Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Een doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

Hele orgelcultuur van de tussenwervelschijf (IVD) behoudt het natieve extracellulaire matrix, celfenotypen en cellulaire-matrix interacties. Hier beschrijven we een IVD cultuur systeem met behulp van de muis lumbale en caudale IVD's in hun functionele spinale-eenheden en een aantal applicaties door middel van dit systeem.

Abstract

Tussenwervelschijf (IVD) degeneratie is een belangrijke bijdrage aan lage rugpijn. De IVD is een fibrocartilagineus gewricht dat dient voor het verzenden en temperen lasten in de ruggengraat. De IVD bestaat uit een proteoglycan-rijke nucleus pulposus (NP) en een collageenrijke annulus fibrosis (AF) kern met kraakbeenachtige eindplaten. Samen met de aangrenzende wervels, de wervels IVD-structuur vormt een functionele ruggengraatgedeelte (FSU). Deze microstructuren bevatten unieke celtypes evenals unieke extracellulaire matrices. Hele orgelcultuur van de FSU behoudt de natieve extracellulaire matrix, celdifferentiatie fenotypes en cellulaire-matrix interacties. Zo orgelcultuur technieken zijn bijzonder nuttig voor het onderzoeken van de complexe biologische mechanismen van het IVD. Hier beschrijven we een high-throughput benadering voor het kweken van hele lumbale muis FSU dat een ideaal platform voor het bestuderen van de ziekte mechanismen en therapieën voor de IVD biedt. Verder beschrijven we several toepassingen die dit orgelcultuur methode om verdere studies met inbegrip van contrast-versterkte microCT imaging en drie-dimensionale high-resolution eindige elementen modellering van de IVD voeren benutten.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lage rugpijn (LBP) is de belangrijkste factor voor de wereldwijde invaliditeit en verlies van productiviteit op de werkplek, en de Amerikanen alleen door te brengen van meer dan 50 miljard dollar op LBP behandeling 1. Hoewel voorkomende, de etiologie van LBP blijft complexe en multifactoriële. Echter, tussenwervelschijf (IVD) degeneratie is een van de belangrijkste risicofactoren voor LBP 2.

De IVD bestaat uit drie microstructuren: het uitwendige annulus fibrosis (AF), het binnenste nucleus pulposus (NP), en twee kraakbeenachtige eindplaten die de hele structuur proximaal en distaal 3 sandwich. Ouderdomsgebonden degeneratie, de IVD componenten te vervangen structuur, samenstelling en mechanisch 4. Deze wijzigingen omvatten het verlies van proteoglycanen en vocht bij de NP, verminderde schijfhoogte en verslechterde mechanische competentie 5. Deze wijzigingen zijnvaak vergezeld van cytokines die een ontstekingsreactie, en neutrofielen en dorsale wortel ganglion binnendringing in de gewrichtsruimte afgesloten met een cascade van gebeurtenissen die leiden tot symptomen LBP 6 bevorderen.

Het bestuderen van de mechanismen van IVD-degeneratie is een uitdaging in de mens, omdat het vaak niet mogelijk om de oorzaak van de degeneratie te isoleren vóór het optreden van lage rugpijn. Aldus is een reductionistische benadering van vereenvoudiging van het experimentele systeem naar het IVD orgaan maakt mechanistische afstemming van causale variabelen en behandeling van hun downstream effecten 5. Het systeem wordt verminderd tot de natieve celpopulatie en de omliggende extracellulaire matrix, waardoor de directe interpretatie van de effecten van externe stimuli op IVD degeneratie. Bovendien zijn de lagere kosten en schaalbaarheid van knaagdiermodellen, alsmede het grote aantal genetisch gemodificeerde dieren 7, mogelijk maken thij snelle en gerichte screening van IVD degeneratieve mechanismen en mogelijke therapieën. We beschrijven hier een murine orgaan kweeksysteem waarin IVD cellulaire en weefselstabiliteit wordt gedurende 21 dagen, met bijzondere aandacht geschonken aan homeostatische, mechanische, structurele en inflammatoire patronen het IVD. Met behulp van deze methode, monitoren we functionele veranderingen van de IVD's in een stab geïnduceerd letsel model 8 tot en met de mechanismen achter disc degeneratie te begrijpen. Verder beschrijven we een aantal toepassingen van deze orgelcultuur methode om verdere studies met inbegrip van contrast-versterkte microCT imaging en drie-dimensionale high-resolution modellering van de IVD te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Washington University in St. Louis Comité Animal Studies.

