Summary
Här beskriver vi setup, programvara navigering, och dataanalys för en rumsligt och tidsmässigt exakt metod för att mäta tonic och phasic extracellulära glutamat förändringar in vivo med användning av enzymkopplade mikroelektroduppsättningar (MEA).
Abstract
Neurotransmittor störning är ofta en nyckelkomponent i sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS), som spelar en roll i patologin underliggande Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, depression och ångest. Traditionellt har mikrodialys varit den vanligaste (hyllade) teknik för att undersöka signalsubstans förändringar som sker i dessa störningar. Men eftersom mikrodialys har förmågan att mäta långsamma 1-20 minuten-ändringar över stora delar av vävnad, har den nackdelen invasivt, potentiellt förstöra inneboende kopplingar i hjärnan och en långsam samplingskapacitet. En relativt nyare teknik, mikroelektroden array (MEA), har många fördelar för att mäta specifika neurotransmittor förändringar inom diskreta hjärnregioner när de uppstår, vilket leder till en rumsligt och tidsmässigt exakt tillvägagångssätt. Dessutom är minimalt invasiv med användning MEA, vilket möjliggör mätning av signalsubstans förändringar in vivo. I vårt laboratorium, vi hahar varit särskilt intresserade av förändringar i neurotransmittorn glutamat, i samband med Alzheimers sjukdom patologi. Som sådan har den här beskrivna metoden använts för att bedöma potentiella hippocampus störningar i glutamat i en transgen musmodell för Alzheimers sjukdom. I korthet använde metod innefattar beläggning av ett multi-site mikroelektrod med ett enzym mycket selektiv för signalsubstansen av intresse och med självrefererande webbplatser för att subtrahera ut bakgrundsbrus och interferenter. Efter plätering och kalibrering, kan MEA konstrueras med en mikropipett och sänks in i hjärnan regionen av intresse med användning av en stereotaktisk anordning. Här, den metod som beskrivs involverar anesthetizing RTG (TauP301L) 4510 möss och med användning av en stereotaxisk anordning för att exakt rikta delregioner (GD, CA1 och CA3) av hippocampus.
Introduction
Mäta neurotransmittor förändringar i hjärnan är ett viktigt verktyg för neuroforskare som studerar sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS) som ofta kännetecknas av signalsubstans dysreglering. Även om mikrodialys i kombination med högtrycksvätskekromatografi (HPLC / EC) har varit den mest använda metoden för att mäta förändringar i extracellulära signalsubstans nivåerna 1, 2, 3, 4, den spatiala och temporala upplösningen av mikrodialyssonder kan inte vara perfekt för neurotransmittorer , såsom glutamat, som är tätt regleras i det extracellulära utrymmet 5, 6. På grund av de senaste framstegen inom genetik och bildbehandling finns ytterligare metoder som kan användas för att kartlägga glutamat in vivo. Med användning av genetiskt kodade glutamat fluorescerande reportrar (iGluSnFR) end två-photon imaging, forskare har möjlighet att visualisera glutamatfrisättning från neuroner och astrocyter både in vitro och in vivo 7, 8, 9. Noterbart är, ger detta för inspelning från en större synfält och inte störa de inneboende kopplingar i hjärnan. Även om dessa nya optiska teknik möjliggör visualisering av glutamat kinetik och mätning av sensoriska framkallade svar och nervaktivitet, de saknar förmågan att kvantifiera mängden glutamat i det extracellulära utrymmet i diskreta hjärnregioner.
En alternativ metod är den enzymbundna mikroelektrod array (MEA) som selektivt kan mäta extracellulära neurotransmittornivåer, såsom glutamat, genom användningen av en själv refererade schema inspelning. MEA Tekniken har använts för att studera förändringar i extracellulärt glutamat efter traumatisk hjärnskadaskada 10, 11, 12, åldrande 13, 14, stress 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimers sjukdom 19, 20, och injektion av en viral härma 21 och representerar en förbättring jämfört med de rumsliga och tidsmässiga begränsningar som finns inom mikrodialys. Medan mikrodialys begränsar möjligheten att mäta nära synapsen 22, 23, MEA har en hög rumslig upplösning som möjliggör selektiva åtgärder av extracellulärt glutamat spillover nära synapser 24, 25. Andra, den låga tidsupplösning av mikrodialys (1 - 20 min) begränsar möjligheten att undersökasnabba dynamik glutamatfrisättning och clearance som uppträder i millisekund till andra området 26. Eftersom skillnader i frisättning eller clearance av glutamat kanske inte är uppenbar i åtgärder av toniska, vila glutamatnivåer, kan det vara väsentligt att glutamatfrisättning och clearance mätas direkt. MEA medge sådana åtgärder beroende på deras höga tidsupplösning (2 Hz) och låg detektionsgräns (<1 | iM). Tredje, MEA möjliggöra granskning av subregionala variationer i signalsubstanser inom en särskild hjärnregion, såsom råtta eller mus hippocampus. Exempelvis med användning av MEA kan vi separat rikta dentate gyrus (DG), cornu Ammonis 3 (CA3) och cornu Ammonis 1 (CA1) av hippocampus, vilka är förbundna via en trisynaptic krets 27, för att undersöka subregionala skillnader i extracellulärt glutamat. På grund av storleken av mikrodialyssonder (1 - 4 mm längd) och den skada som orsakas av implantationen 28 </ sup>, 29, subregionala skillnader är svåra att hantera. Dessutom endast de optiska system tillåter stimulering genom externa stimuli, såsom en whisker stimulering eller ljus flimmer, som inte tillåter subregionala stimulering 7. En slutlig fördel med MEA jämfört med andra metoder är förmågan att studera dessa delområden in vivo utan att störa deras yttre och inre anslutningar.
