Summary
Den vävnadsspecifika extracellulära matrisen (ECM) är en viktig förmedlare av cellfunktion. Denna artikel beskrivs metoder för att syntetisera rena ECM-härledda skum och mikrobärare som är stabila i odling utan behov av kemisk tvärbindning för tillämpningar inom avancerad 3D in vitro cellkulturmodeller eller som pro-regenerativa bioscaffolds.
Abstract
Cellfunktion medieras av interaktioner med den extracellulära matrisen (ECM), som har komplexa vävnadsspecifik sammansättning och arkitektur. I fokus för denna artikel är på metoder för att tillverka ECM-härledd porösa skum och mikrobärare för användning som biologiskt relevanta substrat i avancerad 3D in vitro cellkulturmodeller eller som pro-regenerativa byggnadsställningar och celltillförselsystem för vävnadsteknik och regenerativ medicin. Med användning av decellulariserade vävnader eller renat olösligt kollagen som ett utgångsmaterial, kan de tekniker tillämpas för att syntetisera en bred uppsättning av vävnadsspecifika bioscaffolds med anpassnings geometrier. Taktiken involverar mekanisk bearbetning och mild enzymatisk digerering för att ge en ECM suspension som används för att tillverka de tredimensionella skum eller mikrobärare genom kontrollerade frysnings- och lyofilisering förfaranden. Dessa rena ECM-derived ställningar är mycket porös, men ändå stabil utan behov av chemical tvärbindningsmedel eller andra tillsatser som kan påverka cellfunktionen negativt. Ställningsegenskaperna kan avstämmas i viss utsträckning genom varierande faktorer såsom ECM suspensionskoncentrationen, mekaniska bearbetningsmetoder, eller syntesbetingelser. I allmänhet är de ställningar är robusta och lätta att hantera, och kan bearbetas såsom vävnader för de flesta vanliga biologiska analyser, som ger en mångsidig och användarvänlig 3D cellodlings plattform som härmar den nativa ECM kompositionen. Sammantaget kan dessa enkla metoder för att tillverka skräddarsydda ECM-härledda skum och mikrobärare vara av intresse för både biologer och biomedicinska ingenjörer som vävnadsspecifika cell lärorikt plattformar för in vitro och in vivo-applikationer.
Introduction
Den extracellulära matrisen (ECM) är sammansatt av en komplex 3D nätverk av proteiner, glykoproteiner och polysackarider 1. Förr betraktades som en övervägande strukturell ram, är det nu väl erkänt att ECM innefattar en mångfald av bioaktiva molekyler med viktiga funktionella roller 2. Cell-ECM-interaktioner kan rikta cellöverlevnad, adhesion, migration, proliferation och differentiering 3. Medan de större klasserna av ECM makromolekyler är i allmänhet väl konserverad över vävnader och arter, har varje vävnad en unik matriskomposition och arkitektur 4. Sammantaget ger det vävnadsspecifika ECM en instruktiv mikromiljö som medierar funktion från den subcellulära till vävnaden / organet skala 5.
På grund av den kritiska roll ECM vid förmedling av cellfunktion, har det ökat intresse för deveckling av ECM-härledda bioscaffolds för applikationer inom vävnadsteknik och regenerativ medicin. I synnerhet, har metoden för decellularisering i stor utsträckning utforskats som ett medel för att erhålla ECM från ett brett spektrum av vävnader för användning som ett ställningsmaterial för vävnadsregenerering och celladministrering 5, 6, 7. Decellularisering involverar typiskt en serie av mekaniska, kemiska, och / eller biologiska behandlingssteg inriktade på att avlägsna celler och cellulära komponenter, medan idealt orsakar minimala ändringar i 3D-strukturen och sammansättningen av ECM 8. Genom att kartlägga litteraturen kan olika decellularisering protokoll identifieras för så gott som alla vävnader i kroppen 7.
Medan decellulariserade vävnader kan användas direkt som implanterbara stödstrukturer eller 3D cellodlingsunderlag, cellulär infiltration kanbegränsas i vävnader med en tät ECM struktur 9. Vidare kan den naturliga heterogenitet i ECM orsaka variabilitet i cellvidhäftning och spridning inom de decellulariserade matriser, vilket potentiellt skulle kunna påverka den cellulära responsen 10. Övergripande, medan lovande för vissa tillämpningar, applicera decellulariserade vävnader i deras intakt form erbjuder begränsad mångsidighet i fråga om avstämningsställnings egenskaper inklusive form, porositet och styvhet, såväl som leveranssättet för in vivo-applikationer.
För att kringgå dessa begränsningar är många forskargrupper applicering ytterligare bearbetningsmetoder för att generera skräddarsydda ställnings format med hjälp av decellulariserade vävnader som ett basmaterial. I den enklaste formen, kan det innebära cryomilling de decellulariserade vävnader för att generera injicerbara vävnadsspecifika ECM partiklar 11. Dessa ECM partiklar kan införlivas som en cell-instructive komponent i komposit ställningar med andra biomaterial, såsom in situ-tvärbindnings hydrogeler 12, 13, 14. Förutom mekanisk bearbetning, kan decellulariserade vävnader också utsättas för enzymatisk digestion med proteolytiska och / eller glykolytiska enzymer för att fabricera ECM-härledda hydrogeler, skum, mikrobärare, och beläggningarna 15, 16, 17, såväl som för att syntetisera bioinks för 3D-utskrift 18.
Förutom vävnadstekniska tillämpningar, ECM-derived bioscaffolds hålla en stor potential för generering av högre trohet in vitro-modeller för biologisk forskning. Det finns ett stort behov av att utveckla 3D cellodlingssystem som bättre rekapitulera de infödda cellulära mikro 19. Mest in vitro cell kultur studier hittills utförs på vävnadskulturpolystyren (TCPS), som har liten korrelation med den biologiskt komplexa och dynamiska cellulära miljön finns inom levande vävnader 20. Medan praktiskt för att studera cellulära interaktioner inom en kontrollerad miljö, odling av celler på dessa förenklade styva 2D substrat förändrar cellvidhäftning och morfologi, liksom både cell-cell- och cell-ECM interaktioner 21, 22. De cellulära anpassningar som observerats på 2D TCPS kan påverka intracellulära signalvägar som reglerar diverse cellfunktioner inklusive överlevnad, proliferation, migration och differentiering, där frågor av relevans av 2D studier i modellering in vivo-system 23. Det har ökat erkännande av att cellulära beteende kan variera kraftigt i 2D kontra 3D-system 24, och att biokemiska och biomechanical signalering med ECM är nyckel mediatorer av cellfunktionen 25. Många grupper har försökt att övervinna begränsningarna av etablerade 2D system genom beläggning TCPS med ECM-komponenter såsom kollagen, laminin och fibronektin. Även om dessa strategier kan förbättra cellbindning och kan förändra cellulära svar förblir dessa modeller begränsas av deras 2D konfiguration som inte efterlikna den komplexa rumsliga organisation eller biokemi infödda ECM 26, 27.
