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Bioengineering

一个 doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

椎间盘(IVD)的整个器官培养保留天然的细胞外基质,细胞的表型,和细胞 - 基质相互作用。在这里我们将介绍使用鼠标腰部,并在其脊柱功能单位尾椎的IVD并利用该系统的几个应用的IVD文化体系。

Abstract

椎间盘(IVD)变性是一个显著贡献腰痛。体外诊断是用于传输和抑制负荷在脊椎关节的纤维软骨。的IVD由富含蛋白聚糖髓核(NP)和通过软骨端板夹在中间的富胶原蛋白的纤维环(AF)的。连同相邻椎骨,椎骨-IVD结构形成功能性脊柱单元(FSU)。这些微结构包含独特的细胞类型,以及独特的细胞外基质。的FSU的整个器官培养保留天然的细胞外基质,细胞分化的表型,和细胞 - 基质相互作用。因此,器官培养技术是用于研究IVD的复杂生物学机制是特别有用的。在这里,我们描述了整个培养腰鼠标FSU的,它为研究疾病机理和治疗的IVD的理想平台的高通量方法。此外,我们描述了小号利用此器官培养方法进行进一步的研究,其中包括对比增强显微CT成像和IVD的三维高分辨率有限元建模everal应用程序。

Introduction

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腰痛(LBP)是全球残疾和工作场所的主导因素生产力损失,以及单独的美国人超过50十亿美元花费在治疗腰痛1。虽然普遍,LBP的病因仍然是复杂和多因素。然而,椎间盘(IVD)退变是LBP 2最显著的危险因素之一。

的IVD由三个微观结构:外纤维环(AF)中,内部髓核(NP),以及近端和远端3夹住整个结构的两个端板软骨。与衰老和变性,所述IVD部件结构上发生变化,在组成上,并机械4。这些变化包括在NP蛋白聚糖和水合的损失,椎间盘高度降低,恶化机械能力5。这些改变是常伴促进炎症反应,以及嗜中性粒细胞和背根神经节侵入到关节间隙中,导致LBP症状6事件的级联最终细胞因子。

研究IVD变性的机制是在人类中具有挑战性,因为它往往是不可能的腰背痛发生前到变性的原因隔离。因此,简化了实验系统下到IVD器官的还原方法允许原因变量的机械微调和检查其下游效应5。该系统被减少到只有天然细胞群和周围的细胞外基质,从而使的外部刺激对IVD退化的影响的直接解释。此外,更低的成本和小鼠模型的可扩展性,以及大量的转基因动物7,允许吨体外诊断退行性机制和潜在的治疗,他迅速有针对性的筛选。在这里,我们描述了其中IVD细胞和组织稳定性被保持超过21天,给予体外诊断稳态,机械,结构,和炎性样式向特定焦点鼠器官培养系统。使用这种方法,我们重点监测的体外诊断试剂在刺致损伤模型8功能的改变,了解背后的椎间盘退变的机制。此外,我们描述这个器官培养方法的几个应用程序,以进行进一步的研究,包括对比增强显微CT成像和IVD的三维高分辨率模型。

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Protocol

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所有的动物实验均按照圣路易斯动物研究委员会的华盛顿大学进行。

1.动物

  1. 获得的小鼠的两个菌株:10周龄的BALB / C(N = 6,BALB-M,BALB / cAnNTac)和10周龄核因子kappa-B-萤光素酶报道动物(NF-κβ-LUC)饲养在的BALB / c背景(N = 6,BALB / C-TG(RELA-LUC)31Xen)。
  2. 之前夹层,在2.5-3升/分钟的流速进行5分钟,然后停留时间的另外的2分钟安乐死与CO 2过量的动物。
  3. 通过在70%乙醇浴洗澡它解剖前2分钟消毒动物的外侧区域。

2.解剖

  1. 使用小清扫剪刀,以暴露所述体腔的小鼠的背部表面上的纵向垂直切割。
  2. 就从开始的动物的脊椎两侧有两条纵向垂直切割所述第一腰椎(L1)到尾椎(C8)。
  3. 使用手术刀,细镊子和精细解剖剪刀,小心地从动物的体腔移除L1-C8脊椎。
  4. 小心地移除脊柱过量软组织,同时确保不刮擦或损伤的腹侧的IVD。
  5. 进一步解剖脊柱到在L1 / L2,L3 / L4,L5 / L6,C3 / C4,C5 / C6和C7 / C8光盘椎骨盘-椎骨脊柱功能装置(FSU)。
  6. 冲洗FSU的在补充有1% - 链霉素青霉素2分钟Hank平衡盐溶液中。
  7. 随机指定的FSU的分成三组:未培养的和未处理的FSU的(新鲜),培养的但未治疗FSU的(对照),并培养和刺处理FSU的(刺)。
  8. 卡扣冻结在-20℃的冰箱中解剖和存储后立即新鲜FSU样品用液氮。

