Introduction
Det anslås, at planter producerer over 200.000 forskellige typer af kemiske forbindelser 1. Kun et mindretal af disse forbindelser synes at spille en rolle i planternes primære stofskifte, som brændstoffer vækst og reproduktion; flertallet er såkaldte sekundære metabolitter. På trods af deres navn, sekundære metabolitter er ofte afgørende for planter overlevelse og reproduktion, da de tjener til at tiltrække bestøvere eller forsvare planten mod patogener og planteædere 1.
Glucosinolater er en meget forskelligartet gruppe af sekundære metabolitter, der er blevet undersøgt i over 150 år 2. Til dato har mere end 130 strukturelt forskellige glucosinolater blevet identificeret 3. I store træk kan glucosinolater underinddeles i forskellige klasser baseret på aminosyren hvorfra de syntetiseres. Indolglucosinolater fx syntetiseres ud fra aminosyrentryptophan, hvorimod phenylalanin tilvejebringer grundskelet til syntese af aromatiske glucosinolater 4. Inden klasser, der er en høj grad af strukturel diversitet, som er tilvejebragt gennem sekventielle kædeforlængelse trin i den biosyntetiske pathways, såsom i klassen af alifatiske glucosinolater, eller ved sidekædemodifikationer (f.eks hydroxylering) 4, 5. En glucosinolat plantearter kan indeholde op til 37 forskellige glucosinolater tilhører forskellige strukturelle klasse 6. Selvom plantearter har typiske glucosinolat profiler, er intraspecifikke variation for de typer af glucosinolater ofte findes blandt individer og populationer 6, 7. Intakte glucosinolater gemmes i vakuoler af planteceller og kan findes i enhver overjordiske eller belowground organ 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Ved celle brud (fx ved herbivory), er glucosinolater frigivet og blandes med enzymet myrosinase, modregning en sennepsolie bombe 10. På grund af aktiviteten af myrosinase, og afhængigt af strukturen af glucosinolat, reaktionsbetingelserne, og tilstedeværelsen af modificerende enzymer, er forskellige bidende, giftige eller skadelige forbindelser dannes, såsom nitriler og (iso) thiocyanater 11. Reaktionsprodukterne har høje biologiske aktiviteter; for eksempel, de tjener som afskrækningsmidler af generalist insekter planteædere 12. Arveligheden og biosyntetiske veje for glucosinolater er godt undersøgt, hovedsagelig på grund af deres betydning for planteædere og patogen modstand, deres værdi som smagskomponenter i sennep og kål, og deres negative (progoitrin) og positive (glucoraphanin) virkninger på menneskers sundhed 5, 13, 14.
På grund af den store interesse for glucosinolater som biologisk aktive forbindelser, udvinding og detektionsmetoder baseret på omvendt fase højtryks-væskekromatografi (HPLC) udstyret med ultraviolet (UV) eller fotodiodearray (PDA) detektorer er blevet almindeligt anvendt siden 1980'erne 15 . Baseret på denne metode, De Europæiske Fællesskaber udsendte en standardprotokol, der blev testet og valideret i flere laboratorier til analyse af glucosinolater i oliefrø (Brassica napus, raps-, Canola 16). Andre tilføjet til denne metode (fx ved at bestemme yderligere reaktionsfaktorer for glucosinolater, der ikke er til stede i raps) 17. Trods den øgede tilgængelighed af væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) platforme og high-throughput protokoller for glucosinolat analyse 18
Protocol
1. Udarbejdelse af løsninger nødvendige for glucosinolat Extraction
- Forbered 500 ml 70% methanol (MeOH) i vand (ultrarent) i en glasflaske. For 100 prøver og 5 standarder, 420 ml 70% er nødvendig MeOH.
- Forbered 20 mM natriumacetat (NaOAc) (pH = 5,5) ved tilsætning af 0,82 g NaOAc eller 1,36 g NaOAc x 3 H2O i 500 ml vand; justere pH med hydrogenchlorid (HCl). Opbevar NaOAc i køleskab. For er behov 100 prøver og 5 standarder, 370 ml 20 mM NaOAc (pH = 5,5) i vand.