Vår bioteknik laboratorium har varit intresserade av utvecklingen av ECM-härledda bioscaffolds som substrat för 3-D cellodling och vävnadskonstruktionsapplikationer. Framför allt har vi börjat använda sig av decellulariserade fettvävnad (DAT) som en byggnadsställning plattform för fett regeneration 28. Dessutom har vi etablerat metoder för syntes 3D mikrobärare och porösa skum som använder DAT digererades med det proteolytiska enzymet pepsin eller glykolytiska enzymet α-amylas 29, 30, 31. Synnerhet har vi visat i alla av dessa ställningsformat som fetthärledda ECM tillhandahåller en induktiv mikromiljö för adipogen differentiering av humana fettväv härledda stam / stromala celler (ASC: er) i kultur. Mer nyligen utvidgade vi våra tillverkningsmetoder för att generera 3D-porösa skum från α-amylas-digererad porcin decellulariseras vänstra ventrikeln (DLV) (decellularisering metoder anpassade från Wainwright et al. 32), och visade att de ger en stödjande plattform för att inducera tidig cardiomyogenic markör uttryck i humana perikardiell fetthärledda ASCs 31.
Denna artikel beskriver i detalj metoder för syntes av icke-kemiskt tvärbundna porösa 3D skum och mikrobärare härledda renodlatfrån α-amylas-digererad ECM för användning som biologiskt komplexa 3D i cellkultur vitro substrat och som biomaterial för vävnadsregenerering. I teorin kan vilken ECM källa innehållande högmolekylär kollagen skall användas som utgångsmaterial för dessa tekniker. För att demonstrera flexibiliteten hos detta tillvägagångssätt, har de metoder använts för att generera vävnadsspecifika bioscaffolds med användning av humant DAT, porcin decellulariserad dermalvävnad (DDT) 8, och porcint DLV som representativa exempel. Figur 1 ger en visuell översikt av tillverkningsprocessen för ECM-härledda skum och mikrobärare.
Figur 1. Översikt över: Sätt för framställning av den vävnadsspecifika ECM-härledda Skum och mikrobärare. 1. decellulariserade vävnader, ställdes enligt etablerade decellularization protokoll, kan användas för vävnadsspecifik ECM-härledda bioscaffold tillverkning. Makroskopiska bilder visas av hydratiserad human DAT (framställd såsom beskrivs i Flynn 2010 28), svin-DDT (framställd såsom beskrivs i Reing, JE, et al. 2010 8), och porcint DLV (framställd såsom beskrivs i Wainwright et al. 2010 32 ), som representativa exempel på ECM källor som kan användas som utgångsmaterial. Skalstrecken representerar 3 cm. 2. decellulariserade vävnader lyofiliseras och sedan 3. mekaniskt malet. Skalstrecken representerar 1 cm. 4. Den malda ECM kan sedan cryomilled, som är valfri för skumtillverkning, men krävs för mikrobärare syntes. Skalstrecket representerar 3 mm. 5. Den malda eller cryomilled ECM digereras sedan med α-amylas och homogeniserades för att skapa en homogen ECM suspension. Skalstrecket representerar 1 cm.
Protocol
1. decellulariserad vävnads Processing
- Decellularisering och Frystorkning
- Decellularize vävnad (er) av intresse efter ett fastställt protokoll.
OBS: Ställningar i den aktuella studien har upprättats efter publicerade decellularisering protokoll för mänsklig DAT 28, svin DDT 8 och svin DLV 32. Kommersiellt tillgänglig, olösligt kollagen kan också användas för att tillverka skum och mikrobärare, såsom kollagen kommer från bovin sena, som har använts med framgång över ett koncentrationsintervall på 10 - 50 mg / ml. Andra olösliga kollagenkällor kan användas, men kan kräva optimering för att identifiera det koncentrationsområde som kommer att ge stabila stödstrukturer. - Överföra den hydratiserade decellulariserade vävnaden eller renat kollagen i en 50 ml centrifugrör med pincett och tillsätta tillräckligt dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O) för att dränka vävnaden, toa maximal total volym av 35 ml.
- Frysa provet över natten vid -80 ° C, med centrifugröret placeras horisontellt under frysning för att maximera ytarean för sublimering under efterföljande lyofilisering.
- Ta bort locket från centrifugröret och överför det frysta provet i en lyofilisering burk.
- Lyofilisera provet med användning av en laboratoriefrystork under 48 - 72 h eller tills den är helt torkat.
OBS! Torktiden kan variera för olika lyophilizers och decellulariserade vävnader. - Fint mala den lyofiliserade ECM i små bitar (~ 1 - 2 mm 3) med användning av vassa kirurgiska saxar.
- Förvara malet ECM i en torkapparat tills klar för vidare behandling.
OBS: Det rekommenderas att den malda ECM användas omedelbart för att förhindra att fukt absorption från omgivningen.
- Decellularize vävnad (er) av intresse efter ett fastställt protokoll.
- Cryomilling (tillval för skumtillverkning)
- Fylla en 25 ml rostfri kvarnkammaren under en laboratory kulkvarn systemet med malet lyofiliserade ECM och lägga till två 10 mm rostfria stålmalningskulor.
- Nära och fullständigt dränka den laddade kvarnkammaren i flytande kväve under 3 min.
- Kvarn det frysta provet under 3 min vid 30 Hz (1800 varv per minut).
- Upprepa steg 1.2.2 och 1.2.3 tills ECM mals till ett fint pulver.
OBS: Antalet gånger dessa åtgärder bör upprepas kan variera mellan ECM källor. Till exempel, DAT kräver typiskt 3 fräscykler för att generera ett fint pulver. - Överföra pulvret med användning av en Spatel i en glasflaska, försegla tätt och lagra i en exsickator.
- ECM Suspension Framställning
- Väg upp 250 mg av antingen malet (för skum) eller cryomilled (för skum eller mikrobärare) ECM och överföra den till en 15 ml centrifugrör. Se steg 1.1.6 och avsnitt 1,2 för beredning av malet ECM och cryomilled ECM, respektive.
OBS: Detta protokoll är utformad för att framställa en 50 mg / ml ECM suspenSion, som rekommenderas för human DAT, svin DDT och svin DLV. Beroende på den specifika ECM källan, kan enhetliga suspensioner genereras vid högre eller lägre utgångskoncentrationer. - Lägga 5 ml 0,22 M NaH 2 PO 4 (pH 5,4) buffert till centrifugröret och markera vätskenivån på röret.
- Framställa en α-amylas stamlösningen genom tillsats av 7,5 mg av α-amylas till 1 ml 0,22 M NaH 2 PO 4 (pH 5,4) buffert. Lägga 100 mikroliter av α-amylas stamlösning (0,75 mg α-amylas; 0,3% vikt / vikt av torr vävnad) till provet. Lägga 0,22 M NaH 2 PO 4 för att erhålla en slutlig volym av 10 ml.
- Agitera suspensionen kontinuerligt vid 300 rpm under 72 h vid rumstemperatur.