Här beskriver vi hur ett registreringssystem (t.ex. FAST16mkIII) i kombination med MEA, som består av ett keramiskt baserad multisite mikroelektrod, kan differentiellt beläggas på inspelningsplatser för att möjliggöra interfererande medel som skall detekteras och avlägsnas från analyten signalen. Vi visar också dessa matriser kan användas för amperometri baserade studier av in vivo-glutamat reglering inom GD, CA3 och CA1 hippocampusunderregioner av sövda RTG (TauP301L) 4510 möss, en vanligen använd mOuse modell av Alzheimers sjukdom. Dessutom ger vi bekräftelse på känsligheten hos MEA-systemet till de snabba dynamiken i glutamatfrisättning och clearance genom behandling av möss med riluzole, till ett läkemedel visat in vitro minskar glutamatfrisättning och öka glutamatupptaget 30, 31, 32, 33, och demonstrera dessa respektive förändringar i vivo i TauP301L musmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beläggning av mikroelektrod Array med Enzymer eller matrisskikt
- Framställning av proteinmatrislösningen
- Väg upp 10 mg bovint serumalbumin (BSA) och överför till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägga 985 mikroliter av DI-vatten till mikrocentrifugrör innehållande BSA. Blanda lösningen genom manuell omrörning (åter pipettering med användning av 1000 mikroliter pipett ~ 3 gånger, tills BSA är upplöst).
OBS: Använd inte vortex att blanda lösningen eftersom det kan införa luft i lösningen. Också, ställa pipetten till en volym <1000 | il (t.ex. 700 mikroliter) för att undvika att införa luftbubblor. Lösningen kan placeras i en mikro om det behövs. - När BSA-lösningen är upplöst, tillsätt 5 mikroliter av 25% -ig glutaraldehydlösning. Blanda lösningen genom att vända det slutna röret 3 - 5 gånger. Den resulterande lösningen är 1% BSA med 0,125% glutaraldehyd.
- Upphäva proteinmatrisen solution till 5 min. Lösningen kommer att visas ljusgul färg.
- Framställning av den önskade enzymlösning (t ex glutamatoxidas)
- Förbereda glutamatoxidaslösningen genom tillsats filtrerades DI vatten till det lyofiliserade, renade enzymet (t ex 50 mikroliter avjoniserat vatten sattes till 25 enheter av glutamatoxidas för att ge 0,5 U / ul).
OBS: Alikvot stamlösning (t ex en mikroliter) och lagra alikvoter i lämpligt dimensionerade behållare (t ex 500 | il mikrocentrifugrör) vid -20 ° C. Portioner kan lagras i upp till 6 månader under dessa förhållanden. - Lägg 4 mikroliter av BSA / glutaraldehyd lösning på mikrocentrifug alikvoterades rör innehållande glutamatoxidas. Blanda lösningen genom manuell omrörning (re-pipettering med en 10 mikroliter pipett. Pipetten bör vara inställd på volym <5 | il). Den resulterande lösningen är 1% BSA, 0,125% glutaraldehyd och 0,1 U / | il glutamatoxidas.Använd lösningen för beläggning omedelbart.
Notera: Glutamat oxidasbeläggningslösningen kan endast användas inom 15 min. Även om flera MEA kan beläggas med en beredd lösning, rekommenderas att inte överskrida den användbara tidsfönstret för glutamatoxidas. Antalet elektroder som kan beläggas inom 15 min varierar. I allmänhet, kan fyra till sex elektroder beläggas på en gång.
- Förbereda glutamatoxidaslösningen genom tillsats filtrerades DI vatten till det lyofiliserade, renade enzymet (t ex 50 mikroliter avjoniserat vatten sattes till 25 enheter av glutamatoxidas för att ge 0,5 U / ul).
- Beläggning av MEA
- Typiskt, täcka ett par registreringsställe (n) på en MEA med det önskade enzymet (glutamatoxidas) och ett annat par av registreringsställe (n) ( 'portvakt' ställe (n)) är belagd med det inaktiva proteinmatris.
- Använda trubbig spets Hamilton mikrosprutor (t.ex. 10 mikroliter) för att belägga MEA med L-glutamatoxidas eller inaktivt protein matrislösning (BSA + glutaraldehyd). De förfaranden som används för enzym eller inaktiva proteinmatrisbeläggningar är desamma.
- Rengör sprutorna före och efter användning (3 sköljningar medDI-vatten, 3 sköljningar med metanol, 5 sköljningar med Dl-vatten).
NOT: Dedicated sprutor används för att applicera beläggningar av enzym (glutamatoxidas) eller protein-matris. Använd inte samma spruta för en annan lösning. Det rekommenderas att utföra protein-matrisbeläggningar före enzym beläggningar. - Utarbeta glutamatoxidas eller proteinmatris med användning av en 10 mikroliter Hamilton spruta. Tryck försiktigt kolven för att dispensera en liten sträng av lösning vid sprutspetsen (visualiserad med användning av ett dissektionsmikroskop).
- Med användning av dissekera mikroskop för att rikta MEA inspelningsställen, applicera lösningen till de lämpliga inspelningsställen genom att kort bringa inspelningsplatser med lösningen droppe / pärla, som representerar ett skikt. Tre skikt är tillräckligt för både protein-matrisen och enzymet beläggningen. Tjocka skikt kan minska känsligheten hos MEA.
- Höj lösningen droppen rakt upp och bort inspelningar platserna (dvs Syringe tips bör inte skrapa över MEA yta).
- Ställa in en timer för en min. Detta är den minsta tidskrav mellan beläggningstillämpningar till inspelningsställe (n). Medge enzymbelagda MEA härda vid 4 ° C under 5-7 dagar.
