronto-temporal. Nós também demonstramos que a sinalização glutamatérgica pode ser modificado por intervenção farmacológica. Foram tratados ratinhos TauP301L com o riluzol, um fármaco de modificação da doença aprovado pela FDA para a esclerose lateral amiotrófica (ALS), que modula a sinalização glutamatérgica por estabilizar oinactivar estado dos canais de sódio dependentes da voltagem, o que leva a uma diminuição na libertação de glutamato, e uma potenciação da captação de glutamato por meio de um aumento na expressão do transportador de glutamato, levando ao aumento da folga glutamato 30, 31, 32, 33.
Nós escolhemos este conjunto de dados particular para fins demonstrativos por quatro razões. Em primeiro lugar, este conjunto de dados demonstra a resolução temporal do sistema, como mostra a nossa capacidade para medir a dinâmica rápidos de liberação transiente e captação de glutamato. Além disso, este modelo animal prclico apresenta alterações em glutamato tónico, a libertação de glutamato, e a depuração glutamato, permitindo um exemplo de alterações em cada medida. Em segundo lugar, utilizando este conjunto de dados, a alta resolução espacial que permite a medição das diferenças sub-região do DG, CA3, umnd CA1 do hipocampo é demonstrada. Em terceiro lugar, esses dados permite a demonstração de como a intervenção farmacológica pode ser usado para mitigar as alterações glutamatérgicos observados em modelos animais pré-clínicos. Finalmente, porque este modelo pré-clínico tem alterações na liberação de glutamato, a necessidade de uma interpretação cuidadosa de apuramento glutamato na presença de liberação de glutamato alterado pode ser explicado.
Depois de se atingir uma linha de base estável, como indicado por <0,004 nA / min mudança na inclinação (10 - 20 min), que em primeiro lugar medidos os níveis de glutamato tónico (iM) por uma média de níveis de glutamato extracelular ao longo de 10 s antes de qualquer aplicação de soluções. Observamos o aumento dos níveis de glutamato tónico nas regiões CA3 e CA1 de camundongos TauP301L, e riluzol restabeleceu os níveis de glutamato tónicas ao dos controlos (Figura 3A). Em seguida, KCl foi entregue localmente (por meio de uma micropipeta) para cada uma das três sub-regiões de um hemisphere a cada 2-3 minutos. Após 10 sinais reprodutíveis, o que é indicativo de um sistema neuronal de glutamato intacta 34, os resultados foram calculadas as médias para cada grupo e a amplitude média em comparação. Vestígios representativos (Figura 3B) revelou aumento da libertação de glutamato em murganhos TauP301L após a aplicação de KCl em todas as três sub-regiões (somente CA3 é mostrado), um efeito que foi resgatado por tratamento riluzol (Figura 3C).