- Centrifugera suspensionen vid 1500 xg under 10 min. Försiktigt samla in och kassera supernatanten utan att störa spjälkade ECM pellet. Resuspendera det pelleterade materialet i 10 ml 5% NaCl utspädd i DDH 2 O.
- Upprepa steg 1.3.5 för totalt två sköljningar med 5% NaCl i DDH 2 O.
- Kassera supernatanten och resuspendera pelletterade materialet i 10 ml ddHaO 2 O.
- Agitera suspensionen kontinuerligt vid 300 rpm under 10 min vid RT.
- Centrifugera suspensionen vid 1500 xg under 10 min. Försiktigt samla in och kassera supernatanten utan att störa spjälkade ECM pellet.
- Lägg 0,2 M ättiksyra till 5 ml märket i steg 1.3.2.
- Agitera suspensionen kontinuerligt vid 120 rpm O / N vid 37 ° C.
- Homogenisera ECM suspensionen vid rumstemperatur i tio sekunders intervall med användning av en handhållen homogeniseringsanordning utrustad med en såg tand 10 mm bred sond tills inga synliga fragment kvar. Placera suspensionen i en bägare med kallt vatten mellan homogenisering intervaller för att förhindra överhettning.
OBS! Beroende på ECM källan, kan ytterligare utspädning i 0,2 M ättiksyra krävas för att erhålla en homogen suspension. Excessive kylning av ECM suspensionen kan resultera i en ökning i viskositet som kan störa effektiv homogenisering. Om en ökning i viskositet noteras, kan provet rewarmed till 37 ° C och utsattes för vidare bearbetning. - Lagra vid 4 ° C i upp till en månad före skum eller mikrobärare tillverkning.
- Väg upp 250 mg av antingen malet (för skum) eller cryomilled (för skum eller mikrobärare) ECM och överföra den till en 15 ml centrifugrör. Se steg 1.1.6 och avsnitt 1,2 för beredning av malet ECM och cryomilled ECM, respektive.
2. ECM-derived Foam Fabrication
- Inkubera ECM suspensionen från steg 1.3.13 (malet eller cryomilled) vid 37 ° C med kontinuerlig omrörning vid 120 rpm till dess att suspensionen är varm.
- Späd ECM suspension i 0,2 M ättiksyra surt till den önskade koncentrationen.
OBS! Beroende på ECM källan, stabila skum kan framställas i intervallet på 10 - 100 mg / ml, med 15 till 50 mg / ml som det rekommenderade intervallet för DAT, DDT och DLV. Typiskt kommer skum tillverkade vid högre koncentrationer vara något mindre porös men mer stabil i odling och lättare att hantera. - Med användning av en 3 ml spruta wed en 18 G nål för att förhindra bubbelbildning i ECM suspensionen, fylla den önskade formen med ECM suspensionen. Att framställa DAT, DDT, och DLV skum, dispensera 400 mikroliter av 35 mg / ml ECM suspensionen till en 48-brunnars cellodlingsbehandlade plattan.
OBS: Formen för den valda formen och volymen av ECM suspensionen kommer att avgöra geometrin hos det resulterande skummet. - Täcka och frysa formarna över natten genom att placera dem i en -20 ° C eller -80 ° C frys.
OBS: Den frystemperaturen kan påverka porositeten hos skummen. Större porer förväntas när proverna frystes vid -20 ° C, jämfört med -80 ° C på grund av bildningen av större iskristaller 33. Att tillverka skum med en likformig porös struktur, se till att formen inte är i kontakt med en ledande yta för att förhindra riktad kylning. - Placera formarna med de frysta proverna i en lyofilisator kolv. Anslut lyofilisator kolven till Laboratory frystorkare systemet och torka i 24 timmar.
OBS: Det är viktigt att provet förblir fryst före frystorkning. - Förvara frystorkade skum i en exsickator tills de behövs.
3. ECM-härledda mikrobärare Fabrication via elektros
OBS: En översikt av elektros inrättat visas i figur 2.
- Inkubera cryomilled ECM suspensionen från steg 1.3.13 vid 37 ° C med kontinuerlig omrörning vid 100 rpm O / N.
OBS: Cryomilled ECM används för att tillverka de ECM-härledda mikrobärare för att säkerställa större enhetlighet i suspensionen och förhindra igensättning under elektros. - Belastning 3 ml ECM suspensionen till en 3 ml Luer spruta och bifoga en vingförsedd infusionsuppsättning på borrningen i sprutan.
OBS: Ett urval av nål mätare kan användas, som erkänner att valet kan påverka storleken och formen av de resulterande mikrobärare. att fabricate de DAT, DDT, och DLV mikrobärare, använd en 25 G-nål. - Fäst sprutan i sprutpumpen. Fästa nålen till en retort stativ och placera nålspetsen vertikalt på ett avstånd av 4 - 6 cm från toppen av en låg-formen Dewar-kolv (250 - 500 ml storleksområde rekommenderas).
- Bifoga en krokodilklämma elektrod till spetsen av nålen och anslut den till den positiva klämman på högspänningsströmförsörjningen.
- Vika en remsa av aluminiumfolie (12 x 5 cm) över kanten av vakuumkolv.
- Bifoga en andra krokodilklämman elektrod till den yttre kanten på folien och anslut den till marken source-anslutningen på strömförsörjningen.
- Fylla Dewar-kolv med flytande kväve till ca 1 cm från toppen, så att tre fjärdedelar av folien är under vatten.
OBS: Det är viktigt att hålla Dewar kolv fylld med flytande kväve. Ytan av det flytande kvävet får inte vara mindre än 2 cm från toppen av kolven under elektros process. Kontinuerlig påfyllning av flytande kväve krävs för att bibehålla en konstant nivå under elektros. - Ställa in sprutpump till en infusionshastighet av 30 ml / h.
OBS: Variation av infusionshastigheten kan förändra mikrobäraren form och diameter, men det rekommenderade området är 25 - 35 ml / h. Medan det är i hög grad beroende på viskositeten av suspensionen, kan flödeshastigheter under 25 ml / h resulterar i generering av större mikrobärare. Vid mycket låga flödeshastigheter, kan storleken och formen hos mikrobärarna blir mindre homogen. Vid infusionshastigheter över 35 ml / h, kan likformigheten hos de små dropparna som alstras via elektros störas, vilket resulterar i icke-sfäriska mikrobärare med en bredare storleksfördelning 34. - Applicera en spänning på 20 kV och slå på sprutpumpen för att initiera elektros.
OBS: Spänningen kan varieras för att avstämma storleken på mikrobärare och tenderar att ha en större inverkan på den diameter än infusioN-grad. Det rekommenderade spänningsområde är 15 - 25 funktions kV. En minskning i mikrobärare diameter förväntas med en ökning i spänningen 35. - När infusions är fullständig, häll försiktigt av överskottsvätska kväve från Dewar, lämnar mikrobärarna suspenderats i ~ 25 ml flytande kväve för att säkerställa att de förblir fryst.