- Registrera antalet skikt appliceras, hur lång tid det tog att tillämpa beläggningar, elektrod nummer och ett namn och datum i ett laboratorium anteckningsbok.
2. Elektroplätering med m-fenylendiamin för förbättrad selektivitet
- Framställning m-fenylendiamin-dihydroklorid (MPD) lösning
OBS: Plate uteslutandet skiktet, MPD, för att förhindra oxidationen av dopamin och andra stora, interferentkoncentration molekyler (t.ex. askorbinsyra), vilket förbättrar selektiviteten av sensorn för glutamat / H 2 O 2 över andra potentiellt-interferentkoncentration molekyler.- Mäta 50 ml 0,05 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en mätkolv och överföra 50 ml 0,05M PBS till en större (150 ml) Erlenmeyerkolv.
- Med hjälp av slangen ansluten till en kvävetank (t ex med användning av slangen ansluten en tryck ejektor), fästa en pipettspets (t.ex. P200 spets) till den öppna änden av slangen. Placera slangen med den fastsatta pipettspetsen i PBS-lösning och täcka lösningen löst med parafilm. Slå på kväve och försiktigt bubbla lösning för 20 min.
- Väg 0,045 g av MPD.
Varning: MPD är en potentiellt cancerframkallande ämne. Vägning av MPD bör utföras med användning av en skala som finns i ett dragskåp. Använd handskar och mask när du använder MPD. Se till att motorhuven är funktionell och att bågen dras till lämplig arbetsnivå. Omedelbart rena ytor som kan ha förorenats med MPD för att undvika permanent färgning. - Efter bubblande överföra all MPD till de-gasade PBS-lösning. Täck kolven öppning med parafilm och försiktigt virvla runt lösningen för upplösning MPD i lösning. Undvik aggressive blandning eller användning av en virvel eftersom det kan introducera gaser i lösningen.
- Överför lösningen till en 50-ml bägare. En omrörare är inte nödvändigt.
- Elektroplätering av elektroden
- Erhålla en referenselektrod. Använd referenselektroder tillägnad MPD plätering endast. Använda en annan referenselektrod för kalibreringsprocedurer.
- Positionera plast armen av referenselektrodhållaren över bägaren. Kontrollera om det finns luftbubblor i glaset referenselektroden (kanske inte kan se). flick försiktigt den distala änden av referenselektroden för att avlägsna eventuella luftbubblor vid spetsen.
- Placera referenselektroden genom öppningen i plastarmen och lägre i bägaren innehållande PBS. Se till att referenselektroden inte kommer i kontakt med botten av bägaren.
- Ansluta referenselektroden till huvudsteg (t.ex. 2 pA / mV) och anslut (t.ex. DIP-kontakt) MEA att vara mpd plattad till huvudsteg.
- Sänka MEA i bägaren lösningen så att endast MEA spetsen är nedsänkt i lösningen. Doppa inte MEA tips i flytande utanför den svarta 'bubblan' (den svarta isoleringen belägen ovanför MEA tips). Om du gör det kan skada MEA.
- Köra en 'test' kalibrering för att kontrollera funktionaliteten hos elektrodkanaler och anslutningen till huvudsteg.
OBS: Även om maskinvaruinställningar bör återspegla den utrustning som används, uppgifter med anknytning till analyt / interferens typ och koncentrationen behöver inte skrivas in för 'test' kalibrering. Omkodningen läge bör vara 'amperometri' och 'V-tillämpas' bör vara -0,7 V. Verifiera typisk inspelning för alla kanaler. - Avbryta genom att välja 'Avbryt' när anslutning av alla inspelningsplatser verifieras. Det är inte nödvändigt att spara kalibreringsdata.
- Välj "Elektroplätering" -ikonen på skrivbordet. Galvanisering Tillol Menu visas. Kontrollera rätt inställningar matas in:
PP amplitud: 0,25
Offset: -0,5
Frekvens: 0,05
Varaktighet (min): 20 - Välj 'paus' för att börja plätering. Den förflutna tiden område bör börja räkna ner.
- Efter avslutad (all tid som förflutit) väljer 'en annan MEA' i dök upp menyn för att börja MPD plätering ytterligare MEA. Byt ut pläterade MEA med en MEA att MPD pläterade och upprepa galvanisering proceduren med galvanisering verktyget.
OBS: Det rekommenderas att använda förberedda MPD lösningen inte mer än två gånger eller inom 1 timme tidsperiod. Bered en färsk lösning för att framställa mer än 2 MEA. - Välj 'exit programvara' för att avsluta galvanisering. Skölj MPD-pläterade elektrodspetsar med DI-vatten (för att undvika en saltrest) och lagra (24 h) före kalibrering.
- Avlägsna referenselektroden från lösningen och skölj med avjoniserat vatten innan de placeras i lämpliga sagring lösning (t.ex. 3 M NaCl). Säkerställa referenselektrodspetsen är nedsänkt i lösningen. Långsamt lägre glasreferenselektrod i lösningen för att undvika att skada glaset.
- Förfoga över MPD-lösning i en lämpligt etiketterad avfallsbehållare farligt.
3. Kalibrera MEA för Glutamat Detektering och Selektivitet (Figur 1) 21
- Förbereda lösningar som krävs för kalibrering.
OBS: Se Tabell 1. - Utföra kalibrering under konstant omröring (magnetisk batteridriven omrörare) vid 37 ° C. Slå på värmedyna eller cirkulerande vattenbad och erhålla en liten omrörarstav. Rör långsamt men tillräckligt snabbt att när ett tillägg görs (nedan), den nya platå nås snabbt.
- Ansluter huvudsteg (2 pA / mV) till inspelningsstyrsystemet och för in MEA spetsen i 40 ml omrörd 0,05 M PBS (använd en 50-ml bägare).