O CME foi, em seguida, transferida para o hemisfério oposto e deixou-se atingir uma linha de base estável (10 - 20 min) antes de glutamato exógeno foi aplicado para analisar folga glutamato (Figura 4). Variando os volumes (50-250 nl) de 200 glutamato solução estéril-filtrada fiM foram aplicadas no espaço extracelular cada 2 - 3 minutos, e a superfície líquida sob a curva (AUC) foi usado como uma medida de captação de glutamato. Esta rápida aplicação de glutamato em tele espaço extracelular permite imitando da liberação de glutamato endógeno e medição da captação de glutamato. Porque transportadores de glutamato exibem uma cinética de Michaelis-Menten de 35, uma gama de volumes (50-250 nL) de glutamato exógeno é injectado para expor as diferenças de absorção. Para fazer isso, cada animal recebe 1 - 2 injecções em incrementos de 50 nL dentro do 50-250 gama nL. Embora uma sempre deve confirmar que o volume injectado por cada grupo por região não é estatisticamente diferente na p ≤ 0,05 nível, a melhor maneira de assegurar a AUC líquida está relacionado com a absorção, e não a quantidade de glutamato aplicado ou difusão, é o de assegurar que tanto de amplitude (Figura 4A) e aumento T (uma medida de difusão a partir da fonte de ponto (micropipeta) para a MEA na Figura 4B) não diferem 10, 11, 19, 20. este allows de "pico" de harmonização das amplitudes (Figura 4C), tal que as diferenças em AUC líquida são assumidos como sendo devido a diferenças na absorção e não a quantidade aplicada ou difusão. correspondência Peak é particularmente importante quando os animais têm diferenças existentes na liberação de glutamato. Porque uma gama de volumes é injetado, a variação de amplitude e aumento T muitas vezes são grandes e adicionando animais adicionais não diminui a variância para estas medidas, uma vez que são inerentes ao projeto. Uma vez que a amplitude e aumento T foram semelhantes entre os grupos em cada sub-região (Figura 4A, 4B), assume-se que as diferenças em AUC líquida (Figura 4C, 4D) são devidas a diferenças na captação de glutamato. O riluzol melhora folga glutamato comparação com os controlos em todos os três sub-regiões (Figura 4D). Finalmente, um MEA com uma micropipeta anexado é usado para aplicar localmente um corante para confirmar a colocação MEA após cérebro seccionamento, Tal como demonstrado na Figura 3D.
Estes dados indicam que a tecnologia MEA é capaz de medir a libertação de neurotransmissores no interior de pequenas sub-regiões do hipocampo 24, 25, ao contrário das técnicas anteriores (por exemplo, microdiálise), que só registados a partir de grandes áreas de amostra e, muitas vezes danificados circuitos neuronais 28, 29. Além disso, os MEAs fornecer-nos com alta resolução temporal para medir a cinética rápidos de liberação de glutamato e desembaraço 25.
Figura 1: In Vitro Calibração de um microeletrodos auto-referência Medir a mudança na corrente (PA) em um Oxidase site glutamato (GluOx; vermelho) vs. um site Sentinela (Sent; azul). O ácido ascórbico interferentes (AA: 250? M) e a dopamina (DA: 2 ^ M) não alterou a corrente em ambas as oxidase de glutamato ou locais de sentinela. A adição de glutamato (Glu: 20, 40, 60 uM) produziu um aumento gradual de corrente no site oxidase de glutamato, mas nenhuma alteração no site sentinela. Peróxido de hidrogénio (H 2 O 2: 8,8 mM) produziu um aumento na corrente em ambos os locais. Sensibilidade, inclinação, limite de detecção, e R 2 valores foram calculados após a calibração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Uma amostra Electrochemistry folha de cálculo. Esta folha de cálculo inclui colunas de tempo de injecção ou o número de injecção (TEMPO / TTL), coordenadas do cérebro (AP, mL, DV),a quantidade de pressão aplicada (azoto), a duração da pressão (hora), e o volume injectado pelo ejector de pressão. Quaisquer notas, tais como sinais estranhos ou entupimento da micropipeta deve ser gravado na coluna notas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Extracelular tónico e cloreto de potássio (KCl) Datas de -evoked de glutamato nas regiões DG, CA3 e CA1 do hipocampo. (A) Nas regiões CA3 e CA1 do hipocampo, os níveis de glutamato tónicos foram significativamente aumentados em ratinhos tratados com veículo TauP301L (Veh-TauP301L), um efeito atenuado por tratamento riluzol. (B) registos representativos de correspondência de linha de base de libertação de glutamato KCl evocadas em CA3 apresentou r tratamento iluzole (rIL-TauP301L) atenuou o aumento significativo na amplitude da libertação de glutamato observada em ratinhos Veh-TauP301L. A aplicação local de KCl (↑) produziu um aumento robusto em glutamato extracelular que rapidamente regressaram aos níveis tónicas. (C) A aumentou significativamente a libertação de glutamato de KCl evocadas observada em ratinhos Veh-TauP301L na DG e CA3, e CA1 após aplicação local de KCl foi atenuada com o tratamento com riluzol. (D) Cresyl-violeta coradas 20 um corte de hipocampo mostra a posição de MEA faixas em CA3 e CA1 (Média ± SEM; ** p <0,01 versus Controlo VEIC-VEIC-TauP301L, # p <0,05 Ril-Tau- P301L vs Veh-TauP301L, ## p <0,01 vs Ril-TauP301L Veh-TauP301L; n = 14-19 / grupo). Esta figura reimpressa com a permissão de John Wiley and Sons 19, 20.rget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. O glutamato Absorção Após exógena Aplicação glutamato nas Regiões DG, CA3 e CA1 do hipocampo. (A) A amplitude do sinal de glutamato localmente aplicado foi semelhante entre grupos em cada região. (B) t origem, um indicador de difusão de glutamato a partir da micropipeta, foi semelhante entre os grupos em cada região. (C) os sinais representativos de glutamato em CA3 da aplicação local do glutamato no Veh-Controls, Veh-TauP301L, e ratinhos Ril-TauP301L. Tratamento (D) O riluzol reduziu os aumentos significativos na área líquido sob a curva (AUC) foi observada em ratos Veh-TauP301L em todos os 3 regiões do hipocampo, indicando melhoria da captação de glutamato em tratados com riluzole tratinhos auP301L (Média ± SEM; * p <0,05 vs. Controle VEIC-VEIC-TauP301L, ** p <0,01 versus Controlo VEIC-VEIC-TauP301L, # p <0,05 vs. Ril-TauP301L Veh- TauP301L, ## p <0,01 vs Ril-TauP301L Veh-TauP301L; n = 13-15 / grupo). Esta figura foi reimpresso com permissão de John Wiley and Sons 20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 0,05 M PBS | 2 L de água DI: |
| Armazenar em recipiente de vidro envolto com folha de estanho. Levar o pH a 7,4 com KOH, se necessário. | NaH 2 PO 4? H 2 O: 2,8 g de Na 2 HPO 4: 11,34 g Cloreto de sódio: 11,68 g |
| Ácido ascórbico 20 mM 50 mL de água DI: | |
| Faça diariamente. | ácido ascórbico: 0,18 g |
| 20 mM de L-glutamato | 50 mL de água DI: |
| Faça semanal fresco. | hidrato de sal monossódico de L-glutamato: 0,15 g |
| Dopamina 2 mM | cloridrato de dopamina: 0,038 g |
| Faça mensal fresco. | 0,1 M de ácido perclórico: 10 mL Levar o volume a 100 ml com água DI |
| Peróxido de hidrogénio 8,8 mM | 50 mL de água DI: |
| Faça semanal fresco. | peróxido de hidrogénio: 500 uL |
| Cloreto de potássio 70 mM | 100 ml de água DI: |
| Faça o dia fresco de experimento. | cloreto de potássio: 0,08 g Cloreto de sódio: 0,07 g de cloreto de cálcio: 0,004 g |
| 200 μ; H Glutamato | glutamato 20 mM: 100 uL |
| Faça o dia fresco de experimento. | solução salina estéril: 10 mL |
Tabela 1: As soluções de calibração.