- Överför omedelbart mikrobärama med flytande kväve i en 50 ml centrifugrör genom att hälla i en jämn rörelse. Samla några frysta mikro kvar i Dewar med en Spatel och lägga till dem i centrifugröret.
OBS: Beroende på storleken av Dewar, kan de mikrobärare i flytande kväve vara initialt hälldes i en medelstor kärl, och överfördes sedan omedelbart in i 50 ml centrifugrör. - Täcka centrifugrör innehållande mikrobärarna i flytande kväve med aluminiumfolie perforerad med små hål i förberedelse för lyofilisering.
- Placera den täckta centrifugrör i en lyofilisator kolv. Omedelbart ansluta kolven till lyofilisator och torka proverna O / N.
OBS: Det är mycket viktigt att hålla mikro suspenderade i flytande kväve för att säkerställa att de inte tina före detta steg, eftersom upptining kan leda till kollaps och / eller aggregering. DAT, DDT och DLV mikrobärare tillverkade vid en koncentration av 35 mg / ml med användning av de elektrosbetingelser som beskrivits ovan kommer typiskt att ha en hydratiserad diameter som sträcker sig mellan 350 - 500 ^ m i storlek. Storleksfördelningen kan variera beroende på den ECM källan. - Förvara frystorkade mikro i en exsickator tills de behövs.
Figur 2. Översikt över elektros Apparatur som används i mikrobäraren Fabrication. A: Bild som visar arrangemanget av de viktigaste elektros utrustning inklusive sprutpumpenoch högspänningskälla, såväl som placeringen av nålen i förhållande till Dewar av flytande kväve. B: elektrosschematisk, inklusive de rekommenderade områden för spänningen, infusionshastighet, och avstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. framställning av skum och Mikrobärare för cellodling
- rehydrering
- Överföra de lyofiliserade skummen med pincett till ett 50 ml centrifugrör innehållande överskott absolut etanol (~ 99,9%) (~ 5: 1 förhållande av etanol till skum). På liknande sätt, resuspendera de lyofiliserade mikrobärare i överskott absolut etanol inom den ursprungliga centrifugrör användes för uppsamling. Med användning av en serologisk pipett, filtrera mikrobärama genom ett rostfritt sikt med en definierad maskstorlek till en ny 50 ml centrifugrör för att avlägsna eventuella aggregat och selektera för önskade storleksområden.
OBS: Om skum tillverkas inom TCPS plattor kan de rehydreras direkt i dessa kärl. - Inkubera vid 4 ° C under 4 h eller tills skum eller mikrobärare har gravitationen sedimenterat till botten av centrifugröret. Utföra alla efterföljande steg i en huv med laminärt flöde med användning av sterila reagens och riktig aseptisk teknik.
- Avlägsna absolut etanol med användning av en serologisk pipett och tillsätt överskott (5: 1 förhållande) 95% etanol utspäddes med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att de ställningar. Inkubera vid 4 ° C under 4 h eller tills ECM härledda ställningar har sjunkit till botten av rehydrering kärlet.
- Gradvis rehydrera ställningar genom en etanolserie (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 och 0%, utspäddes med steril PBS). Vid varje steg, inkubera vid 4 ° C tills de ställningar har sjunkit till botten av kärlet innan byte lösningen. Avgasa ställningar under lätt vakuum om bubbelbildning inom de byggnadsställningar är observed.
- Ersätta den steril PBS under ytterligare två sköljningar för att avlägsna rester av etanol.
- Butik i 100% steril PBS vid 4 ° C tills redo för cellodling. Använd ställningar inom 1 - 2 veckor efter rehydrering.
- Överföra de lyofiliserade skummen med pincett till ett 50 ml centrifugrör innehållande överskott absolut etanol (~ 99,9%) (~ 5: 1 förhållande av etanol till skum). På liknande sätt, resuspendera de lyofiliserade mikrobärare i överskott absolut etanol inom den ursprungliga centrifugrör användes för uppsamling. Med användning av en serologisk pipett, filtrera mikrobärama genom ett rostfritt sikt med en definierad maskstorlek till en ny 50 ml centrifugrör för att avlägsna eventuella aggregat och selektera för önskade storleksområden.
- Förberedelse för Cell Seeding
- På dagen före sådd, överföra skummen som använder pincett in i cellkultur behandlas väl plattor eller transwell skär och tillsätta tillräckligt cellodlingsmedium (väljas baserat på den celltypen av intresse) för att fullständigt dränka stöden (t.ex. 2,5 ml / ställnings i en 12-brunnars platta). På liknande sätt, tillåter mikrobärarna till tyngdkraften sedimentera inom centrifugröret, försiktigt bort PBS med användning av en serologisk pipett utan att störa mikrobärarna, och tillsätt cellkulturmedium för att uppnå en 5: 1-förhållande av beläggningsmedium på mikrobärarna.
OBS: För sådd mänskliga DSKer, utnyttjar Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM): Hams F12 näringsblandning kompletterad med10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin. - Ersätta cellodlingsmediet under totalt en sköljning.
- Jämvikta ställningar över natten i cellodlingsmedium vid 37 ° C. De ställningar kommer att vara redo för cell sådd nästa dag.
OBS: kan Skummen vara statiskt såddes i cellodlingsinlägg eller vävnadsodlingsbrunnplattor 29, eller dynamiskt ympas med användning av en laboratorie skakapparat 36. Beroende på ECM källan, bearbetningsmetoder och suspensionskoncentration, kan dynamisk sådd förbättra initial cellvidhäftning, proliferation och infiltration. Mikrobärama kan ympas dynamiskt med en spinnerkultursystem 11.
- På dagen före sådd, överföra skummen som använder pincett in i cellkultur behandlas väl plattor eller transwell skär och tillsätta tillräckligt cellodlingsmedium (väljas baserat på den celltypen av intresse) för att fullständigt dränka stöden (t.ex. 2,5 ml / ställnings i en 12-brunnars platta). På liknande sätt, tillåter mikrobärarna till tyngdkraften sedimentera inom centrifugröret, försiktigt bort PBS med användning av en serologisk pipett utan att störa mikrobärarna, och tillsätt cellkulturmedium för att uppnå en 5: 1-förhållande av beläggningsmedium på mikrobärarna.
Representative Results
I den aktuella studien, har vi tillverkat ECM-härledda skum och mikrobärare med användning av humant DAT, porcin DDT, och porcint DLV som representativa exempel som visar att de tekniker kan tillämpas för att generera vävnadsspecifika bioscaffolds med hjälp av olika decellulariserade vävnader som ECM källor ( figur 1). För både skum och mikrobärare tillverkning ades Nishihara tekniken med kollagen solubilisering med det glykolytiska enzymet α-amylas 37 anpassad för att generera en viskös ECM suspension från decellulariserade vävnadsutgångsmaterial, som används för att syntetisera de bioscaffolds genom kontrollerade frysnings- och lyofilisering förfaranden.