1. Dieren

  1. Krijgen twee muizenstammen: 10 weken oude BALB / c (n = 6 BALB-M, BALB / cAnNTac) en 10-weken oude nuclear factor kappa-B-luciferase reporter dieren (NF-κβ-luc) gekweekt op een BALB / c achtergrond (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
  2. Voorafgaand aan dissectie, euthanaseren dieren met CO2 overdosis met een stroomsnelheid van 2,5-3 l / min gedurende 5 min gevolgd door nog eens 2 min verblijftijd.
  3. Ontsmet het buitengebied van het dier door te baden in een 70% ethanol bad gedurende 2 min vóór dissectie.

2. Dissection

  1. Voeg een verticale snee in het dorsale oppervlak van de muis met behulp van kleine dissectie schaar om de lichaamsholte bloot.
  2. Maak twee verticale insnijdingen aan weerszijden van de ruggegraat van het dier vanafde eerste lumbale wervels (L1) naar de staartwervels (C8).
  3. Met behulp van een scalpel, fijne tang en fijne dissectie schaar voorzichtig de rug van L1-C8 verwijderen uit het lichaam van het dier holte.
  4. Verwijder voorzichtig overtollige zachte weefsels rond de wervelkolom en tegelijkertijd niet schrapen of verwonden IVD aan de buikzijde.
  5. Verdere ontleden de wervelkolom wervels in-disc-wervels functionele spinale eenheden (FSU) en L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 en C7 / C8 discs.
  6. Spoel de FSU in Hank's gebalanceerde zoutoplossing, aangevuld met 1% penicilline-streptomycine gedurende 2 min.
  7. Willekeurig de FSU toewijzen in drie groepen: onbeschaafde en onbehandelde FSU (vers), beschaafd maar onbehandelde FSU (Control) en gekweekt en steek behandeld FSU (Stab).
  8. Snap bevriezing van de FSU Verse monsters met vloeibare stikstof onmiddellijk na de dissectie en op een -20 ° C vriezer.

3. Organ kweekomstandigheden

  1. Bereid 500 ml steriel kweekmedium van 1: 1 Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12) aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Gebruik 10 ml serologische pipetten, pipette 2 ml kweekmedium in elk putje van een 24-putjes kweekplaat.
  3. Na dissectie en spoel is zet FSU in een individu goed in de media-gevulde plaat met 24 putjes.
  4. Incubeer de monsters in een steriele incubator die onderhoudt 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 en> 90% vochtigheid.
  5. Na een kweekperiode van 24 uur mechanisch verwonden Stab groep monsters door naaldpunctie van de annulus fibrosus met een steriele 27-gauge naald zoals weergegeven in figuur 1A.
  6. Verander media elke 48 uur met de voorbereiding van een nieuwe-media gevulde 24-well cultuur plaat, en de overdracht monsters uit de oude plaat naar de nieuwe met behulp van steriele pincet. Zuig het oude media en dispose van de oude cultuur plaat in een biologisch gevaarlijk afvalbak.
  7. Op de laatste dag van de cultuur, incubeer alle monsters in medium dat 0,75 mg / ml nitro blue tetrazolium chloride gedurende 24 uur.
  8. Daarna bevriezen alle FSU met vloeibare stikstof en op een -20 ° C vriezer tot gereed voor mechanisch testen of histologie (Figuur 1B).