3.器官培养条件

  1. 制备500毫升的无菌培养介质的1:1的Dulbecco改良的Eagle培养基:营养混合物F12(DMEM:F12),补充有20%胎牛血清(FBS)和1%青霉素 - 链霉素。
  2. 用10个毫升血清移液管,移液管2毫升培养基在24孔培养板的每个孔中。
  3. 继清扫和冲洗,将每个FSU到个体以及在填充介质的24孔板。
  4. 孵育在维持37℃,5%CO 2,20%O 2和> 90%的湿度的无菌恒温箱中的样本。
  5. 24个小时的初始培养期后,通过机械地使用无菌27号针头, 如图1A中的纤维环的针穿刺伤害刺组的样品。
  6. 通过准备新的填充介质的24孔培养板更换介质每48个小时,并转移样品从旧板到新的使用无菌镊子。吸出旧媒体和dispos在生物危险废物箱旧文化板电子。
  7. 在培养的最后一天,在孵化介质含有0.75毫克/毫升硝基蓝四唑氯化物24小时的所有样本。
  8. 之后,冻结的所有FSU的用液氮并将其存放在-20℃冰箱中,直到准备用于机械试验或组织学( 图1B)。

4.纵向测量NF-κB

  1. 图像的FSU的从NF-κβ萤光素酶在动物1,5,13,和19天评估NF-κB表达。
  2. 在37℃下加入1毫克/毫升荧光素溶液10μL至每个孔,并孵育在无菌恒温箱中10分钟。
  3. 图像使用成像系统,具有1分钟的曝光时间和第2箱设置用于生物发光的样品。
  4. 同时,使用本机拍摄照片,并用生物发光图像覆盖它,以确定在IVD发光的解剖位置。
  1. 通过使用位移控制动态压缩9确定体外诊断的机械性能。
  2. 使用解剖显微镜,解剖刀,和镊子,同时保持软骨终板完好并连接到IVD从每个样品取出FSU的骨椎体。
  3. 附加的分离的体外诊断用氰基丙烯酸酯胶1厘米×1cm的×0.2cm的铝板。
  4. 通过采取三次测量的平均使用激光千分尺每个盘的纵向轴线测量的盘的高度和宽度。由最大的光盘宽度除以平均盘高度计算椎间盘高度比率。
  5. 使用所测量的盘高度来计算机械测试中使用的输入应变值。另外,平均盘高度约为690微米±39微米。
  6. 将磷酸缓冲盐水浴的样品compressi下上机和预加载光盘0.02 N.
  7. 在1Hz循环压缩使用正弦波形的光盘为在1%的应变水平20个循环和5%的应变水平为3次试验的每个并记录IVD的负载和位移值。允许试验之间休息时间用于盘放松和防止损伤的10分钟。
  8. 计算从上次周期的加载阶段的平均硬度,并计算从负载和位移数据之间的相位角的损耗角正切。

6.蛋白聚糖和胶原蛋白的定量

  1. 以下机械测试,通过将所述分离的IVD在预配衡的离心管中,并用分析天平测量重量测量盘湿重。
  2. 消化分离的IVD在250μl木瓜蛋白酶消化溶液(0.1M醋酸钠,0.01M EDTA,0.005M的盐酸半胱氨酸,pH值6.4),使用块加热器在65℃下过夜。
  3. 10分钟离心分离的样品在2000 XG并收集上清液。
  4. 通过使用二甲基亚甲蓝(DMMB)与硫酸软骨素标准测定法测量的IVD的蛋白多糖含量。
  5. 制备DMMB溶液(21毫克DMMB,5毫升无水乙醇中,在1升的DDH 2 O2克甲酸钠)。
  6. 移液管的标准30μL和样品中,在96孔板中一式三份,用在每个DMMB溶液250μL以及沿。
  7. 读板的吸光度在用分光光度计525纳米。
  8. 测量使用根据制造商的说明书一羟脯氨酸测定试剂盒的胶原含量。