Att tillverka skummen, kan de decellulariserade vävnader bearbetas antingen genom mekanisk malning eller cryomilling att öka ytarean före enzymatisk spjälkning. Följande45; amylas behandling och homogenisering, är den resulterande ECM suspensionen dispenseras i en användardefinierad form, som därefter fryses och lyofiliseras. De ställningar kan lagras stabilt i torrt tillstånd under en längre tid. Före användning i cellkulturstudier, måste de lyofiliserade byggnadsställningar utsättas för en kontrollerad rehydrering process som ger porösa och högt hydratiserade homogena skum härledda från ren ECM (figur 3A). Om skummen rehydratiseras för snabbt, kan snabb svullnad skada känsliga strukturella drag, vilket resulterar i förlust av integritet och strukturell kollaps. I allmänhet, kommer skummen bibehålla formen som definieras av den ursprungliga formen efter rehydrering och är stabila utan behov av kemisk tvärbindning. Figur 3B visar representativa svepelektronmikroskop (SEM) bilder av DAT, DDT, och DLV skum tillverkas med cryomilled ECM vid en koncentration av 35 mg / ml och en frystemperatur av -80 & #176; C.
Figur 3. Representativa Bilder av DAT, DDT, och DLV Skum Fabricated med Cryomilled ECM Suspensioner Vid en koncentration av 35 mg / ml och frystes vid -80 ° C. A: Makroskopisk bild av DAT, DDT, och DLV malda skum syntetiserade i en 48-brunnars vävnadsodlingsplatta mögel efter rehydratisering. Skalstrecken representerar 1 cm. B: SEM-bilder av de DAT, DDT, och DLV skum som visar ett homogent poröst ultrastruktur. Skalstrecken representerar 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De cryomilled ECM suspensioner kan också användas för att generera rena ECM-härledda mikrobärare via elektros tekniker (Figur 2 (Figur 4A). Medan mikrobärama kan lagras i lyofiliserat tillstånd, rekommenderas för att underlätta hantering av att de dispenseras eller siktas till en önskad storleksintervall efter återsuspension i etanol. SEM imaging antyder att mikrobäraren ultrastruktur kan variera beroende på den decellulariserade vävnadskällan (figur 4B).
Figur 4. Representativa Bilder av DAT, DDT, och DLV Mikrobärare Fabricated med Cryomilled ECM Suspensioner Vid en koncentration av 35 mg / ml, en infusionshastighet av 0,5 ml / min, och en pålagd spänning av 20 kV. A: Makroskopisk vy of de hydratiserade DAT, DDT, och DLV mikrobärare. Skalstrecken representerar 4 mm. B: SEM bilder av DAT, DDT och DLV mikro visar att ultra och storlek kan variera beroende på ECM källan. Skalstrecken representerar 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De mekaniska egenskaperna hos de ställningar är beroende av ECM källan, metoden för behandling som tillämpas (dvs. mals kontra cryomilling), ECM suspensionskoncentrationen, och frystemperaturen. I allmänhet är de ställningar är mjuka och följsamt, med elasticitetsmoduler i området av 1 - 5 kPa rapporterats för DAT (50 & 100 mg / ml) 29 och DLV skum (20 - 50 mg / ml) 31, och <1 kPa för mikrobärarna. De cryomilled skum är typiskt mjukare than de malet skum på grund av deras mer störs natur. Specialiserade mekaniska testnings system utrustade med höggradigt känsliga lastceller behövs för noggrann karakterisering av de kompressiva egenskaper. Typiskt skulle de skum och mikrobärare har lägre modul än de nativa decellulariserade vävnader på grund av de ytterligare behandlingssteg som är involverade i tillverkning inkluderande enzymatisk uppslutning och homogenisering, liksom den icke-kovalent tvärbundna naturen hos skeletten. Detta kan dock variera beroende på vävnaden av intresse. Till exempel, i tidigare arbete, fann vi att malet DAT skum tillverkas till hög ECM-koncentrationer (100 mg / ml) hade liknande moduler till nativt fettvävnad 29.
De rehydrerade ECM-härledda skum och mikrobärare kan besås med celler under statiska eller dynamiska odlingsbetingelser för att ge en cell stödjande plattform för in vitro-cellodlingsstudier och / or in vivo celladministrering. Medan ställningar stöd i allmänhet cellbindning kommer sådd effektivitet beror på ECM källan ställningen geometri och porositet och celltypen av intresse. Som sådan kommer de såddmetoder och densiteter kräver optimering beroende på de användardefinierade förhållanden. För de skum som beskrivs ovan, rekommenderar vi en startcellkoncentrationen i området 0,25 - 1 x 10 6 celler / scaffold, med dynamisk ympning på en orbital skakanordning för att förbättra cellinfiltration. För mikrobärarna, föreslår vi en initial sådd densitet i området 25.000 - 50 tusen celler / mg av mikrobärare, med ympning utförs under dynamiska förhållanden i en spinnerodlingskolv 11. De bilder som visas på botten av figur 1 representerar mänskliga ASCs ympades på en DAT skum (vänster) eller DAT mikrobärare (höger, förmärkta med en amin-reaktivt färgämne och som förekommer blå 13), såsom visualiserades genom konfokal mikroscopy användning av en fluorescerande cellviabilitet fläck (levande celler = grön, döda celler = röd; Skalstrecken representerar 100 ^ m). Konfokal mikroskopi kan användas för att visualisera celler sådda på ytan av skum upp till 2 mm i tjocklek, men visualisering in i de centrala områdena av byggnadsställningar är begränsad genom deras opaka natur. Emellertid kan skum och mikrobärare behandlas som vävnader och paraffininbäddade eller Cryo-sektionerad för histologisk och immunohistokemisk analys att visualisera cellfördelning och markör uttryck.
Discussion
I allmänhet, bioscaffolds härledda från decellulariserade vävnader kan närmare approximera den komplexa 3D sammansättning och struktur av ECM i den nativa cellulära mikromiljön jämfört med syntetiska ställningar eller standardodlingsmodeller baserade på 2D TCPS. Såsom tidigare diskuterats, cell-ECM-interaktioner är kritiskt viktiga vid förmedling av cellbeteende både i kultur och i kroppen 1. Erkänner att de biokemiska, biofysiska och biomekaniska egenskaper hos ECM är unika för varje vävnad, är det allt fler bevis för att stödja den logiska grunden för att applicera vävnadsspecifika lösningar i utformningen av biomaterial för vävnadsteknik, liksom i utvecklingen av mer fysiologiskt relevanta odlingsmodeller för in vitro-experiment 20. Utnyttjande decellulariserade vävnader som utgångsmaterial, kan våra metoder införliva den komplexa sammansättningen av den vävnadsspecifika ECM inom mer customizable ställnings format. Medan de mekaniska och enzymatiska behandlingssteg kommer att resultera i en förlust av den nativa ECM ultrastruktur har tidigare studier med DAT visat att läro effekterna av adipos-härledda ECM är konserverade i dessa ställnings format, vilket antyder att bioscaffold kompositionen är en nyckelförmedlare av cellfunktion 11, 29. En betydande fördel med att använda ECM-härledda skum och mikrobärare som cellodlingssubstrat, jämfört med de intakta decellulariserade vävnader är att de är mer homogena, vilket kan förbättra likformighet i cellfördelning och cell-cell / cell-ECM-interaktioner.