4. Longitudinale Metingen NF-KB

  1. Beeld de FSU van NF-κβ-luciferase dieren 1, 5, 13 en 19 dagen NF-KB expressie te evalueren.
  2. Voeg 10 ul van 1 mg / ml luciferine-oplossing aan elk putje en incuberen in een steriele incubator bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
  3. Afbeelding de monsters voor bioluminescentie via het beeldvormingssysteem met een 1 min belichtingstijd en Bin omgeving van 2.
  4. Gelijktijdig gebruik van de machine om een ​​foto te nemen en overlay beeld bioluminescentie met de anatomische locatie van luminescentie bepalen de IVD.
  1. Bepaal het mechanische gedrag van de IVD door verplaatsing gestuurde dynamische compressie 9.
  2. Met behulp van een dissectie microscoop, scalpel en pincet, verwijder de benige wervellichamen van de FSU van elk monster terwijl de kraakbeenachtige eindplaten intact en verbonden aan de IVD.
  3. Bevestig de geïsoleerde IVD een 1 cm x 1 cm x 0,2 cm aluminiumplaat gebruikt cyanoacrylaatlijm.
  4. Meet de disc hoogte en breedte door het nemen van een gemiddelde van drie metingen op de lengteas van elke schijf met een laser micrometer. Bereken de schijf hoogteverhouding door deling van de gemiddelde discushoogte de maximale breedte disc.
  5. Met de gemeten discushoogte aan de ingang spanningswaarden gebruikt in mechanische testen berekenen. Merk op dat de gemiddelde discushoogte ongeveer 690 pm ± 39 pm.
  6. Plaats de monsters in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing bad onder de compressiop de machine en vooraf het disc tot 0,02 N.
  7. Cyclisch comprimeren de disc met een sinusvormige golfvorm bij 1 Hz gedurende 20 cycli bij de 1% spanningsniveau en 5% rek niveau 3 proeven per en noteer de lading en verplaatsingswaarden van de IVD. Laat 10 min rusttijden tussen proeven voor de schijf te ontspannen en om letsel te voorkomen.
  8. Bereken de gemiddelde stijfheid van de oplaadfase van de laatste cyclus, en bereken de verliestangens van de fasehoek tussen lading en verplaatsingsdata.

6. proteoglycan en collageen kwantificering

  1. Na mechanische testen, meet de schijf natgewicht door het plaatsen van de geïsoleerde IVD in een vooraf getarreerde centrifugebuis en meten van het gewicht met behulp van een analytische balans.
  2. Digest het geïsoleerde IVD in 250 pl papaïne digestie-oplossing (0,1 M natriumacetaat, 0,01 M EDTA, 0,005 M cysteïne-HCl, pH 6,4) gedurende de nacht bij 65 ° C met een blokverwarming.
  3. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minbij 2.000 xg en verzamel de bovenstaande vloeistof.
  4. Meet de proteoglycaangehalte van de IVD met de dimethylmethyleenblauw (DMMB) test met chondroïtinesulfaat normen.
  5. Bereid DMMB oplossing (21 mg DMMB, 5 ml absolute ethanol, 2 g natriumformiaat in 1 L DDH 2 O).
  6. Pipetteer 30 ul van standaarden en monsters in drievoud in een 96-putjesplaat, samen met 250 pl DMMB oplossing in elk putje.
  7. Lees de absorptie van de plaat bij 525 nm met behulp van een spectrofotometer.
  8. Meet het collageengehalte hydroxyproline behulp van een testkit volgens de instructies van de fabrikant.

7. Histologie

  1. Bevestig een subset samples in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, de-verkalken in 5% mierenzuur gedurende 48 uur, dehydrateren met ethanol en in paraffine insluiten.
  2. Met behulp van een microtoom gedeelte monsters sagittaal 10 urn dikte en secties toepassing op glazen objectglaasjes. Vlekken op de secties met behulp van Safranine-O / Fast GrEén en DAPI.
  3. Met behulp van een lichtmicroscoop, beeld schuift bij 10x vergroting.