- Til fremstilling kolonnen materiale, blandes 10 g tværbundet dextran gel (type G-25) med 125 ml ultrarent vand. Opbevar den resulterende blanding i køleskab (4 ° C).
- Fremstilling af sulfatase opløsning
- Opløs 10.000 enheder aryl sulfatase (type H-1 fra vinbjergsnegl) i 30 ml ultrarent vand og tilsæt 30 ml absolut ethanol (EtOH). Bland løsningen godt og overføre det til en 250-ml centrifuge rør eller flere mindre rør, afhængigt af tilgængeligheden.
- Centrifugeres blandingen ved 2.650 xg i 20 minutter ved stuetemperatur (RT). Overfør supernatanten (er) til et bægerglas; tilføje 90 ml EtOH og blande det. Centrifugeres blandingen i en eller flere centrifugeglas ved 1.030 xg i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanterne. Opløs og kombinere disse pellets i alt 25 ml ultrarent vand. Vortex godt, dispensere i 1-ml-rør, og opbevares i en fryser ved -20 ° C; de vil holde i mindst et år.
- Fremstilling af sinigrin referenceopløsningen
- Vejer omkring 9 mg sinigrin monohydrat med 1-ug nøjagtighed (f.eks 8,769 mg). Overfør det til en 10-ml målekolbe og opløse sinigrin monohydrat i 10,0 ml ultrarent vand.
- Beregn molariteten af stamopløsningen og forberede fem sinigrin referencer mellem 50-750 uM ved fortynding af stamopløsningen. For et detaljeret eksempel, se Supplerende File S1 .
- Dispensere forskellige sinigrin henvisninger i 1,5-ml reaktionsrør og fryse dem ved 20 ° C. Medtag en serie på fem sinigrin referencer i hver ekstraktion batch. Brug altid de korrekte molær værdier for øjeblikket anvendes sinigrin referencer, når beregning af koncentrationerne.
2. Forberedelse af Extraction Setup
- Der fremstilles en kolonne rack for Pasteur-pipette søjler (til fremstilling af søjler, se trin 3.1). Mærk rack eller kolonnerne at holde styr på prøven numre (se figur 1).
- Forbered en blok holder det samme antal af mærkede 2-ml mikrocentrifugerør (se trin 3.3 og figur 1)
5 / 55425fig1.jpg "/>
Figur 1: Rack til glucosinolat udsugning. Set forfra (til venstre) og ovenfra (til højre) i en self-made kolonne rack og blokere for glucosinolater udvinding. Højde: 100 mm, afstanden mellem forskudt huller (at holde Pasteur pipette kolonner): 30 mm (x-akse) x 15 mm (y-aksen). Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Forberedelse af Kolonner og Mikrocentrifugerør
- Forbered en kolonne per prøve og fem ekstra kolonner for de fem sinigrin referenceprøver.
- I hvert glaspipette, placere et stykke glasuld ca. 1 cm x 1 cm. Brug et træ eller glas stick at skubbe glasuld ned til det punkt, hvor pipetten indsnævres. Glasulden bør forhindre kolonnen materiale i at løbe ud, men ikke bruger for meget, da det vil bremse eluering af kolonnerne. Bær handsker whda arbejdet med glasuld.
- Placer kolonner i kolonnen rack (se figur 1). Placer kolonnen rack i et laboratorium bakke (affald bakke) for at fange de eluenter der anvendes for de efterfølgende kolonne vaske.
- Skær de første 5 mm af spidsen af en plast 1-ml pipettespids og pipette 0,5 ml af den forberedte kolonne materiale (G-25 gel i vand, se trin 1.3) i hver kolonne. Ryst flasken med søjlematerialet godt før pipettering. Kassér utætte søjler (G-25 materiale løbe ud gennem glasuld lag), og erstatte med nye.
- Efter pipettering kolonnen materiale i kolonnerne, tilsættes 1 ml af ultrarent vand til at skylle ned materialet.
- Forbered en 2-ml reaktion rør per prøve og fem rør til de fem sinigrin referenceprøver; mærke dem. Brug en dissekere nål til at lave huller i hætterne til senere frysetørring og placere de fremstillede rør ind i røret blokeret nøjagtig samme mønster somsøjler (trin 2.2, se figur 1).