7.组织学

  1. 固定的样品在4%多聚甲醛的子集24个小时,在5%甲酸去钙化48个小时,用乙醇脱水,并在石蜡中嵌入。
  2. 使用切片机,部分样品在矢状位10米微米厚,并应用部分,以载玻片上。染色使用番红O /快Gr而部分EEN和DAPI。
  3. 使用光学显微镜,图像滑动在10X放大倍数。

8.对比增强microComputed断层摄影术(微CT)

  1. 在使用纵向碘佛醇对比度增强10,和终端磷钼酸(PMA)对比度增强在7天时间点的0,2,5,和7天的时间点扫描样品的一个子集。
  2. 之前微CT扫描时间4个小时,在37℃下添加350毫克/毫升碘佛醇溶液到培养基为大约50毫克/毫升含碘碘佛醇溶液的最终浓度300μL,并培育在无菌恒温箱中4 H。
  3. 温育后,包装在1毫升微量离心管中在无菌纱布和代替样品。
  4. 在微CT系统的地方样品和扫描在45 keVp,177μA,10.5微米体素尺寸,和300毫秒的整合。
  5. 从微型电脑为DICOM文件导出数据和使用软件的可视化(
  6. 在7天的时间点,固定使用24小时4%多聚甲醛溶液,接着用5%PMA溶液3天的样品,和扫描使用相同的设置与在步骤8.4中使用。

9.三维有限元建模

  1. 段使用的软件有手动阈值( 例如 ,OsiriX)的体外诊断试剂的DICOM文件。
  2. 转换IVD的NP和AF卷成使用Meshlab基于体素的有限元网格。
  3. 结合NP和AF的微结构,以形成一个完整的IVD​​和在有限元软件应用通过实验确定的边界条件。

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Representative Results

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图2-3示出的蛋白聚糖分布,NF-κB表达,刚度,粘度,椎间盘高度,和湿重为培养的小鼠体外诊断的代表性结果。如果适当地培养,对照组的IVD参数不应该从新鲜组显著不同。如果培养物感染或以其它方式受损,对照组将从新鲜组不同,特别是在NF-κB表达和蛋白聚糖分布(未示出结果)。 器官培养的使用对比增强显微CT获得IVD的三维模型4-5示出的应用程序;进一步,有限元建模可以应用到这些结构,以确定组织的应力和应变分布由于全球机械行为。

图1
图1.实验概述。 (A)的椎间盘脊柱功能装置(FSU)中从腰部和尾部段解剖;该浮储装置包含了两个完整椎骨,软骨终板和椎间盘。 (B)按照解剖,将样品分为治疗组和在体外培养 21天。之后,被用于机械测试和生化测定样品的一个子集,而被用于组织学分析的样品的另一个子集。 请点击此处查看该图的放大版本。

图1
图2.组织学和NF-κB表达。 (A)在培养21天后,番红O染色(红色)显示了蛋白多糖含量保持在这两个AF和NP的对照样品英寸(B)对扣样品(由箭头指示的穿刺部位)同时在AF和NP显示出降低的蛋白多糖含量。 (C)四唑蓝染色(蓝色)表示共定位。 (D)DAPI染色显示细胞代谢活性和之后的器官培养21天后存活的。对照和刺样品中的(E)NF-κB表达还表明,IVD是可行的并响应于它的环境。刺样品已在1,5,13增加NF-κB表达,和19天的时间点。腰椎体外诊断显示在这里。 请点击此处查看该图的放大版本。

图1
图3.力学和组合物。B)机械测试表明,在1%和5%的应变水平,刺样品刚度和损耗角正切值相对于对照样品降低。 (C - D)生化实验表明,在组成上,刺样品具有较低的蛋白聚糖和胶原蛋白含量(归一化到湿重)相对于对照样品。 (E - F)在结构上,刺样品具有减少盘高度比和相对重量湿控制。机械,组成,并且在结构上,新鲜的和对照样品值不彼此显著不同。 请点击此处查看该图的放大版本。

图1
图4.对比增强显微CT visualizat离子。对比度增强的显微CT可用于在培养期间显现在三维的IVD。尾部的IVD在这里显示。差分碘佛醇到AF(较低的衰减)和NP(高衰减)的结合允许人们从NP区分AF。相反地​​,PMA优先结合在AF(更高的衰减),端板,和脊索胶原残基。图像用的颜色,使得白色表示高衰减,黄色代表介质衰减可视化,并且红色代表低衰减。 (A - E)的IVD在0天,第2,第5和7与对比碘佛醇矢状视图,然后用PMA对比度。 (F - J)在0天,第2,第5的IVD的横向视图,和图6与碘佛醇对比度,并且用PMA对比度。尾部的IVD在这里显示。 请点击此处查看拉rger版本这个数字。