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Discussion
A técnica MEA permite a medição da cinética rápida de libertação de neurotransmissores e a absorção in vitro e in vivo. Assim, a tecnologia produz uma vasta variedade de saída de dados, incluindo os níveis de neurotransmissores tónicas, a libertação de neurotransmissores evocados, e depuração neurotransmissor. No entanto, porque o uso de AAM é um procedimento relativamente complexo, existem numerosos factores que podem necessitar de ser optimizado para utilização com sucesso. Por exemplo, durante a calibração, pode-se observar que não há formas de onda de sinal (tela osciloscópio) ou que as respostas à estimulação são mínimos ou ausentes. Provavelmente devido a um mau funcionamento do sistema, reiniciando o sistema de gravação, ou computador, pode resolver o problema. Além disso, o problema poderia ser um erro de conexão. Antes de calibrar, é pertinente para verificar novamente que as ligações dos eléctrodos da MEA e de referência estão ligados correctamente. A substituição do soquete DIP na headstage pode resolver problemas de conexão MEA.Se o MEA não é completamente em solução ou um eléctrodo de referência mal mantido é utilizado, estes também podem interferir com a gravação durante a calibração. respostas de sinais retardado durante a calibração é um outro problema comum, o qual pode resultar de um mais espessa do que a necessária mistura de BSA / glutaraldeído, ou uma barra de agitação que gira lentamente. No caso em que os interferentes são dando um sinal durante a calibração, é possível que houve um erro na galvanização (por exemplo, não galvanizar longo o suficiente), a camada de exclusão mPD. Em tal caso, repetindo o procedimento de galvanoplastia é necessário.
Durante a cirurgia, um nível de anestésico podem não ser suficientes para todos os ratinhos; alguns ratos podem exigir níveis mais elevados de anestesia para "ir abaixo" e alguns ratos podem exigir menos. É essencial para começar com um baixo nível de anestesia e lentamente levantá-lo até que o mouse está sob anestesia luz. A anestesia profunda pode ser testado uma vez que o ratinho está no dispositivo estereotáxico por umcauda ou pitada dedo do pé. Ao escolher coordenadas para a implantação do MEA, também é importante observar e corrigir possíveis atrofia cerebral que pode ocorrer em muitos modelos animais neurodegenerativas 36, 37, 38. Além disso, é imperativo durante a cirurgia que o sangue não se acumula no MEA, pois isso pode afetar as propriedades de gravação do MEA e resultar em resolução temporal lenta ou respostas de sinal grandemente minimizado. Se a formação de coágulos de sangue em torno do eléctrodo, basta remover o MEA e lavar com solução salina.
Durante a gravação, um dos problemas mais comuns que podem ocorrer é a de um sinal ruidoso. A interferência de outros dispositivos electrónicos, tais como a iluminação auxiliar, instrumentos adicionais, e brocas são os culpados que mais provavelmente, por isso, é melhor evitar conectando-as ao mesmo circuito eléctrico e / ou de saída, como o sistema de gravação. Além disso, se os sys gravaçãoTEM não está devidamente ligado à terra, um vai observar oscilações no osciloscópio do sistema de gravação, bem como o ruído decorrente de todos os sites, e não apenas os locais de gravação. O tapete de aterramento recomendado sob o sistema de gravação deve ser conectado a um tubo aterrado para evitar esses problemas. Se for determinado que nenhuma delas é o erro, o erro pode encontrar-se com o eléctrodo de referência, ou o próprio MEA. Ao encontrar problemas de ruído, utilizando um novo MEA, não utilizado para verificar o funcionamento do sistema pode ser uma abordagem útil solução de problemas. Se desligar ou substituindo os resultados dos eléctrodos de referência em pouca ou nenhuma mudança, o eléctrodo de referência ou de meia-célula pode ter um mau funcionamento. Alterar o eletrodo de referência pode ser a única maneira de resolver o problema. Quando a gravação estiver concluída, um benefício final do MEA é a capacidade de limpar e reutilizá-los. MEAs podem ser re-utilizados aproximadamente três vezes mais longo que o MEA continua a realizar de forma adequada durante a calibração.
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Disclosures
GG é o único proprietário de Quanteon, LLC que faz com que o sistema de gravação FAST-16 usado para medições de glutamato neste estudo. JEQ é um consultor pago para Quanteon.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associação de Alzheimer (MNR; NIRG-12-242187), WVU Faculdade Research Senado Grant (MNR), e WVU PSCOR Grant (RNM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
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