8. Contrast-versterkte Microcomputed Tomography (microCT)

  1. Scant een subset samples op 0, 2, 5 en 7 dagen tijdstippen via longitudinale ioversol contrastverbetering 10 en terminal fosfomolybdeenzuur (PMA) contrastverbetering op 7 dagen tijdstip.
  2. 4 h voorafgaand aan microCT aftasttijd, voeg 300 ul 350 mg / ml jodium ioversol oplossing aan het kweekmedium om een ​​eindconcentratie van ongeveer 50 mg / ml jodium bevattende ioversol oplossing en incuberen in een steriele incubator bij 37 ° C gedurende 4 h.
  3. Na incubatie wikkel het monster in steriel gaas en in een 1 ml microcentrifugebuis.
  4. Leg monsters in het microCT systeem scannen 45 keVp, 177 pA, 10,5 urn voxelafmeting en 300 ms integratie.
  5. Gegevens exporteren vanuit de microCT als DICOM-bestanden en te visualiseren met behulp van software (
  6. Aan het 7-daagse tijdstip, vaststellen monsters met een 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, gevolgd door 5% PMA gedurende 3 dagen en scannen met de instellingen die waren gebruikt in stap 8.4.

9. Three Dimensional Finite Element Modeling

  1. Segment de DICOM-bestanden van de IVD met behulp van software met handmatige drempelwaarden (bijv OsiriX).
  2. Zet de NP en AF volumes van de IVD in voxel-gebaseerde eindige elementen mazen gebruik Meshlab.
  3. Combineer de microstructuren van de NP en AF een volledige IVD vormen en experimenteel bepaalde randvoorwaarden gelden de eindige elementen software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuren 2-3 tonen representatieve resultaten van proteoglycan distributie NFKB expressie, stijfheid, viscositeit, schijfhoogte en nat gewicht voor gekweekte muizen IVD. Als dit goed wordt gekweekt, moet de IVD-parameters van de controlegroep niet significant verschillend van de Fresh groep. Wanneer de kweek geïnfecteerd of anderszins aangetast, zal de Controlegroep verschillen van de verse groep, vooral bij NF-KB expressie en distributie proteoglycan (resultaten niet getoond). Figuren 4-5 tonen toepassingen van orgaankweek het gebruik contrastmiddel microCT een driedimensionaal model van de IVD verkrijgen; Verder kan eindige elementen modellering worden toegepast op deze structuren weefselspanning en vervormingen te bepalen door de wereldwijde mechanisch gedrag.