图1
的IVD结构的图5的有限元建模(FEM)。有限元分析是一个强大的数学工具,它允许本地材料应对更大的边界条件的计算。例如,(A)的NP可以单独从(B)的AF呈现,并且每个隔室可被分配唯一的组成性质。 (C)的组合与两个AF和NP IVD结构如图3D。当轴向负载施加到盘上的上部端板与下部端板是一个固定的边缘,我们可以确定的应力和应变的局部浓度。黄色点和黑箭头表示被施加一节点的负载。 请点击这里查看更大的版本这个数字。

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Discussion

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该协议概述了监测在IVD的生物变化鼠FSU的重点器官培养。这些文化的成功维护需要仔细无菌操作技术。特别地,解剖步骤2.1-2.6和培养步骤3.1-3.6需要特别小心,以确保保持在无菌条件,并且这些步骤应当在分离的过程室具有HEPA气流以减少污染物优选进行。由于解剖过程导致的创伤组织中,在3.5的24小时的预处理周期是必需的所有处理组,包括对照。生存力测定法可以用于确保样品是活的,未污染的,并且还用作一个确认细胞动态平衡被保持。该NF-κB发光读数也可用于纵向监测培养FSU的的炎性反应;增加NF-κB快递培养可以指示FSU的期间离子被污染或以其他方式在压力下从感染11,并且我们因此这里包括它作为一种可能的故障排除步骤。最后,比较于新鲜基团作为额外的检查点在组织学和机械性能的控制培养的样品。这种文化技术适用于每盘多个样本,并根据我们的经验,在24孔板多达24个样品可以很容易地完成。然而,样品的复用也传播交叉污染的风险,因此,建议FSU的被故障诊断过程中在单独的平板上培养。此外,虽然这个协议提供了21天的培养期间的说明,可用于那些更长或更短培养周期相同的方法。 FSU的已经通过我们的实验室已经成功培养培养时间从1周到5周。

大号IKE所有车型,在小鼠器官培养模型有局限性,特别是在他们捕捉到人类的加载条件的能力。也有鼠和人的IVD 12之间的几何形状的细微差别,以及人类双足与脊柱主要轴向载荷,而老鼠是四足动物。然而,由于培养条件在其当前形式相对卸载,装载模式很可能不影响了体外诊断。其他系统,例如牛IVD器官培养模型13,14可以是更适合于机械和装载相互作用。今后的工作将包括负载条件,使机械和环境因素之间的相互作用mechanobiological的调查。这种方法的力量在于它的一致性,灵活性和能力高分辨率成像。在这里我们的做法表明,它是可能的文化bOTH腰椎和尾椎体外诊断试剂,但要注意,这些光盘是整个老龄化与发展15解剖学上的不同是很重要的。因此,我们的实验设计 - 随机腰椎和尾椎分开水平。

对比度增强的显微CT允许高分辨率,无损的IVD的三维成像。不同的造影剂可以用来突出IVD的不同组成方面。我们在这里说明使用碘佛醇,含碘的非细胞毒性亲水剂10,和磷钼酸(PMA),螯合到胶原的氨基残基的重金属分子。使用这些对比剂,在IVD微观结构特征可以高亮显示和识别。碘佛醇区分IVD组织的相对水合,从而提供了富含水的髓核和不太水合纤维环之间的对比度。对PMA提供组织相对胶原组合物的分化和将突出端板,纤维环,和脊索。碘佛醇可以在培养过程中被用来确定在水合的纵向变化,而PMA可以在培养的终点被施加到IVD监测胶原变化。

该技术的未来应用包括利用转基因和基因敲除小鼠的其他菌株了解其他疾病IVD变性的不同方面。此外,对于共培养与其他器官系统和细胞,例如背根神经节,以确定可以向IVD变性交互的潜在的平台。

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Disclosures

这个手稿的作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作是由华盛顿大学骨骼肌肉研究中心(NIH P30 AR057235),分子影像中心(NIH P50 CA094056),力学生物学培训资助(NIH 5T32EB018266),美国国立卫生研究院R21AR069804和NIH K01AR069116支持。笔者想感谢帕特里克·黄为他的数据收集捐款。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

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References

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一个<em&gt;体外</em鼠类的椎间盘&gt;器官培养模型
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Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

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