4. Ekstraktion af Glucosinolater
- Afvej frysetørres og fint formalet plantemateriale (sædvanligvis fra 50,0 til 100,0 mg tørvægt, de endelige glucosinolat koncentrationer i ekstrakten bør være i området fra referencekurven) til nærmeste 0,1 mg i 2-ml, mærket, runde Bunden reaktionsrør. Tilføj to små metalkugler (3 mm i diameter) som kogende midler til hvert rør.
BEMÆRK: Protokollen kan også anvendes på friske, flash-frosne materialer, der er blevet jorden under flydende nitrogen og holdes nedfrosne indtil ekstraktion. Øge mængden af materiale vejes til ekstraktion og procentdelen af MeOH i ekstraktionsvæsken til 85% for at kompensere for fortynding af vandet i materialerne 19. - Pipetter 1 ml 70% MeOH i hvert rør og vortex kortvarigt. Luk rørene og forsegle dem med sikkerhed hætter før du placerer dem så hurtigt som muligt ind i en varm water bad (90-92 ° C) i et par minutter (~ 5 min), indtil 70% MeOH bare koger. Forsigtig: Brug beskyttelsesbriller under dette trin!
- Placer prøverørene i ultralydsbad i 15 min. I mellemtiden tage suifatase og de fem sinigrin referenceprøver ud af fryseren at tø dem ved stuetemperatur.
- Efter ultra-sonikering, centrifugeres prøveglassene ved 2.700 xg i en bordcentrifuge i 10 minutter ved stuetemperatur; en pellet bør udgøre i hvert rør. Føj supernatanterne til de mærkede søjler og pipette de fem referenceprøver på separate kolonner.
- Mens pipettering supernatanterne, holde spidsen godt over pelleten at undgå pipettering plantematerialer. Bemærk, at når der anvendes tørrede prøver, vil supernatanten udgøre under 1,0 ml.
- Tilsæt 1 ml 70% MeOH til de resterende pellets i prøverørene og vortex rørene, før de bringes i ultralydsbad i 15 min. Centrifuger rørene igen, som i trin 4.4, og tilsæt supernalenter til de respektive kolonner; på grund af egenskaberne af søjlematerialet, vil den negativt ladede sulfat- gruppe af glucosinolater specifikt tilbageholdt på kolonnen.
- Vask søjlerne med ekstrakterne i tre sekventielle trin.
- Pipetter 2 x 1 ml 70% MeOH på hver søjle. Vent på, at kolonnen køre tør, før du tilføjer de næste 1 ml; dette vil fjerne flere upolære forbindelser fra ekstrakterne (f.eks klorofyl).
- Skylle MeOH ved tilsætning af 1 ml ultrarent vand til hver kolonne.
- Pipetter 2 x 1 ml 20 mM NaOAc buffer til hver kolonne for at skabe de optimale betingelser for sulfatase reaktionen.
- Tag rack med kolonnerne ud af bakken affald og tørre frem til stativet med en serviet. Placer rack over blokken med hætteglas og mærkede rør. Sørge for, at hver kolonne tip er i den tilsvarende, mærkede, 2-ml rør (se figur 1).
- Tilføj 20 ul sulfatase solutipå kolonnerne. Sikre, at sulfatase når overfladen af kolonnen materiale. Pipetter 50 pi NaOAc buffer på hver kolonne for at skylle ned sulfatase. Dæk kolonner med aluminiumsfolie og lad stå natten over.
BEMÆRK: På grund aktiviteter sulfatase, sulfatgruppen vil blive fjernet, hvilket frigiver de desulfoglucosinolates fra søjlen, således at de kan elueres med vand. For en nærmere beskrivelse, se Crocoll et al. 19. - Den næste dag elueres desulfoglucosinolates ved pipettering 2 x 0,75 ml ultrarent vand på hver søjle. Når alle kolonner har kørt tør, løft kolonnen rack og fjerne det fra reaktionsrørene.
- Cap rørene (sørg for, at der er huller i hætterne) og fryse dem i flydende nitrogen eller i en -80 ° C fryser i 30 min. Frysetørre prøverne for 12-24 timer (afhængigt af antallet af prøver og kapaciteten af frysetørrer) til fjernelse af alt vand.