De metoder som beskrivs här kan användas för att generera ett brett spektrum av vävnadsspecifika bioscaffolds för användning i cellkultur och vävnadskonstruktionsapplikationer. Till exempel, förutom DAT, DDT och DLV, vårt labb har framgångsrikt tillämpat dessa tekniker för att generera 3D-porOU skum med användning av decellulariserade ben, brosk, nucleus pulposus, och trådbroskringen, såväl som kommersiellt tillgängliga, olösligt kollagen som härrör från bovin sena. Från en in vitro perspektiv, skulle dessa bioscaffolds användas som en grund för högre-fidelity 3D odlingsmodeller för undersökning av cellbiologi, fysiologi eller sjukdomspatologi 38, såsom bioaktiva substrat i hög genomströmning läkemedelsscreenings plattformar 39, eller som instruktiva matriser för stammen celldifferentiering 40, 41. DAT, DDT och DLV skum tillverkade vid koncentrationer av 25 - 50 mg / ml är stabila i långtids in vitro-kultur (testad upp till 28 dagar). Vidare kan alla tre typer av mikrobärare stödja cellvidhäftning och proliferation under dynamiska förhållanden i en låg-skjuvning spinnerodlingssystemet (10 - 15 varv per minut) under minst 2 veckor. För in vivo tillämpningar biokompatibla och biodegradable ECM-härledda skum och mikrobärare håller löfte såsom off-the-shelf produkter för att stimulera konstruktiv vävnadsombildning och regenerering 11, 29. Vidare skulle de celladhesiva ställningar användas som cellterapi tillförselsystem 42, 43. Som ett exempel, var DAT skum visat att främja angiogenes och adipogenes när ympades med allogena ASCs och implanterades subkutant i en immunkompetent råttmodell 29. Förhållande till den intakta DAT, den mer höggradigt bearbetade DAT skum nedbrytes mycket snabbare, med en minskning i volym 50% noterades vid 3 veckor när de integrerades med värdvävnader, och nästan fullständig resorption av 12 veckor. Emellertid skummen inducerade också en mer potent angiogen respons, vilket tyder på att den enzymdigere ECM hade unika pro-regenerativa effekter. På liknande sätt skulle de ECM-härledda mikrobärare användas som in vitro </ em> cellodlingssubstrat inom dynamiska kultursystem och som injicerbara cellleveransfordon 11, 30, 44. Mer specifikt, skulle området med liten diameter och stora ytan av mikrobärama möjliggöra leverans av en stor mängd av celler i en liten volym, samtidigt som den ger en matris som kan bidra till att stödja cellviabilitet och öka cell retention vid injektionsstället 30. Före användning i något levande system, är det viktigt att säkerställa att käll ECM är väsentligen fri från antigena cellulära komponenter och / eller potentiellt cytotoxiska decellularisering reagenser som kan utlösa en negativ värdrespons 7.
Det proteolytiska enzymet pepsin används vanligen vid framställning av ECM-härledda hydrogeler 15. Pepsin är ett ospecifikt proteas som kommer att smälta kollagen och andra ECM-proteiner into små fragment 45. Medan hydrogeler tillverkade av pepsindigere ECM har rapporterats att ha cell lärorikt effekter, är en begränsning att dessa material tenderar att vara extremt mekaniskt svaga 46. I vårt inledande utvecklingen av DAT mikrobärare, utnyttjade vi en komposit tillvägagångssätt där pepsin-digere DAT kombinerades med alginat och sattes droppvis till CaCl 2 för att bilda sfäriska pärlor 30. Pärlorna var därefter fototvärbundna och alginatet extraherades med användning av natriumcitrat. Förutom kravet på kemisk tvärbindning, en nyckelbegränsning var att mikrobärarna framställda med detta tillvägagångssätt hade dålig stabilitet under ett storleksintervall av 900 till 950 | im 30. I stället för pepsin, de metoder som presenteras här utnyttja en mer mild spjälkning av ECM med den glykolytiska enzymet α-amylas, som postuleras för att klyva kolhydratgrupper från telopeptide regioner av kollagen, och därigenom öka löslighet i ättiksyra 37. Detta tillvägagångssätt möjliggör isolering av starkt polymeriserad kollagen som kan användas för att generera rena ECM-härledda skum och mikrobärare utan behov av kemisk tvärbindning eller andra tillsatser. Dessa bioscaffolds är stabiliserade genom fysiska interaktioner och vätebindning mellan välbevarade kollagenfibriller, liknande till kollagenet i den nativa ECM mikromiljö.
Skummen är en mycket flexibel plattform som kan tillverkas i ett brett spektrum av geometrier beroende på den specifika formen valts. För cellodlingsstudier, kan skummen gjutas direkt i TCPS brunnsplattor, för att bilda beläggningar eller 3D-ställningar med varierande tjocklek. Att fabricera 3D skum med mycket likformiga ytor, är det rekommenderat att en anpassad gjutform är utformad som kan förseglas på båda sidor med plast- eller glasskivor. Antingen hackad eller cryomilled ECM kan användas för att syntetiseraskummen. I allmänhet, har vi funnit att de cryomilled skummen tenderar att vara makroskopiskt mjukare och har en mer störd ultrastruktur vid lägre koncentrationer 31, 36. Beroende på vävnadskällan, kan de ytterligare mekaniska bearbetningssteg orsaka förändringar i ECM sammansättning som kan påverka cellfunktionen. Till exempel i vårt tidigare arbete, var laminin upptäcktes i malet DLV skum, men inte cryomilled DLV skum 31. I kontrast, var kollagen I, kollagen IV, laminin och fibronektin detekteras i både malet och cryomilled DAT skum 36. Utöver de mekaniska bearbetningssteg, kan porositeten och porstorleken hos skummen avstämmas i viss utsträckning genom att variera ECM suspensionskoncentrationen och frystemperaturen 47. I allmänhet, lägre koncentrations skum (~ 10-15 mg / ml) är kvalitativt mer porösa, men kan dra ihop sig snabbt och har dåligstabilitet i långtidsodling 31, 36. På liknande sätt, en långsammare frysning hastighet, typiskt genom en högre frystemperatur, kan resultera i större porer i skummen på grund av storleken av iskristallerna som bildas under tillverkning 29. Alla dessa parametrar kan påverka cell interaktioner med material, inklusive fäste, infiltration och ombyggnad. Till exempel, kan celltillväxt på skum som är framställda med högre ECM koncentrationer begränsas till de ytområden, i synnerhet med malet ECM källor och under statiska odlingsbetingelser 36.
För mikrobärarna, de nyckelparametrar som kan avstämmas är ECM suspensionskoncentrationen, nål gauge, och pålagd spänning, med högre koncentrationer typiskt utbyte ge mikrobärare som är mer stabila under långtids dynamisk kultur. Efter initieringen av elektros, ECM suspension dropparna bör snabbt falla in i centrum av kolven, i den riktning av aluminiumfolie samlare. För att förhindra aggregation, är det viktigt att pärlorna kontakta flytande kväve före folien. Avståndet mellan nålen och ytan hos det flytande kvävet kan justeras för att uppfylla dessa krav. Det är viktigt att notera att optimering kan krävas beroende på egenskaperna hos varje specifikt ECM källa, särskilt vid val av koncentrationsintervall som kommer att generera stabila bioscaffolds. En annan viktig faktor är decellularisering protokoll som används för att generera utgångsmaterialen, som decellularisering metoder som bryter ned ECM eller närvaron av kvarvarande reagens (t ex ytaktiva ämnen) kan påverka stabiliteten hos de resulterande skummen och mikrobärare negativt. Om utmaningar påträffas med bioscaffold stabilitet, alternativ som kan undersökas innefattar användning av en mer gradvis rehydrering, vilket ökar ECM suspension koncentration, och utforska malet kontra cryomilled ECM. Skulle alla dessa alternativ inte löser problemet, kan det vara nödvändigt att undersöka alternativa decellularisering protokoll eller ECM källor.
För att säkerställa reproducerbarhet under byggnadsställning produktion måste särskild försiktighet iakttas vid vissa steg i protokollet. När cryomilling de decellulariserade vävnader, är det rekommenderat att fräsning utföras omedelbart efter lyofilisering i en torr miljö för att minska sannolikheten för partikel aggregering på grund av absorption av fukt från omgivningen. Under mikrobärare tillverkning, föreslås det att suspensionen electrosprayed i små satser, med en maximal volym av 3 ml, för att undvika problem med provkylning som kan resultera i igensättning av nålen. Vidare är det viktigt att mikro inte får tina efter elektrosprocessen. Att behålla sin sfäriska geometri och mekanisk stabilitet, den microcarriers bör samlas in från det flytande kvävet, transporteras i en flytande kväve-fylld behållare, och omedelbart lyofiliseras. Slutligen, för både skum och mikro, är det viktigt att rehydrering stegen utförs långsamt under en period av flera dagar. Snabba rehydratisering kan resultera i strukturell kollaps på makro- och / eller mikroskala. Vidare måste rehydrering ske långsamt för att förhindra bildandet av små luftbubblor inom ställningen, som kan kräva en betydande mängd tid för avgasning under lätt vakuum.
Sammanfattningsvis kan de metoder som presenteras i detta dokument användas för att tillverka en mångfald av vävnadsspecifika skum och mikrobärare bestående av ren, icke-kemiskt tvärbundna ECM. En fördel för biologiska forskare är att bioscaffolds är lätta att hantera och kan bearbetas på liknande sätt till vävnader vid utförande analyser med tekniker såsom histologi, immunhistokemi, eller gen- och proteinexpressionsanalyser.Dessutom kan ECM-härledda ställningar vara enzymatiskt nedbrutna att extrahera ympade cellpopulationer eller kan användas direkt som bionedbrytbara och biokompatibla cell tillförselvehiklar. Sammantaget har denna flexibla plattformsteknologi stor nytta för många tillämpningar, inklusive för 3D cellodlingsstudier undersöker cellfunktion, som expansionscellsubstrat, och som pro-regenerativa bioscaffolds.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, glacial | BioShop | ACE222.500 | |
| Alligator clip leads | VWR | 470149-728 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| α-amylase | Sigma | 101074694 | from Aspergillus aryzae |
| Analytical balance | Sartorius | CPA225D | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004251 | With swinging bucket rotor for 15 & 50 mL centrifuge tubes |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) | Sigma | C9879 | Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers |
| Cryomilling system | Retsch | 20.745.0001 | MM 400 |
| Dessicator | Fisher Scientific | 8624426 | For lyophilized ECM and bioscaffold storage |
| DMEM: F12 Hams | Sigma | D6421 | Used for proliferation media |
| Dewar flask | Fisher Scientific | 10-196-6 | Low form; volume range of 250 - 500 mL |
| Double distilled water (ddH2O) | From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System | ||
| D-PBS (Phosphate-buffered Saline) | Wisent | 311425125 | |
| ECM (Extracellular Matrix) | Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32) | ||
| Ethanol | Greenfield Specialty Alcohols Inc. | P016EAAN | Absolute |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 80150 | Used for proliferation media |
| Forceps | VWR | 37-501-32 | For transferring the foams |
| Freezer (-20 °C) | VWR | 97043-346 | |
| Freezer ( -80 °C) | Thermo Scientific | EXF40086A | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-339-26D | To store lyophilized cryomilled ECM |
| Hand held homogenizer | Fisher Scientific | 14-359-251 | Speed: 8,000 - 30,000 rpm |
| Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes | Fisher Scientific | 14-261-17 | 10 x 95 mm |
| Liquid nitrogen | For electrospraying | ||
| Lyophilizer | Labconco | 7750021 | FreeZone4.5 |
| Milling chamber | Retsch | 02.462.0213 | 25 mL volume recommended |
| Milling balls | VWR | 16003-606 | 10 mm diameter, stainless steel recommended |
| 18 G needle | VWR | C ABD305185 | For dispensing ECM suspension into moulds |
| Orbital incubator shaker | SciLogex | 832010089999 | Temperature controlled (37 °C) |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Used for proliferation media |
| Pipet-Aid XP | Mandel Scientific | DRU-4-000-101 | |
| Retort stand | VWR | 470019-526 | |
| Retort stand clamp | VWR | 21573-606 | |
| Safety-Lok Syringe | BD | 309606 | 3 mL Luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| Sodium chloride | BioShop | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic | BioShop | 10049-21-5 | |
| Scoopula | VWR | 89259-968 | For collecting microcarriers |
| Surgical scissors | VWR | 82027-590 | |
| Syringe pump | VWR | 10117-490 | Microprocessor controlled |
| High voltage power supply | Gamma High Voltage Research | ES30P-5W/DDPM | Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12565321 | For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected |
| Winged infusion set | Terumo | 22258092 | 30 cm tubing length, 25 G 3/4" recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter |
References
- Eweida, A. M., Marei, M. K. Naturally Occurring Extracellular Matrix Scaffolds for Dermal Regeneration: Do They Really Need Cells? Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering. J. Cell. Phys. 199 (2), 174-180 (2004).
- Du, J., et al. Extracellular Matrix Stiffness Dictates Wnt Expression Through Integrin Pathway. Sci. Rep. 6, 4195-4200 (2016).
- Badylak, S. F. The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction. Cell & Dev. Biol. 13 (2), 377-383 (2002).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of Tissues and Organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An Overview of Tissue and Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Reing, J. E., et al. The Effects of Processing Methods Upon Mechanical and Biologic Properties of Porcine Dermal Extracellular Matrix Scaffolds. Biomaterials. 31 (33), 8626-8633 (2010).
- Yang, Q., et al. Morphological Appearance, Content of Extracellular Matrix and Vascular Density of Lung Metastases Predicts Permissiveness to Infiltration by Adoptively Transferred Natural Killer and T Cells. Cancer Immun. Immunother. 55 (6), 699-707 (2006).