- Anslut referens elektrod. Flick slutet för att säkerställa att det inte finns några luftbubblor.
- Öppna inspelningsprogram och klicka på "Calibration". Se till att inställningarna är korrekta (Kontrollera att indikator platser väljs eftersom detta kan förändras med olika elektroder), välj MEA nummer och tryck på "Start".
- Tillåta 5 - 10 min för ekvilibrering; börja när väl baslinjen har stabiliserats (<0,004 nA / min förändring).
- Välj "Baseline" och tillsätt 500 | il av 20 mM askorbinsyra (interfererande; slutlig [250 uM]) och välj "Interferent" (AA är tänkt som hjärnan omfattande interfererande) när strömmen har nått en ny, stadig platå, om några. Tillåta 0,5-1 min mellan tillsatserna. Om MEA är korrekt galvanis bör observeras nästan ingen förändring.
- Lägga 40 mikroliter av 20 mM L-glutamat (slutlig [20 uM]) och en gång strömmen har nått en ny, stadig platå, markera ett st tillsats "Analyt". Upprepa tre gånger för totalt tre glutamate tillägg.
- Tillsätt 40 mikroliter DA. Välj inte "Analyt"; Välj "Test Substance" - DA får endast vara ett interferens i områden som innehåller DA.
- Tillsätt 40 mikroliter peroxid. Välj inte "Analyt"; Välj "Test Substance".
- Klicka på "Stop" knappen en gång kalibreringen är klar.
- För att bestämma funktionaliteten av MEA, klicka på fliken beräkning och spela följande parametrar i ett labb anteckningsbok.
- För MEA konstruktion (3000 | j, m 2) som används i dessa kalibreringar, använda en MEA med en lutning på ≥ 0,004 nA / | iM men lägre sluttningarna kan användas för vissa experiment. Om det finns mindre än en skillnad i lutning mellan enzymbelagda och obelagda platser 10%, sedan använda dessa MEA för framkallad frisättning endast eller ren / kassera MEA.
- Använda en detektionsgräns (LOD) ≤ 1,5 pM. Om LOD är större än 1,5 pm, sedan använda dessa MEA för framkallade release och upptag endast. Använd inte dessa elektroder för inspelning tonic nivåer.
- Använda en selektivitet för den önskade analyten (dvs glutamat) över interfererande av> 20 godtyckliga enheter. Om selektivitet är mindre än 20, då ren / kassera MEA.
- Använda en linearitet (R 2) av kalibreringskurvan för ≥ 0,90. Om linjäritet är mindre än 0,90, då ren eller kasta MEA.
- Spara filen med # av MEA, datum och initialer på den person kalibrerings.
4. Sätt ihop Mikropipett
OBS: Mikropipetter (kapillär glas) bör ha en spets med en inre diameter på 10 - 15 um.
- Placera mikropipett centralt bland alla fyra platinainspelningsställen och montera 50-100 um ovanför MEA med användning av klibbiga vax och modellera.
- Att ladda mikropipett, använd en 1 ml spruta fylld med glutamat eller KCl-lösning, en 0,22-um steril spruta filter, och en 97 mm long, 28-gauge pipett fyllmedel, återfyllning mikropipetten. Det vill säga, in nålen på toppen av mikropipett och fyll på botten av mikropipetten (slutet mot MEA), vilket gör att det inte finns några bubblor.
- Fäst mikropipett till tryckutstötningssystemet till 2 - 20 psi under ca 1 s.
5. Plate Miniature Reference elektrod för in vivo
- Förbereda pläteringslösningen (50 g NaCl / 90 ml 1 M HCl i en 100 ml bägare (pläteringsbad)) och skär badelektroden (~ 10 cm längd av platina (Pt) tråd (~ 0,02" diameter)).
- Klippa en 10 - 15 cm lång bit av teflonbelagd silvertråd (0,008" nakna) och använda ett rakblad för att skrapa av ~ 1 cm av teflonbeläggning från varje ände av änden av silvertråd.
- Löda en guldstift på en ände och placera ena änden av exponerad silvertråd in i pläteringsbadet.
- Med användning av en DC-adapter (använder endast DC-adapter med en utgång på ~ 9 -. 15 VDC max),klämma den "röda" (+) ledningen till den preparerade silvertråd (referenselektrod) på guldstiftsidan. Klämma "svart" (-) kabeln till Pt bad katod.
- Anslut DC-adaptern. Leta efter rätt pläteringsprocessen - bubblor ska visas på badet elektroden; referenselektroden vänder en silver / grå färg.
VARNING: Slå inte ledningarna [Black (-) vs Röd (+)] - pläteringsbadet kommer att förstöras om detta inträffar och färsk pläteringslösning behöver göras. En dålig lösning blir gul färg: ANVÄND INTE!
OBS: plätering reaktionen äger 2-5 min i allmänhet: Ag 0 + Cl - → AgCl + e - - Testa referenselektroden.
- Ställ en multimeter till 100 - mV DC inställningen 200.
- Placera ett riktmärke (dvs en tidigare testats elektrod känt för att fungera) referenselektrod i 3 M NaCl och test mot den nyligen pläterade referenselektroden.
OBS: Om ossing en ny referenselektrod, dränk den i 3 M NaCl före användning (12 h rekommenderas). - Placera den "röda" (+) ledning på guldstift referenselektroden som skall testas. Placera "svart" (-) ledningen på benchmark elektrod. Ett acceptabelt avläsningsområde är ± 10 mV. 0 mV är perfekt över 2 referenselektroder.
6. General Animal Kirurgi för MEA Recordings
- Beredning för kirurgi
- Placera kirurgi i desinfektionsmedel kvällen innan.