<li> Efter frysetørring, genopløses remanensen i en eksakt volumen (sædvanligvis 1,0 ml) af ultrarent vand. Overfør prøverne og de fem sinigrin referencer til mærkede HPLC hætteglas. Opbevar prøverne i køleskab (4 ° C) i op til to uger eller en fryser (-20 ° C) i op til et år, før han analyserer dem med HPLC. - Lad glasset kolonner tørre under kølerhjelmen natten og bortskaffe dem, når tørre. Gendan de metalkugler fra prøven rør, der anvendes i trin 4.5 til genbrug og sætte rørene i bortskaffelse af affald bin den.
5. HPLC Målinger af ekstraherede prøver
- Adskil glucosinolater på en omvendt fase C18 søjle (4,6 x 150 mm, 3 um, 300 Å) med en acetonitril-vand-gradient (se tabel 1) og et flow på 0,75 ml / min og en søjletemperatur på 40 ° C . Udfør detektion og kvantificering ved 229 nm.
- Mål sinigrin referencer på den samme kolonne, men med en tilpasset gradientmetode til at reducere brugen af opløsningsmidler (se tabel 2). Start med at injicere de fem sinigrin referencer, der begynder med referencen med den laveste koncentration. Derefter injicere prøverne, herunder en methanol injektion (blank) efter hver tiende prøve at rense søjlen og for at forhindre overførsel af toppe.
| Tid [min] | Flow [ml / min] | % A Vand | % B ACN |
| 1 | 0.750 | 98 | 2 |
| 35 | 0.750 | 65 | 35 |
| 40 | 0.750 | 98 | 2 |
| Søjletemperatur 40 ° C. | |||
Tabel 1: acetonitril-vand-gradient for glucosinolat separation og analysis på omvendt fase HPLC.
| Tid [min] | Flow [ml / min] | % A Vand | % B ACN |
| 1 | 0.750 | 98 | 2 |
| 10 | 0.750 | 89,3 | 10.7 |
| 11 | 0.750 | 98 | 2 |
| Søjletemperatur 40 ° C. | |||
Tabel 2: Forkortet acetonitril-vand-gradient til kvantificering af de fem sinigrin referencer til kvantificering af glucosinolater.
6. glucosinolater Identifikation og kvantificering
- Identifikation
- Sammenlign UV spektre og opholdstider af toppene i prøverne med kommercielt nyttestand, rene glucosinolatindhold referencer. Se figur 2 for eksempler på UV-spektre fra de forskellige glucosinolatindhold klasser.
- Identificer ukendte glucosinolater med referenceprøver eller på LC-MS 18, 19, hvis det er muligt.
- Identificere ukendte glucosinolater med kernemagnetisk resonans (NMR), hvis det er muligt.
- Sammenlign UV-spektre og retentionstiderne for toppene med dem i figur 2 og tabel 3, databaser eller litteraturhenvisninger.
Figur 2. UV-spektre af de mest almindelige glucosinolatindhold klasser. UV absorptionsspektre (200-350 nm) af seks desulfoglucosinolates (GSL), baseret på løsninger lavet af kommercielt tilgængelige referencestoffer udvundet som beskrevet her, der repræsenterer de mest almindelige strukturelle klasser. Det fælles navn, structural navn (i parentes), og strukturel klasse er givet. (A) sinigrin (2-propenyl GSL), alkenyl; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinyl; (D) glucobrassicin (indol-3-ylmethyl GSL), indol; (E) gluconasturtiin (2-phenylethyl GSL), aromatisk; (F) sinalbin (4-hydroxybenzyl GSL), aromatisk. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Kvantificering
- Integrer området under toppene af de fem sinigrin referencer og prøverne.
- Beregn en kalibreringskurve af de fem målte sinigrin referencer baseret på integrerede område. Brug ligningen af regressionslinjen (se ligning 1) for at beregne den interpolerede værdi af glucosinolater (se ligning 2).
- For at beregne koncentrationen af de forskellige glucosinolater, multipliceres interpoleret beløb (x) med respons (M) for detektion ved 229 nm fra EF (1990) 16, Buchner (1987) 15, eller Brown et al. (1993) 17; de konsensus responsfaktorer for de mest almindeligt fundne desulphoglucosinolates er angivet i tabel 3.
BEMÆRK: Responsfaktorerne kan variere mellem systemer-dette kan være årsagen til, at der er forskellige værdier af forskellige referencer (se Referencer 15-17). Ikke desto mindre er værdierne er for det meste helt tæt og i et lignende område med strukturelle klasser. Efter konventionen, indstille respons faktor uidentificerede glucosinolater til en, selv om ukendte indolglucosinolater med et UV-spektrum ligner glucobrassicin og andre indolglucosinolater (figur 2), vil det være tilrådeligt at bruge 0,25 som en reaktion faktor for at opnået realistisk skøn af koncentrationen (tabel 3). - For at beregne den endelige mængde af glucosinolater (x t) i prøven, tage fortyndingsfaktoren (D), og massen af prøven (w), der anvendes til analysen i betragtning (se ligning 3).
(1) 
(2) 
(3)
y = topareal
m = hældningen af henvisningen 5-punkts regressionskurve
c = skæringspunktet af regressionslinjen med y-aksen
x = mængde af glucosinolater i ekstraktet
x t = koncentration af glucosinolater i planten prøven
D = fortyndingsfaktor
M = responsfaktoren for detektion ved 229 nm fra Buchner (1987) eller Brown et al. (1993)
w = massen af prøven anvendt til ekstraktion
(1) 
(2) 
(3) Representative Results
Denne metode muliggør detektering og adskillelse af almindeligt forekommende desulfoglucosinolates i alle strukturelle klasser (figur 3). Den skadelige 2-hydroxyglucosinolate progoitrin kommer relativt tidligt i kromatogrammet, og er klart adskilt fra den retmæssige glucosinolater glucoraphanin, den eneste methylsulfinylglucosinolate i denne prøve. Sinigrin, gluconapin, og glucobrassicanapin udgør en eluotropic serie af alkenylgrupper glucosinolater med stigende side-kædelængder (C3, C4, og C5, henholdsvis). En lignende logisk serie er synlig for de to methylthioalkenyl glucosinolater, glucoiberverin (C3) og glucoerucin (C4). Toppene af tre indolglucosinolater, glucobrassicin og dets derivater 4-hydroxy- og 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), er også klart adskilt. Det skal bemærkes, at toppene af neoglucobrassicin og glucoerucin samt gluconasturtiin, den eneste aromatiske glucosinolate i denne prøve, er særligt høj i denne Brassica ekstrakt som følge af tilsætning af rod ekstrakter til mix 9.
Figur 3: Kromatogram af en glucosinolat-ekstrakt. Detail (1-32 min) af en HPLC kromatogram som følge af analysen af kombinerede rod og skyde prøver fra Brassica nigra, B. rapa og B. oleracea. Etiketterne peak angiver retentionstiden og forkortelserne af identificerede desulfoglucosinolates (GSL). PRO = progoitrin (2-OH-3-butenyl GSL); Raph = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenyl GSL), GNA = gluconapin (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-methylthiopropyl GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenyl GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmethyl GSL); NAS = gluconasturtiin (2-phenylethyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Klik her for at se en større version af dette tal.
Længere kæde methylsulfinyl glucosinolater, som er almindeligt forekommende i modellen planten Arabidopsis, viser også en eluotropic serie, som set i et rod ekstrakt af guldkarse Austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), og glucoarabin (C9) vises med regelmæssige mellemrum på kromatogrammet (figur 4). Sammen med UV-spektre af toppene, kan en sådan eluotropic logisk serie anvendes til at klassificere, og foreløbigt identificere, ukendte glucosinolater.
Figur 4: Chromatogram (frame 9-30 min) Af desulfoglucosinolates i en guldkarse Austriaca rod ekstrakt. Etiketterne peak angiver retentionstiden og forkortelserne af identificerede desulfoglucosinolates (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmethyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Almindeligt navn | Sidekæde struktur | Rt (min) * | 229 nm | reference# |
| aliphatic glucosinolater | ||||
| Glucocapparin | methyl | 3,5 | 1 | Brun |
| sinigrin | 2-propenyl | 5.5 | 1 | Brown, EF |
| Gluconapin | 3-butenyl | 9.5 | 1.11 | EF |
| Glucobrassicanapin | 4-pentenyl | 13.5 | 1.15 | EF |
| Glucoiberverin | 3-methylthiopropyl | 10.9 | 0,8 | Brun |
| Glucoerucin | 4-methylthiobutyl | 14,0 | 0.9 | Brun |
| Glucoiberin | 3-methylsulfinylpropyl | 3.7 | 1.2 | Brun |
| glucoraphanin | 4-methylsulfinylbutyl | 4.9 | 0.9 | Brun |
| Glucoalyssin | 5-methylsulfinylpentyl | 7.6 | 0.9 | Brun |
| Glucohesperin | 6-methylsulfinylhexyl | 10.5 | 1 | Brun |
| Glucosiberin | 7-methylsulfinylheptyl | 13.5 | 1 | Brun |
| Glucohirsutin | 8-methylsulfinyloctyl | 16.8 | 1.1 | Brun |
| Glucoarabin | 9-methylsulfinylnonyl | 20.5 | 1 | |
| Glucocheirolin | 3-methylsulfonylpropyl | 4.2 | 0.9 | Brun |
| Progoitrin | 2 (R) -OH-3-butenyl | 4,5 | 1,09 | Buchner, EF |
| Gluconapoleiferin | 2-OH-5-pentenyl | 8.3 | 1 | EF |
| indolglucosinolater | ||||
| 4-hydroxyglucobrassicin | 4-hydroxyindol-3-ylmethyl | 11.2 | 0,28 | Buchner, EF |
| glucobrassicin | indol-3-ylmethyl | 15.3 | 0,29 | Buchner, EF |
| 4-Methoxyglucobrassicin | 4-methoxyindol-3-ylmethyl | 18.2 | 0.25 | Buchner, EF |
| Neoglucobrassicin | 1-methoxyindol-3-ylmethyl | 22.5 | 0.2 | Buchner, EF |
| aromatiske glucosinolater | ||||
| Sinalbin | 4-hydroxybenzyl | 8.1 | 0.5 | Buchner |
| Glucosibarin | 2 (R) -OH-2-phenylethyl | 12.1 | se næste | |
| Glucobarbarin | 2 (S) -OH-2-phenylethyl | 12.7 | 0,95 | Buchner |
| Glucotropaeolin | benzyl | 13.8 | 0,95 | Buchner, EF |
| Gluconasturtiin | 2-phenylethyl | 18,0 | 0,95 | Buchner, EF |
| Ukendt - alifatiske / aromatiske ligesom UV-spektret | 1 | EF | ||
| Ukendt - indol ligesom spektrum | 0.25 | EF | ||
| * Omtrentlig retentionstid (Rt) afrundet til nærmeste 0,1 min (± 0,3 min afhængig af søjlen, eluent kvalitet). Retentionstider bestemmes på ThermoFisher / Dionex Ultimate HPLC platforme udstyret med en C 18 søjle (150 x 4,6 mm, 3 mikrometer partikelstørrelse) plus C 18 tabel 1. | ||||
| # Referencer til responsfaktorer: Buchner, R. i Glucosinolater i raps (red JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. & Gershenzon, J. Variation af glucosinolat ophobning mellem forskellige organer og udviklingsmæssige stadier af Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481, doi: 10,1016 / S0031-9422 (02) 00.549-6, (2003); EF. Olieholdige frø - bestemmelse af glucosinolater højtryksvæskekromatografi. Tidende for De Europæiske Fællesskaber. L 170/28. Bilag VIII 03.07.27-34 (1990). | ||||
Tabel 3: responsfaktorer den mest benyttede desulfo-glucosinolater i planteekstrakter og deres omtrentlige retentionstider på C 18 kolonner. Eluenter, gradient, søjletemperatur, og strømningshastigheden som i tabel 1.
Discussion
De største fordele ved denne etableret og udbredte metode er, at det er robust, snarere ligetil, og relativt lave omkostninger per prøve. Det meste af det nødvendige udstyr til udvinding og analyse bør være tilgængelige i en standard laboratorium eller kan være selv-bygget, med undtagelse af HPLC-PDA. En anden fordel er, at desulfoglucosinolates opløst i vand, er kemisk helt stabile, når opbevares køligt og i lufttætte (HPLC) hætteglas, så ekstrakterne kunne let overføres til HPLC-analyse andetsteds. I modsætning til LC-MS-platforme, som kræver specialiserede uddannelse og omfattende hands-on erfaring til styring af software og analysere dataene, HPLC-UV / PDA'er kan nemt løbe efter en kort træningsperiode. Dette reducerer ikke blot omkostningerne ved proceduren, men også gør denne metode mere tilgængelig for en bred vifte af forskere, herunder studerende.
Generelt, når de procedurer, der er beskrevet ovenfor følges carefully, skulle opstå nogle problemer. I almindelighed glucosinolat toppe meget godt adskilt i kromatogrammet. Hvis dette ikke er tilfældet, kan gradienten programmet tilpasses ved at reducere stigningstakten i acetonitril i eluenten. Alternativt bygning i en ny pre-søjle (200-500 injektioner) eller kolonne (1.500 -2000 injektioner) kan løse problemet. Indimellem kan kromatogrammer af enkelte prøver i et parti viser meget små eller ingen toppe. Dette er normalt på grund pipetteringsfejl ved tilsætning af sulfatase (fx en kolonne er blevet sprunget eller sulfatase var ikke korrekt skyllet i kolonnen). Alternativt kan koncentrationen glucosinolat i de eksperimentelle materialer har været lavere end forventet, og for lidt materiale blev anvendt til ekstraktionen. Hvis det sidste er tilfældet, kan injektionsvolumen øges til 100 pi eller en nøjagtig portion (f.eks, 800 pi) af ekstrakten kunne koncentreres. Sidstnævnte kan opnås ved fryse- tørreing ekstrakten, opløsning af resten i et mindre volumen (f.eks 100 pi) af vand, og reinjecting bruger samme reference kurve. I beregningerne for den oprindelige koncentration af ekstrakt, bør tallene ganges med fortyndingsfaktoren. Hvis dette ikke løser problemet, skal materialerne udtrækkes igen bruge mere udgangsmateriale. Hvis dette er mere end 100 mg, bør volumenet af ekstraktionsmidler og størrelsen af rørene justeres proportionalt at opretholde ekstraktionseffektiviteten.
En yderligere fordel er, at denne fremgangsmåde er blevet godt valideret. Det er fordi det er blevet beskrevet som en standard metode til kvantificering af glucosinolater i raps, hvor procedurerne og nøjagtighed blev bekræftet i flere laboratorier 16. Desuden den genetiske baggrund, biosyntese og biologiske funktioner af glucosinolater er udsat for intens forskningsindsats, i model plantearter Arabidopsis thaliana bl.a. 4, 6, 12. Derfor er mange respons faktorer for den nøjagtige kvantificering af desulfoglucosinolates i relation til sinigrin veldefinerede og offentligt tilgængelig 15,17. Selvom LS-MS-baserede protokoller er mere high-throughput, mere følsomme, og er i stand til (forsøgsvis) identificere glucosinolater for hvilke der ikke standarderne findes 18, 19, 20, manglen på universelle reaktionsfaktorer for LC-MS begrænser eksakt kvantificering af glucosinolat koncentrationer 18. Desuden er disse metoder sædvanligvis ikke omfatter en frysetørringstrin, og mængden af vand i den friske plantemateriale er forsvundet i beregningerne, hvilket gør præcis kvantificering vanskelig. Endelig fordi vores ekstraktion metode indebærer en kolonne-baseretoprensning og koncentrering trin kan det også anvendes på "snavsede" prøver med lave koncentrationer af glucosinolater, såsom jord 21.
Sammenlignet med LC-MS-baserede metoder, der normalt ekstrakt frisk frosne materialer, anvender plader med 96 brønde til ekstraktion, og ikke omfatter en sulfatase trin 18, 19, vores metode er relativt tidskrævende og arbejdskraft intens. Med kolonnen stativer er beskrevet i dette papir, kan en enkelt person ekstrakt ca. 100-150 prøver på én dag. Eluering (næste dag), frysetørring (natten over), og re-opløsning kan finde sted inden for de følgende to dage. Med en automatiseret HPLC injektor, en løbetur og ligevægt tid på 40-45 min pr injektion, og ingen uforudsete begivenheder, ville det tage 3-4 dage at erhverve data til dette prøvesæt. Når HPLC software muliggør automatisk kvantificering baseret på sinigrin kurve, en manuel kontrol af kromatogrammerne og peak opgaver for 100 prøver kan kun tage en anden 1 eller 2 timer før data kan bruges til statistiske analyser.
På trods af den øgede tilgængelighed af glucosinolat standarder, kun en lille brøkdel af de mere end 130 kandidater kan i øjeblikket kommercielt købt. Men med nogle få referencer for hver af de biosyntetiske klasser; adgang til litteraturdatabaser præciserer de forbindelser, som tidligere fundet i plantearter (f.eks Fahey et al. 22); grundlæggende viden om kromatografiske principper såsom logikken i eluotropic serier (fx for et stigende antal Cs på sidekæden i alifatiske forbindelser, figur 3 og 4); og validering af de enkelte prøver på LC-MS 19 eller isolerede glucosinolater på NMR 23, kan man nemt overvinde denne begrænsning. De fleste protokoller for glucosinolater analyser anvende interne referencekurver(Dvs. en vis koncentration til udvinding af sinigrin eller sinalbin til ekstraktionsopløsningsmidlet 16, 17, 19). Principielt interne referencedata kurver er mere hensigtsmæssigt at korrigere for de enkelte prøve behandlingsfejl og dermed teoretisk give en højere præcision. På trods af denne fordel, foretrækker vi at bruge en fem-punkts ekstern reference kurve, som vi ofte analysere forskellige vilde arter, hvoraf nogle indeholder høje niveauer af sinigrin (fx Brassica nigra 24) eller sinalbin (f.eks Sinapis alba 25), den to glucosinolat referencer for hvilke responsfaktorer er tilgængelige. Desuden tilføjer interne standarder til hver prøve øger udgifterne til analyserne, som high-grade glucosinolater referencenormaler er normalt ret dyrt.
Som konklusion på trods af de tidskrævende trin, denne protokolgiver en enkel og tilgængelig metode til at udvinde og kvantificere glucosinolater i planter prøver. Imidlertid er det vigtigt at overveje, at glucosinolatniveauer selv er kun en indikation af den potentielle biologiske aktivitet, set som det er nødvendigt at reagere med myrosinase, og variation i reaktionsprodukterne kan opstå fra en enkelt glucosinolater 11. Validation assays skal udføres for at bekræfte den biologiske relevans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20864.320 | |
| Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
| HCl | VWR | 1.09057.1000 | |
| Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
| (−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
| Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
| Ethanol | VWR | 20816.298 | |
| Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
| Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
| Glass/wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
| 2 mL reaction tubes | VWR | 211-2120 | |
| Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
| Rotilabo-sealing clips | Carl Roth | N217.1 | |
| Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
| Acetonitril super gradient grade | VWR | 83639.320 | |
| Water bath | VWR | 462-5112 | |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
| PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
| Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
| Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
| HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
| Flask 1,000 mL | VWR | 215-1595 | |
| Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |
References
- Hartmann, T. From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).
- Will, H., Laubenheimer, A. Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens. Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).
- Agerbirk, N., Olsen, C. E. Glucosinolate structures in evolution. Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).
- Halkier, B. A., Gershenzon, J. Biology and biochemistry of glucosinolates. Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).
- Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond. TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).
- Kliebenstein, D. J., et al. Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).
- van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris. Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).
- Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta. 206 (3), 370-377 (1998).
- van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).
- Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. Disarming the mustard oil bomb. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).
- Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).
- Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Ann Rev Entomol. 54 (1), 57 (2009).
- Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds. Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).
- Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales. Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).
- Buchner, R. Glucosinolates in rapeseed. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).
- Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. Official Journal of the European Communities. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).
- Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).
- Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column. Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).
- Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. Current Protocols in Plant Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates. Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).
- Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil. Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).
- Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).
- de Graaf, R. M., et al. Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation. Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).
- van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea. Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).
- Gols, R., et al. Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions. Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).