Figuur 1
Figuur 1. Experimenteleoverzicht. (A) Tussenwervelschijf functionele spinal units (FSU) werden uitgesneden uit de lumbale en caudale segmenten; de FSU bevatte twee intacte wervels, het kraakbeenachtige eindplaten en de tussenwervelschijf. (B) Na dissectie werden monsters verdeeld in behandelingsgroepen en gekweekt in vitro gedurende 21 dagen. Daarna een subset samples gebruikt voor mechanisch testen en biochemische assays, terwijl een andere deelverzameling van monsters voor histologische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 1
Figuur 2. Histologie en NFKB expressie. (A) Na 21 dagen in cultuur, Safranine O kleuring (rood) laat zien dat proteoglycaangehalte wordt gehandhaafdin zowel AF en NP in de controlemonsters. (B) De Stab monsters (prikplaats aangegeven door pijl) vertoonden verminderde proteoglycaangehalte in zowel AF en NP. (C) Tetrazolium blue kleuring (blauw) toont co-lokalisatie. (D) DAPI kleuring toont aan dat cellen metabolisch actief en levensvatbaar na 21 dagen in orgelcultuur. (E) NFKB expressie in zowel de controle en Stab samples ook aan dat de IVD levensvatbaar is en reageert op zijn omgeving. De monsters Stab toegenomen NFKB expressie op 1, 5, 13 en 19 dagen tijdstippen. Lumbale IVD's worden hier getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 1
Figuur 3. mechanica en samenstelling. ( B) Mechanische beproeving toonde aan dat de 1% en 5% rekniveaus, Stab monster stijfheid en verliestangens waarden lager ten opzichte van controle monsters. (C - D) Biochemische analyses toonden aan dat samenstelling, Stab monsters hadden lagere proteoglycanen en collageen (genormaliseerd naar gewicht nat) ten opzichte van controle monsters. (E - F) Structureel Stab monsters hadden een verlaagde disc hoogteverhouding en natgewicht opzichte van controles. Mechanisch, samenstelling, en structureel, Fresh and Control monsters waarden waren niet significant verschillend van elkaar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 1
Figuur 4. Contrast-versterkte microCT visualization. Contrastmiddel microCT kan worden gebruikt om de IVD driedimensionaal visualiseren gedurende de kweekperiode. Caudal IVD's worden hier getoond. De differentiële binding van ioversol de AF (lagere demping) en NP (hogere verzwakking) maakt het mogelijk om de AF onderscheiden van de NP. Omgekeerd PMA voorkeur bindt aan het collageen residuen in de AF (hogere demping), de eindplaten en het notochord. De beelden werden gevisualiseerd met behulp van kleur, zodat wit vertegenwoordigt hoge demping, geel staat voor medium demping en rood staat voor lage demping. (A - E) Sagittal uitzicht op de IVD op dag 0, 2, 5 en 7 met ioversol contrast, en met PMA contrast. (F - J) Transversale uitzicht op de IVD op dag 0, 2, 5 en 6 met ioversol contrast en met PMA contrast. Caudal IVD's worden hier getoond. Klik hier om een la te bekijkenrger versie van deze figuur.

Figuur 1
Figuur 5. Eindige elementen modellering (FEM) van de IVD structuur. FEM analyse is een krachtige wiskundige tool die de berekening van de lokale materiaal reactie op grotere randvoorwaarden mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, (A) de NP kunnen apart gemaakt van (B) het AF en elk compartiment kan constitutief unieke eigenschappen worden toegekend. (C) een combinatie IVD structuur met zowel AF en NP weergegeven in 3D. Bij axiale belasting op de schijf worden aangebracht op de bovenste eindplaat van de onderste eindplaat een vaste rand, kunnen we de lokale spanningsconcentraties en spanningen bepalen. Gele stippen en zwarte pijlen vertegenwoordigen een knooppunt belasting wordt toegepast. Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol beschrijft een orgaan cultuur van de muizen FSU met de nadruk op het toezicht op de biologische veranderingen in het IVD. De succesvolle onderhoud van deze culturen vereist een zorgvuldige steriele technieken. Vooral de dissectie stappen 2,1-2,6 en 3,1-3,6 cultuur stappen vereisen bijzonder toe steriele omstandigheden worden gehandhaafd en deze stappen wordt bij voorkeur uitgevoerd in een geïsoleerde procedure kamer met een HEPA luchtstroom om verontreinigingen te minimaliseren. Omdat de dissectie proces veroorzaakt trauma aan de weefsels, wordt de 24-uur periode preconditionering 3.5 vereist voor alle behandelingsgroepen inbegrip van de controles. De levensvatbaarheid assays kunnen worden gebruikt om te verzekeren monsters levend onbesmette en ook dienen als een bevestiging die cellulaire homeostase wordt gehandhaafd. De NF-KB luminescentie metingen kunnen ook worden gebruikt om longitudinaal volgen de ontstekingsreactie van de gekweekte FSU; een toename van de NF-KB-expression gedurende de kweek zou de FSU te melden, zijn besmet of anderszins onder stress van infectie 11, en we dus onder andere dat hier als een mogelijke stap het oplossen van problemen. Tot slot, vergelijkingen met de Fresh groepen dienen als een extra controle voor de controle gekweekte monsters in de histologie en mechanische prestaties. Deze cultuur techniek vatbaar is voor meerdere monsters per plaat, en in onze ervaring, kunnen tot 24 monsters op een 24-well plaat gemakkelijk worden bereikt. De multiplexing monsters propageert ook het risico op kruisbesmetting en derhalve verdient het aanbeveling FSU worden gekweekt op afzonderlijke platen zich problemen voordoen. Bovendien, terwijl dit protocol bevat instructies voor een cultuur periode van 21 dagen, dezelfde methode kan worden gebruikt voor cultuur periodes die langer of korter zijn. FSU zijn met succes gekweekt door ons lab voor cultuur periodes variërend van 1 week tot 5 weken.