- Calle, E., Ghaedi, M., Sundaram, S., Sivarapatna, A., Tseng, M. K., Niklason, L. E. Strategies for Whole Lung Tissue Engineering. IEEE Trans. Biomed. Eng. 61 (5), 1482-1496 (2014).
- Turner, A. E. B., Yu, C., Bianco, J., Watkins, J. F., Flynn, L. E. The Performance of Decellularized Adipose Tissue Microcarriers as an Inductive Substrate for Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 33 (18), 4490-4499 (2012).
- Brown, C. F. C., Yan, J., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Effect of Decellularized Adipose Tissue Particle Size and Cell Density on Adipose-Derived Stem Cell Proliferation and Adipogenic Differentiation in Composite Methacrylated Chondroitin Sulphate. Biomed. Mater. 10 (4), 1-12 (2015).
- Cheung, H. K., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Watkins, J. F., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Composite Hydrogel Scaffolds Incorporating Decellularized Adipose Tissue for Soft Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 35 (6), 1914-1923 (2014).
- Almeida, H. V., Eswaramoorthy, R., Cunniffe, G. M., Buckley, C. T., O'Brien, F. J., Kelly, D. J. Fibrin Hydrogels Functionalized with Cartilage Extracellular Matrix and Incorporating Freshly Isolated Stromal Cells as an Injectable for Cartilage Regeneration. Acta Biomat. 36, 55-62 (2016).
- Wassenaar, J. W., Braden, R. L., Osborn, K. G., Christman, K. L. Modulating in vivo Degradation Rate of Injectable Extracellular Matrix Hydrogels. J. Mater. Chem. B. 4 (16), 2794-2802 (2016).
- Ugerleider, J. L., et al. Extracellular Matrix Hydrogel Promotes Tissue Remodeling, Arteriogenesis, and Perfusion in a Rat Hindlimb Ischemia Model. JACC Basic Transl. Sci. 1 (1-2), 32-44 (2015).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Eng. Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Pati, F., et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular. Matrix Bioink. Nat. Commun. 5, 3935 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D Cell Culture Systems - Advantages and Applications. J. Cell. Phys. 230 (1), 16-26 (2015).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. Three-dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. Tissue Eng Part B, Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The Third Dimension Bridges the Gap Between Cell Culture and Live Tissue. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Bouet, G., Marchat, D., Cruel, M., Malaval, L., Vico, L. In Vitro Three-Dimensional Bone Tissue Models: From Cells to Controlled and Dynamic Environment. Tissue Eng. Part B Rev. 21 (1), 133-156 (2015).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene Expression Perturbation in vitro - A Growing Case for Three-Dimensional (3D) Culture Systems. Sem. Cancer Biol. 15 (5), 405-412 (2005).
- Bonnier, F., et al. Cell Viability Assessment Using the Alamar Blue Assay: A Comparison of 2D and 3D Cell Culture Models. Toxicology in vitro. 29 (1), 124-131 (2015).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The Extracellular Matrix at a Glance. J. Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential Effects of Tissue Culture Coating Substrates on Prostate Cancer Cell Adherence, Morphology and Behavior. PLoS ONE. 9 (11), e112122 (2014).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified Three-Dimensional Culture System for Long-Term Expansion of Embryonic Stem Cells. World J. Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Flynn, L. E. The Use of Decellularized Adipose Tissue to Provide an Inductive Microenvironment for the Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Yu, C., et al. Porous Decellularized Adipose Tissue Foams for Soft Tissue Regeneration. Biomaterials. 34 (13), 3290-3302 (2013).
- Turner, A. E. B., Flynn, L. E. Design and Characterization of Tissue-Specific Extracellular Matrix-Derived Microcarriers. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (3), 186-197 (2012).
- Russo, V., Omidi, E., Samani, A., Hamilton, A., Flynn, L. E. Porous, Ventricular Extracellular Matrix-Derived Foams as a Platform for Cardiac Cell Culture. Biores Open Access. 4 (1), 374-388 (2015).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Eng. Part C, Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Owen, S. C., Fisher, S. A., Tam, R. Y., Nimmo, C. M., Shoichet, M. S. Hyaluronic Acid Click Hydrogels Emulate the Extracellular Matrix. Langmuir. 29 (24), 7393-7400 (2013).
- Zargham, S., Bazgir, S., Tavakoli, A., Rashidi, A. S., Damerchely, R. The Effect of Flow Rate on Morphology and Deposition Area of Electrospun Nylon 6 Nanofiber. J. Eng. Fibers Fabr. 7 (4), 42-49 (2012).
- Gryshkov, O., Pogozhykh, D., Zernetsch, H., Hofmann, N., Mueller, T., Glasmacher, B. Process Engineering of High Voltage Alginate Encapsulation of Mesenchymal Stem Cells. Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl. 36, 77-83 (2014).
- Turco, B. Characterization and Cell-Seeding of Decellularized Adipose Tissue Foams for Wound Healing. , Queen's University. Kingston, Ontario, Canada. (2014).
- Steven, F. S. The Nishihara Technique for the Solubilization of Collagen. Application To the Preparation of Soluble Collagens From Normal and Rheumatoid Connective Tissue. Ann. Rheum. Dis. 23, 300-301 (1964).
- Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J., Karsdal, M. A. The Importance of Extracellular Matrix for Cell Function and in vivo Likeness. Exp. Mol. Pathol. 98 (2), 286-294 (2015).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D Cell Culture Opens New Dimensions in Cell-Based Assays. Drug Discov. Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Liao, J., Guo, X., Grande-Allen, K. J., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Bioactive Polymer/Extracellular Matrix Scaffolds Fabricated with a Flow Perfusion Bioreactor for Cartilage Tissue Engineering. Biomaterials. 31 (34), 8911-8920 (2010).
- Choi, Y. C., Choi, J. S., Woo, C. H., Cho, Y. W. Stem Cell Delivery Systems Inspired by Tissue-Specific Niches. J. Control. Release. 193, 42-50 (2014).
- Han, T. T. Y., Toutounji, S., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Adipose-Derived Stromal Cells Mediate in vivo Adipogenesis , Angiogenesis and Inflammation in Decellularized Adipose Tissue Bioscaffolds. Biomaterials. 72, 125-137 (2015).
- Yu, C., Kornmuller, A., Flynn, L. E. Porous Decellularized Extracellular Matrix Microcarriers for Tissue-Specific Cell Expansion and Delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. , (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. J. Food Sci. 81 (1), C27-C34 (2016).
- Lin, H., Yang, G., Tan, J., Tuan, R. S. Influence of Decellularized Matrix Derived from Human Mesenchymal Stem Cells on their Proliferation, Migration and Multi-Lineage Differentiation Potential. Biomaterials. 33 (18), 4480-4489 (2012).
- Fonte, P., Reis, S., Sarmento, B. Facts and Evidences on the Lyophilization of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery. J. Control. Release. 225, 75-86 (2016).