- Ta verktygen från desinfektionsmedel och skölj noga och placera verktygen på en steril kirurgi pad. Erhålla en värmedyna.
- Kalibrera två elektroder och fäst mikropipett som beskrivits i försök 3 och 4.
- Göra referenselektroden som beskrivs i Avsnitt 5.
- Gör 200 | iM glutamat och 70 mM KCl. Se Tabell 1.
- Skaffa djuret och spela in sin vikt på kirurgi ark.
- Förbered anestesi och slå på värmedyna.
- Utför MEA kirurgi
- Med användning av isofluran (4% flöde i syre), söva djuret i en induktionskammare tills andningsfrekvensen har väsentligt minskat och djuret svarar inte på tå eller svans nypa. Rekord andningsfrekvens och kroppstemperatur var 15 min.
- Placera djuret i stereotaxic enheten med örat barer att stabilisera huvudet. Se till att djuret är säker och huvudet inte rör sig. Sänka isofluran flödet till 1,5-3% i syre. Se till att värmedynan är korrekt placerad under djuret och inställd på 37 ° C för att ge extra värme. Underlåtenhet att ge extra värme kan resultera i djupgående hypotermi och för tidig död för djuret.
- Applicera ögonsalva med en steril bomulls applikator och registrera andningsfrekvens ochkroppstemperatur. Med hjälp av en batteridriven trimmer, raka hjässan. Använd de små kirurgiska sax för att ta bort pälsen nära öronen.
- Vid denna punkt, sätta på de sterila kirurgi handskar. Applicera jod och sedan alkohol (tre gånger) till hårbotten.
- Med hjälp av en skalpell, gör ett snitt rakt ner i mitten av hårbotten och sprida huden med bull hund klämmor. Ta en steril bomullsspets för att suga upp något blod. Använda väteperoxid för att underlätta uppkomsten av bregma och lambda.
- Kontrollera att huvudet är korrekt placerad genom mätning av D / V och M / L-koordinaterna för bregma och lambda. Koordinat ändringar bör vara noll om huvudet är på en plan yta. Justera huvud- och öron barer som behövs för att säkerställa en plan yta.
- Hitta bregma och noll koordinaterna. Genom att använda de önskade koordinaterna, flyttar till vänster och höger och göra en markering med hjälp av en permanent markör. Med hjälp av en cauterizer / markör, göra en stor fyrkant runt märket med tillräckligt med utrymme för att nåönskad region.
- Med hjälp av en steril roterande verktyg, borra runt torget märket. Suga upp någon blod med hjälp av en steril bomulls applikator. Noggrant desinficera borren före varje användning.
- Fäst MEA till huvudsteg och återfyllning pipetten med den första önskade lösningen. Var noga med att lämna en lucka i pipetten utan lösningen så att den lösning som utvisas kan undersökas. Fäst slangen till glas mikropipett.
- Slå på kvävetanken och trycket ejektor (psi = 5, tid = 0,6 s). Test (tryck manuell röda knappen) för att säkerställa pipetten inte är igensatt innan du börjar.
- Kalibrera mikropipett. Start vid 0 på hårkorset och placera en bit av blå tejp på huvudsteg för att indikera startpunkten. Slå på den digitala läsare och återställa den till noll. Gå ner en mm (DV) och räkna antalet fästingar lösningen har flyttat på hårkorset. 10 fästingar bör motsvara en mm (1 mm = 250 nL), så ett tick = 25 nL.
- Placera referenselektroden i enavlägsen plats från MEA sådan att den fortfarande är i vätskekontakt med hjärnan för att fullborda kretsen.
- Hitta bregma med MEA bifogas och noll den digitala läsare. Flytta MEA till de önskade koordinaterna. Långsamt sänka MEA tills spetsen vidrör hjärnan. Nollställ DV samordna och långsamt sänka MEA in i hjärnan.
- På inspelningsprogrammet, klicka på den önskade kalibrerade elektroden och klicka sedan på "Genomför experiment." Systemet kommer då att börja spela in tonic nivåer för analyten av intresse medan djuret bedövas.
- Zooma till en axel som kommer att bidra till att observera baslinjen och låta elektroden till baslinjen för 20-45 min.
- Efter det att baslinjen är stabil, inställa trycket ejektorn till .6 s och 5 psi och tryck på den röda knappen på tryck ejektorn för att mata ut. Registrera den tid och tryck samt volym / fästingar flyttas på injektionsarket (Figur 2). Gör anteckningar som krävs (dvs.större toppar, utspädningseffekter, tilltäppta pipett, bullriga baslinje / o-scope).
- För glutamat injektioner, vänta 3-5 minuter mellan injektionerna. För KCI injektioner vänta 1-2 min mellan injektionerna. Injicera med användning av samma tryck och tid minst 3 gånger. Ändra tid och upprepa. Försök att inte ändra trycket inte mikropipetten är igensatt.
- Om mikropipett är igensatt, ökar trycket upp till 30 psi.
- Spela in från de önskade hjärnregioner, upprepande på båda sidor av hjärnan med användning av olika lösningar. Spela in en baslinje i varje ny region i 20 min.
- Ta MEA med mikropipett bifogas, skölj med avjoniserat vatten och dra i PBS över natten tills allt blod är borta.
- Euthanize djuret och spara hjärnan i en i förväg märkt rör och förvara i -80 ° C frys eller behålla en sida för fixering. Att avliva djuret, överdosering med isofluran (inandning). Utför halshuggning med kirurgiska saxar och dissekera ut de önskade regionerna.
7. Rengöring Coated MEA efter användning
- Rengör inte MEA om den inte används. Om det finns ludd eller damm på ytan, ren med metanol och låt torka i 24 timmar innan beläggning.
- Slå på vattenbadet (80 ° C) och blöt spetsen av MEA för 30 min. Torka försiktigt spetsen av elektroden med en bomullspinne för att ta bort eventuellt skräp som kan finnas kvar på elektrodspetsen. Inte får den svarta "isolering del" av MEA våt.
- Med användning av tre olika sonicators, blöt spetsen av MEA i (1) Citrisolv, ett kommersiellt lösningsmedel och renande ämne (2) isopropyl och (3) avjoniserat vatten i 5 min. Torka försiktigt spetsen av elektroden med bomullspinne för att ta bort eventuellt skräp som kan finnas kvar på elektrodspetsen.
- Undersök tips under ett dissekera mikroskop för att se till att lagren har tagits bort.
8. Analys
- För att analysera data,först exportera önskad experiment genom att dubbelklicka på färdiga experiment och välja "exportera data" från rullgardinsmenyn fil.
- Spara dessa data till önskad fil plats och öppna analysprogrammet. Klicka på "öppna" i analysprogrammet och välj den nyligen sparade filen.
- Ge programmet en stund att ladda upp filen och sedan kontrollera experiment under fliken händelsemarkörer. Under produktionen, kryssa i rutorna för de önskade parametrarna. Till exempel, baslinje, amplitud, topparea (arean under kurvan), T stiger, och T 80.
- Klicka på refresh och sedan analysera för att exportera data till ett kalkylblad (detta kan ta några minuter). Programmet kommer att ge en uppmaning att spara filen på önskad plats. När sparats kan filen redigeras i ett kalkylblad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Även om denna teknik kan användas för att mäta förändringar i glutamaterg signalering i många typer av djurmodeller, såsom traumatisk hjärnskada, åldrande, stress och epilepsi, här visar vi hur MEA tekniken kan användas för att undersöka glutamaterga förändringar i transgen musmodell av humant tauopati 19, 20. RTG (TauP301L) 4510 mus uttrycker P301L mutationen i tau associerad med frontotemporal demens och parkinsonism kopplad till kromosom 17, och används ofta för att studera tau-patologi associerad med Alzheimers sjukdom, neurodegenerativa tauopatier och frontotemporal demens. Vi visar också att glutamaterg signalering kan modifieras genom farmakologisk intervention. Vi behandlade TauP301L möss med riluzole, ett FDA-godkända sjukdomsmodifierande läkemedel för amyotrofisk lateralskleros (ALS) som modulerar glutamaterg signalering genom att stabiliserainaktivera tillstånd av spänningskänsliga natriumkanaler, vilket leder till en minskning av glutamatfrisättning, och en potentiering av glutamatupptaget via en ökning av glutamat transportör uttryck, vilket leder till ökad glutamat clearance 30, 31, 32, 33.
Vi har valt denna dataset för demonstrativa ändamål för fyra skäl. Först visar detta dataset den temporala upplösningen av systemet, vilket framgår av vår förmåga att mäta snabba dynamik gående utsläpp och upptag av glutamat. Dessutom uppvisar denna prekliniska djurmodell förändringar i tonic glutamat, glutamatfrisättning, och glutamat clearance, vilket möjliggör ett exempel på förändringar i varje åtgärd. För det andra, att utnyttja denna dataset, hög rumsupplösning som möjliggör mätning av delregion skillnader i GD, CA3, ennd CA1 av hippocampus demonstreras. För det tredje ger dessa data för att demonstrera hur farmakologisk intervention kan användas för att mildra glutamaterga förändringar som observerats i prekliniska djurmodeller. Slutligen eftersom det prekliniska modellen har förändringar i glutamatfrisättning, behovet av noggrann tolkning av glutamat clearance i närvaro av förändrad glutamatfrisättning kan förklaras.
Efter att ha nått en stabil baslinje, såsom indikeras av <0,004 nA / min förändring av lutningen (10 - 20 min), vi först uppmätta toniska glutamatnivåer (pM) genom att medelvärdesextracellulära glutamatnivåer över 10 s före varje tillämpning av lösningar. Vi observerade ökade toniska glutamatnivåer i CA3 och CA1 regioner av TauP301L möss och riluzol restaurerade toniska glutamatnivåer till den för kontrollerna (Figur 3A). Nästa, KCl var lokalt levererade (via en mikropipett) till var och en av de tre under regioner av en hemisphere varje med 2 - 3 min. Efter 10 reproducerbara signaler, som är indikativ för en intakt glutamat neuronala systemet 34, var resultaten medelvärden för varje grupp och den genomsnittliga amplituden jämförs. Representativa spår (Figur 3B) avslöjade ökad glutamatfrisättning i TauP301L möss efter appliceringen av KCI i alla tre underregioner (endast CA3 visas), en effekt som räddades av riluzole behandling (figur 3C).
MEA flyttades sedan till den motsatta hemisfären och fick nå en stabil baslinje (10 - 20 min) innan exogent glutamat applicerades för att undersöka glutamat clearance (Figur 4). Varierande volymer (mellan 50 - 250 nL) av 200 uM sterilfiltrerad glutamatlösning applicerades in i det extracellulära utrymmet varje med 2 - 3 minuter, och netto arean under kurvan (AUC) användes som ett mått på glutamatupptagning. Denna snabba applicering av glutamat till tHan extracellulära utrymmet tillåter för att imitera av endogen glutamatfrisättning och mätning av glutamat upptag. Eftersom glutamattransport uppvisar Michaelis-Menten-kinetik 35, ett intervall av volymer - är (50 250 nL) av exogent glutamat injicerades för att exponera skillnader i upptag. Att göra det, mottar varje djur 1 - 2 injektioner på 50 nL inkrement inom mellan 50 - 250 nL intervall. Även om man bör alltid bekräfta att den injicerade volymen per grupp per region inte statistiskt olika vid p ≤ 0,05 nivå, det bästa sättet att säkerställa netto AUC är relaterat till upptag, och inte mängden av glutamat appliceras eller diffusion, är att säkerställa att både amplitud (figur 4A) och T upphov (ett mått på diffusion från punktkällan (mikropipett) till MEA i figur 4B) inte skiljer sig 10, 11, 19, 20. denna allows för "topp matchande" amplituderna (Figur 4C) så att skillnader i netto AUC antas bero på skillnader i upptag och inte den applicerade mängden eller diffusion. Peak matchning är särskilt viktigt när djuren har befintliga skillnader i glutamatfrisättning. Eftersom en rad volymer injiceras, variansen för både amplitud och T stiger är ofta stora och lägga till ytterligare djur minskar inte variansen för dessa åtgärder, eftersom de är inneboende i designen. Eftersom amplituden och T upphov lika i de grupper i varje underområde (figur 4A, 4B), antar vi att skillnader i netto AUC (Figur 4C, 4D) beror på skillnader i glutamatupptagning. Riluzole förbättrade glutamat clearance jämfört med kontrollerna i alla tre underregioner (Figur 4D). Slutligen är en MEA med en bifogad mikropipett som används för att lokalt applicera ett färgämne för att bekräfta MEA placering efter hjärnan sektione, Såsom visas i Figur 3D.
Indikerar dessa data att MEA-tekniken är i stånd att mäta neurotransmittorfrisättning i små underregioner av hippocampus 24, 25, till skillnad från tidigare tekniker (t ex mikrodialys), som endast registrerade från stora provområden och ofta skadade neuronala kretsar 28, 29. Dessutom MEA förse oss med hög tidsupplösning för att mäta snabba kinetiken för glutamatfrisättning och clearance 25.
Figur 1: In vitro Kalibrering av ett självrefererande mikroelektrod mäta förändringen i ström (pA) på en glutamatoxidas Site (GluOx; röd) vs. en Sentinel Site (Sänt; blå). Den störande askorbinsyra (AA: 250 | iM) och dopamin (DA: 2 ^ M) förändrade inte strömmen vid antingen glutamatoxidas eller indikatorställen. Tillsats av glutamat (Glu: 20, 40, 60 | iM) gav en stegvis strömökning på glutamatoxidasstället, men ingen förändring på sentinel stället. Väteperoxid (H 2 O 2: 8,8 | iM) gav en ökning i ström på båda platserna. Känslighet, lutning, detektionsgränsen, och R-2-värdena beräknades efter kalibrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. A Prov Elektrokemi Arbetsblad. Detta arbetsblad innehåller kolumner för tidpunkten för injektion eller injektion nummer (TID / TTL), hjärn koordinater (AP, ml, DV),den mängd tryck som anbringas (kväve), varvid längden av tryck (tid), och den injicerade volymen av tryck ejektor. Eventuella anteckningar, såsom udda signaler eller igensättning av mikropipett bör registreras i antecknings kolumnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Extracellulär Tonic och kaliumklorid (KCl) -evoked Frisättning av glutamat i GD, CA3, och CA1-regionerna av hippocampus. (A) I CA3 och CA1-regionerna av hippocampus, toniska glutamatnivåer ökade signifikant i vehikelbehandlade TauP301L möss (Veh-TauP301L), en effekt dämpas av riluzol behandling. (B) Baseline-matchade representativa inspelningar av KCl-framkallad glutamatfrisättning i CA3 visade r iluzole behandling (Ril-TauP301L) dämpade signifikant ökning av amplituden av glutamatfrisättning observeras i Veh-TauP301L möss. Lokal applicering av KCl (↑) gav en robust ökning av extracellulärt glutamat som snabbt återvände till toniska nivåer. (C) Den ökade signifikant KCl-framkallad glutamatfrisättning observeras i Veh-TauP301L mössen i GD, CA3, och CA1 efter lokal applicering av KCI försvagades med riluzole behandling. (D) kresylviolett-färgade 20 ^ m sektion av hippocampus visar lokaliseringen av MEA spår i CA3 och CA1 (Medelvärde ± SEM; ** p <0,01 Veh-Control vs. Veh-TauP301L, # p <0,05 Ril-tau P301L vs. Veh-TauP301L, ## p <0,01 Ril-TauP301L vs. Veh-TauP301L, n = 14-19 / grupp). Denna siffra återges med tillstånd från John Wiley and Sons 19, 20.rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Glutamatupptagning Efter Exogena Glutamat Tillämpning i GD, CA3, och CA1-regionerna av hippocampus. (A) Amplituden hos den lokalt appliceras glutamat signalen var likartad bland grupper i varje region. (B) T stiger, en indikator av glutamat diffusion från mikropipetten, var lika i de grupper i varje region. (C) Representativa glutamat signaler i CA3 från lokal applicering av glutamat i Veh-Controls, Veh-TauP301L, och Ril-TauP301L möss. (D) Riluzole behandling reducerade signifikanta ökningar i netto arean under kurvan (AUC) som observeras i Veh-TauP301L möss i alla 3 regioner av hippocampus, vilket indikerar förbättrad glutamatupptaget i riluzol behandlade TauP301L möss (Medelvärde ± SEM; * p <0,05 Veh-Control vs. Veh-TauP301L, ** p <0,01 Veh-Control vs. Veh-TauP301L, # p <0,05 Ril-TauP301L vs. Veh- TauP301L, ## p <0,01 Ril-TauP301L vs. Veh-TauP301L, n = 13-15 / grupp). Denna siffra trycktes med tillstånd från John Wiley and Sons 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 0,05 M PBS | 2 L avjoniserat vatten: |
| Förvaras i glasbägare lindade med aluminiumfolie. Ta pH till 7,4 med KOH vid behov. | NaH 2 PO 4 • H2O: 2,8 g Na 2 HPO 4: 11,34 g Natriumklorid: 11,68 g |
| 20 mM Askorbinsyra 50 ml DI vatten: | |
| Gör färsk dagligen. | Askorbinsyra: 0,18 g |
| 20 mM L-glutamat | 50 ml DI vatten: |
| Gör ny varje vecka. | L-glutamat-mononatriumsalt-hydrat: 0,15 g |
| 2 mM Dopamin | Dopaminhydroklorid: 0,038 g |
| Gör ny månad. | 0,1 M Perklorsyra: 10 mL Bringa volymen till 100 ml med avjoniserat vatten |
| 8,8 mM Väteperoxid | 50 ml DI vatten: |
| Gör ny varje vecka. | Väteperoxid: 500 mikroliter |
| 70 mM kaliumklorid | 100 ml DI vatten: |
| Göra färsk dagen för experimentet. | Kaliumklorid: 0,08 g Natriumklorid: 0,07 g Kalciumklorid: 0,004 g |
| 200 μ; M Glutamat | 20 mM glutamat: 100 mikroliter |
| Göra färsk dagen för experimentet. | Steril saltlösning: 10 ml |
Tabell 1: Kalibreringslösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MEA Tekniken möjliggör mätning av snabb kinetik av neurotransmittorfrisättning och upptag in vitro och in vivo. Därför ger tekniken en mängd olika datautgång inklusive tonic signalsubstans nivåer, framkallad neurotransmittorfrisättning och signalsubstans clearance. Eftersom användningen av MEA är en relativt komplicerad procedur, det finns många faktorer som kan behöva optimeras för framgångsrik användning. Till exempel, under kalibrering, kan man notera att det inte finns några signalvågformer (oscilloskop skärm) eller som svar på stimulering är minimala, eller frånvarande. Sannolikt på grund av ett fel i systemet, starta om registreringssystemet, eller dator, kan lösa problemet. Dessutom kan problemet finnas ett samband fel. Innan kalibrering är det relevant att dubbelkolla att elektrodanslutningarna MEA och referens är korrekt anslutna. Bytet av DIP-uttaget på huvudsteg kan lösa MEA anslutningsproblem.Om MEA inte är helt i lösning eller en dåligt underhållen referenselektrod används, kan dessa också störa inspelningen under kalibreringen. Saktade signalsvar under kalibrering är ett annat vanligt problem, som kan resultera från en tjockare än vad som behövs BSA / glutaraldehyd blandning, eller en långsamt snurrande omrörarstav. I händelse av att störande ger en signal under kalibreringen, är det möjligt att det fanns ett fel i elektroplätering (t.ex. inte elektroplätera tillräckligt länge) MPD uteslutning skiktet. I ett sådant fall, upprepa galvanisering förfarande är nödvändigt.
Under operationen kan en bedövningsnivå inte är tillräcklig för alla möss; vissa möss kan kräva högre nivåer av anestesi att "gå under" och några möss kan kräva mindre. Det är viktigt att börja på en låg nivå av anestesi och sakta höja den tills musen är under lätt narkos. Djupa anestesi kan testas när musen är i stereotaxic anordningen genom ensvans eller tå nypa. När du väljer koordinaterna för implantering MEA, är det också viktigt att notera och korrigera för eventuell hjärnatrofi som kan förekomma i många neurodegenerativa djurmodeller 36, 37, 38. Dessutom är det absolut nödvändigt under operation att blod inte ansamlas på MEA, eftersom detta kan påverka inspelningsegenskaperna hos MEA och resultera i långsam tidsupplösning eller kraftigt minimeras signalsvar. Om blodproppar runt elektroden, helt enkelt ta bort MEA och skölj med saltlösning.
Under inspelningen är en av de vanligaste problemen som kan uppstå som en bullrig signal. Störningar från andra elektroniska enheter, till exempel hjälp belysning, andra instrument, och borrar är de mestadels sannolikt skyldiga, så det är bäst att undvika ansluta dem till samma elektriska krets och / eller utlopp som inspelningssystemet. Dessutom, om inspelnings system inte jordad på rätt sätt, en kommer att följa svängningar på oscilloskopet av registreringssystemet samt buller som härrör från alla platser, och inte bara inspelningsplatser. Den rekommenderade jord matta under registreringssystemet måste vara ansluten till ett jordat rör för att undvika dessa problem. Om det fastställs att ingen av dessa är de fel, kan felet ligga hos referenselektroden, eller MEA självt. När stöter bullerfrågor, med en ny, oanvänd MEA att kontrollera driften av systemet kan vara ett användbart felsöknings strategi. Om du kopplar eller byta referenselektroden resulterar i liten eller ingen förändring, kan referenselektroden eller halvcell har skadats. Ändra referenselektroden kan vara det enda sättet att lösa problemet. När inspelningen är klar, är en slutlig fördel med MEA förmågan att rengöra och återanvända dem. MEA kan återanvändas ungefär tre gånger så länge som MEA fortsätter att utföra ett adekvat sätt under kalibreringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GG är den enda innehavaren av Quanteon, LLC som gör FAST-16 inspelningssystem som används för glutamat mätningar i denna studie. JEQ är en betald konsult för Quanteon.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of General Medical Sciences (MNR, U54GM104942), NIA (MNR, R15AG045812), Alzheimers Association (MNR, NIRG-12-242.187), WVU fakulteten Research Senate Grant (MNR) och WVU PSCOR Grant (MNR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