Like alle modellen, orgelcultuur modellen in muizen hebben beperkingen, in het bijzonder in hun vermogen om de beladingstoestand van de mens vast te leggen. Ook zijn er subtiele verschillen in geometrie tussen de muizen en humane IVD 12 en mens tweebenige met hoofdzakelijk axiale belastingen op de ruggengraat, terwijl ratten en muizen zoogdieren. Aangezien de gekweekte toestand betrekkelijk onbelast in zijn huidige vorm, de laadmodus waarschijnlijk niet IVD beïnvloed. Andere systemen zoals boviene IVD orgaan cultuurmodellen 13, 14 kunnen beter geschikt voor mechanische belasting en interacties. Toekomstige werkzaamheden zullen worden opgenomen belastingstoestanden op de behandeling van mechanobiologische wisselwerking tussen mechanische en omgevingsfactoren mogelijk. De kracht van deze aanpak schuilt in de consistentie, veelzijdigheid en capaciteit voor een hoge resolutie imaging. Onze aanpak hier laat zien dat het mogelijk is om de cultuur both lumbale en caudale IVD, maar het is belangrijk op te merken dat deze schijven zijn anatomisch verschillend over veroudering en ontwikkeling 15. Als zodanig, onze experimentele ontwerp willekeurig maakt de lumbale en caudale niveaus afzonderlijk.

Contrast-versterkte microCT toestaan ​​dat de hoge-resolutie, niet-destructieve, driedimensionale beeldvorming van het IVD. Verschillende contrastmiddelen kunnen worden gebruikt om verschillende compositorische aspecten van de IVD markeren. We demonstreren hier het gebruik van ioversol, een jodium bevattend niet-cytotoxisch hydrofiel middel 10 en fosfomolybdeenzuur (PMA), een zware metalen molecuul dat cheleert aan collageen aminozuurresten. Met behulp van deze contrast-middelen, kan de microstructuur van de IVD gemarkeerd en geïdentificeerd. Ioversol onderscheidt de relatieve hydratatie van de IVD weefsels, waardoor het contrast tussen de waterrijke nucleus pulposus en minder gehydrateerde annulus fibrosus verschaffen.De PMA verschaft differentiatie van relatieve collageensamenstelling in weefsels en de eindplaten, annulus fibrosus, en notochorda markeren. Ioversol kan in kweek worden toegepast om de longitudinale veranderingen in hydratatie bepalen, terwijl PMA aan het eindpunt van de cultuur kan worden toegepast op de IVD collageen veranderingen volgen.

Toekomstige toepassingen van deze technologie zijn onder meer gebruik te maken van andere stammen van transgene en knockout muizen om verschillende aspecten van IVD-degeneratie bij andere ziekten te begrijpen. Verder is het een potentieel platform voor co-kweek met andere orgaansystemen en cellen zoals achterwortelganglia interacties die kunnen bijdragen aan degeneratie IVD identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs van dit manuscript verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 en NIH K01AR069116. De auteurs willen graag Patrick Wong bedanken voor zijn bijdrage in het verzamelen van gegevens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter