Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Un doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

culture d'organe total du disque intervertébral (DIV) conserve la matrice extracellulaire native, les phénotypes cellulaires, et les interactions entre la matrice cellulaire. Nous décrivons ici un système de culture à l'aide IVD IVD lombaire de la souris et caudale dans leurs unités fonctionnelles de la colonne vertébrale et plusieurs applications utilisant ce système.

Abstract

La dégénérescence du disque intervertébral (IVD) est un facteur important de la lombalgie. L'IVD est un joint fibrocartilagineux qui sert à transmettre et à amortir les charges de la colonne vertébrale. Le IVD se compose d'un noyau riche en protéoglycanes-pulposus (NP) et un anneau fibreux riche en collagène (AF) prise en sandwich par cartilagineux plaques d'extrémité. Ensemble avec les vertèbres adjacentes, la structure des vertèbres-IVD forme une unité de colonne vertébrale fonctionnelle (FSU). Ces microstructures contiennent des types de cellules uniques ainsi que des matrices extracellulaires uniques. culture d'organe plénier de l'ex-URSS conserve la matrice extracellulaire native, phénotypes de différenciation cellulaire, et les interactions à matrice cellulaire. Ainsi, les techniques de culture d'organes sont particulièrement utiles pour étudier les mécanismes biologiques complexes du IVD. Nous décrivons ici une approche à haut débit pour la culture de l'ensemble de la souris FSU lombaire qui offre une plate-forme idéale pour l'étude des mécanismes et des thérapies pour la maladie du IVD. De plus, nous décrivons slusieurs applications qui utilisent ce procédé de culture d'organe de procéder à d'autres études, y compris l'imagerie par microCT contraste amélioré et en trois dimensions à haute résolution modélisation par éléments finis de la IVD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La lombalgie (LBP) est le principal facteur d'invalidité globale et la perte de productivité en milieu de travail, et les Américains dépensent à eux seuls plus de 50 milliards de dollars sur le traitement de la lombalgie 1. Bien que répandue, l'étiologie de la lombalgie reste complexe et multifactorielle. Cependant, la dégénérescence des disques intervertébraux (IVD) est parmi les facteurs de risque les plus importants pour LBP 2.

L'IVD est composé de trois microstructures: l'anneau fibreux extérieur (AF), le noyau pulpeux intérieur (NP), et deux plaques d' extrémité cartilagineux qui prennent en sandwich l'ensemble de la structure proximale et distale 3. Avec l' âge et la dégénérescence, les composants IVD changent de structure, de composition et mécaniquement 4. Ces changements incluent la perte de protéoglycanes et de l' hydratation de la NP, une diminution de la hauteur du disque, et détériorée compétence mécanique 5. Ces modifications sontsouvent accompagnée de cytokines qui favorisent une réponse inflammatoire, ainsi que neutrophile et intrusion ganglionnaires racine dorsale dans l'espace articulaire aboutissant à une cascade d'événements qui conduisent à des symptômes de lombalgie 6.

L'étude des mécanismes de la dégénérescence IVD est difficile chez les humains, car il est souvent impossible d'isoler la cause de la dégénérescence avant l'apparition de la lombalgie. Ainsi, une approche réductionniste de la simplification du système expérimental jusqu'à l'organe IVD permet peaufinage mécaniste des variables de cause à effet et d' examiner leurs effets en aval 5. Le système est réduit à la seule population de cellules native et entourant la matrice extracellulaire, permettant ainsi l'interprétation directe des effets des stimuli externes sur la dégénérescence IVD. De plus, le coût plus faible et l' évolutivité des modèles murins, ainsi que le grand nombre d'animaux génétiquement modifiés 7, permettent til rapide dépistage ciblé des mécanismes dégénératifs IVD et des thérapies potentielles. Ici, nous décrivons un système murin de culture d'organe dans lequel IVD stabilité cellulaire et tissulaire est maintenue pendant 21 jours, avec une attention particulière accordée aux IVDS de motifs homéostatique, mécaniques, structurelles et inflammatoires. En utilisant cette méthode, nous surveillons les changements fonctionnels de IVDS dans un modèle de lésion induite par poignarder 8 à comprendre les mécanismes de la dégénérescence du disque. De plus, nous décrivons plusieurs applications de cette méthode de culture d'organes pour mener d'autres études, y compris l'imagerie par microtomographie contraste amélioré et trois dimensions de modélisation à haute résolution de l'IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément à l'Université de Washington à St. Louis Comité des études animales.

1. Animaux

  1. Obtenir deux souches de souris: vieux BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) et 10 semaines vieux animaux rapporteurs kappa-B-luciférase facteur nucléaire (NF-κβ-luc) à 10 semaines élevé dans une fond BALB / c (n = 6, BALB / c-Tg (Rel-luc) 31Xen).
  2. Avant la dissection, euthanasie les animaux avec une surdose de CO 2 à un débit de 2,5 à 3 L / min pendant 5 min suivie d'un supplément de 2 min de temps de séjour.
  3. Désinfecter la région à l'extérieur de l'animal par le baignant dans un bain d'éthanol à 70% pendant 2 min avant la dissection.

2. Dissection

  1. Faire une coupe verticale longitudinale sur la surface dorsale de la souris à l'aide de ciseaux de dissection petites afin d'exposer la cavité du corps.
  2. Faites deux coupes longitudinales verticales de chaque côté de la colonne vertébrale de l'animal à partir dela première vertèbre lombaire (L1) pour les vertèbres caudales (C8).
  3. L'utilisation d'un scalpel, une pince fine, et des ciseaux de dissection fines, retirez délicatement la colonne vertébrale de L1-C8 de la cavité du corps de l'animal.
  4. Retirez délicatement les tissus mous qui entourent l'excès de la colonne vertébrale, tout en veillant à ne pas gratter ou blesser l'IVD sur la face ventrale.
  5. En outre disséquer la colonne vertébrale dans les unités fonctionnelles de la colonne vertébrale des vertèbres-disque vertèbres (FSU) à L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, et les disques C7 / C8.
  6. Rincer le FSU dans une solution saline équilibrée de Hank additionné de 1% de pénicilline-streptomycine pendant 2 min.
  7. Attribuer au hasard les FSU en trois groupes: non cultivé et non traité FSU (frais), mais en culture non traitée FSU (témoin), et cultivées et traitées stab FSU (Stab).
  8. Aligner congeler les échantillons frais FSU avec de l'azote liquide immédiatement après la dissection et stocker dans un congélateur à -20 ° C.

3. Conditions d'organes Culture

  1. Préparer 500 ml de milieu de culture stérile de 1: 1 modifiée du milieu de Eagle de Dulbecco: mélange nutritif F12 (DMEM: F12) complété avec 20% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine.
  2. En utilisant 10 ml de pipettes sérologiques, la pipette 2 ml de milieu de culture dans chaque puits d'une plaque de culture 24 puits.
  3. À la suite de dissection et de rinçage, placer chaque FSU dans un puits individuel rempli dans le support de plaque à 24 puits.
  4. Incuber les échantillons dans un incubateur stérile qui maintient à 37 ° C, 5% CO 2, 20% de O 2 et> 90% d' humidité.
  5. Après une période de culture initiale de 24 h, les échantillons blesser mécaniquement groupe Stab par ponction à l'aiguille de l'anneau fibreux en utilisant une aiguille de calibre 27 stérile comme représenté sur la figure 1A.
  6. Changer les médias toutes les 48 h en préparant une nouvelle plaque de culture 24 puits rempli médias, et des échantillons de transfert de l'ancienne plaque à la nouvelle aide de pinces stériles. Aspirer les anciens médias et dispose de la vieille plaque de culture dans un bac à déchets biologiques dangereux.
  7. Le dernier jour de culture, incuber les échantillons dans un milieu contenant 0,75 mg / ml de chlorure de nitro bleu de tétrazolium pendant 24 h.
  8. Ensuite, geler tous les FSU à l' azote liquide et stocker dans un congélateur à -20 ° C jusqu'au moment de l' essai mécanique ou histologie (figure 1B).

4. Mesures longitudinales NF-kB

  1. Image de la FSU des animaux NF-κβ-luciférase à 1, 5, 13, et 19 jours pour évaluer l'expression NF-kB.
  2. Ajouter 10 pi de 1 mg / ml de solution de luciférine à chaque puits et incuber dans un incubateur stérile à 37 ° C pendant 10 min.
  3. L'image des échantillons de bioluminescence à l'aide du système de formation d'image avec un temps d'exposition de 1 minute et de réglage du bac 2.
  4. En même temps, utiliser la machine pour prendre une photo et la superposition avec l'image de bioluminescence pour déterminer la localisation anatomique de la luminescence dans le IVD.
  1. Déterminer le comportement mécanique des DIV en utilisant la compression dynamique contrôlée déplacement-9.
  2. En utilisant un microscope de dissection, scalpel et des pinces, retirer les corps vertébraux osseux du FSU de chaque échantillon, tout en maintenant les plaques d'extrémité cartilagineuses intact et fixé au IVD.
  3. Attacher les DIV isolées à 1 cm x 1 cm x 0,2 cm plaque d'aluminium avec de la colle cyanoacrylate.
  4. Mesurer la hauteur du disque et la largeur en prenant une moyenne de trois mesures sur l'axe longitudinal de chaque disque à l'aide d'un micromètre à laser. Calculer le rapport de la hauteur du disque en divisant la hauteur moyenne du disque par la largeur maximale du disque.
  5. Utilisez la hauteur du disque mesuré pour calculer les valeurs de contrainte d'entrée utilisées dans les essais mécaniques. Notez que la hauteur du disque moyen était d'environ 690 um ± 39 um.
  6. Placer les échantillons dans un bain de solution saline tamponnée au phosphate sous la Compressisur la machine et précharger le disque à 0,02 N.
  7. Cycliquement comprimer le disque en utilisant une forme d'onde sinusoïdale à 1 Hz pendant 20 cycles au niveau de déformation de 1% et 5% du niveau de contrainte pour chacun des essais 3 et enregistrer les valeurs de charge et de déplacement de l'IVD. Attendez 10 min de temps de repos entre les essais pour le disque pour se détendre et éviter les blessures.
  8. Calculer la raideur moyenne de la phase de chargement du dernier cycle, et le calcul de la tangente de perte à partir de l'angle de phase entre les données de charge et de déplacement.

6. protéoglycanes et du collagène Quantification

  1. Suite à des essais mécaniques, mesurer le poids humide du disque en plaçant le IVD isolé dans un tube de centrifugeuse de pré-taré et en mesurant le poids en utilisant une balance analytique.
  2. Digérer les DIV isolés dans 250 ul d'une solution de digestion de papaïne (0,1 M d'acétate de sodium, 0,01 M d'EDTA, 0,005 M HCl cysteine, pH 6,4) pendant une nuit à 65 ° C en utilisant un chauffe-bloc.
  3. Centrifuger les échantillons pendant 10 minà 2000 xg et recueillir le liquide surnageant.
  4. Mesurer la teneur en protéoglycanes du IVD en utilisant le dosage au bleu de diméthylméthylène (DMMB) avec les normes de sulfate de chondroïtine.
  5. Préparer la solution de DMMB (21 mg DMMB, 5 ml d' éthanol absolu, 2 g de formiate de sodium dans 1 L ddH 2 O).
  6. Pipeter 30 uL de standards et d'échantillons en trois exemplaires dans une plaque à 96 puits, avec 250 ul de solution de DMMB dans chaque puits.
  7. Lire l'absorbance de la plaque à 525 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
  8. Mesurer la teneur en collagène en utilisant un kit de dosage hydroxyproline selon les instructions du fabricant.

7. Histologie

  1. Fixer un sous-ensemble d'échantillons dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 h, de-calcifier à 5% d'acide formique pendant 48 h, déshydrater avec de l'éthanol, et incorporer dans de la paraffine.
  2. En utilisant un microtome, les échantillons section sagittale à 10 um d'épaisseur et d'appliquer les sections de lames de verre. Colorer les sections à l'aide safranine-O / Fast Green et DAPI.
  3. L'utilisation d'un microscope optique, glisse image au grossissement 10X.

8. Contraste amélioré microtomographie positons (microtomographie)

  1. Balayer un sous - ensemble d'échantillons aux 0, 2, 5, et des points de temps de 7 jours à l' aide de contraste pour l' amélioration Ioversol longitudinal 10, et le contraste d'amélioration de l' acide phosphomolybdique (PMA) borne au point de temps de 7 jours.
  2. 4 h avant le temps de balayage microCT, ajouter 300 uL de 350 mg / ml de solution d'iode Ioversol aux milieux de culture pour une concentration finale d'environ 50 mg / ml solution Ioversol contenant de l'iode et incuber dans un incubateur stérile à 37 ° C pendant 4 h.
  3. Après l'incubation, l'échantillon envelopper dans une gaze stérile et on place dans un tube de microcentrifugation de 1 mL.
  4. Placer les échantillons dans le système de microCT et numériser à 45 keVp, 177 uA, 10,5 um taille de voxel, et 300 ms intégration.
  5. Exporter des données de la microtomographie sous forme de fichiers DICOM et visualiser à l'aide du logiciel (
  6. Au point de temps de 7 jours, fixer des échantillons en utilisant une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 24 h, suivi de 5% solution de PMA pendant 3 jours et numériser en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés à l'étape 8.4.

9. Trois dimensions Modélisation par éléments finis

  1. Segmenter les fichiers DICOM des IVD en utilisant le logiciel avec seuillage manuel (par exemple, OsiriX).
  2. Convertir les volumes NP et AF du IVD en mailles d'éléments finis voxeliques utilisant Meshlab.
  3. Combiner les microstructures du NP et AF pour former un IVD complet et appliquer des conditions aux limites déterminées expérimentalement dans le logiciel des éléments finis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Les figures 2-3 montrent des résultats représentatifs de la distribution des protéoglycanes, l' expression du NF-kB, la raideur, la viscosité, la hauteur du disque, et le poids humide pour le diagnostic in vitro de souris en culture. Si cultivées correctement, les paramètres IVD du groupe de contrôle ne doivent pas être significativement différent du groupe frais. Si la culture est infecté ou compromis, le groupe de contrôle sera différent du groupe frais, en particulier dans l'expression NF-kB et la distribution protéoglycanes (résultats non présentés). Les figures 4-5 montrent des applications de culture d'organes à l' aide d' microCT de contraste amélioré pour obtenir un modèle tridimensionnel de l'IVD; en outre, la modélisation par éléments finis peut être appliquée à ces structures pour déterminer les distributions de contrainte et de déformation des tissus en raison du comportement mécanique global.

Figure 1
Figure 1. expérimentaleVue d'ensemble. (A) des unités disque intervertébral de la colonne vertébrale fonctionnelle (FSU) ont été disséqués à partir du segment lombaire et caudale; la FSU contenait deux vertèbres intactes, les plateaux cartilagineux, et le disque intervertébral. (B) Suite à dissection, les échantillons ont été divisés en groupes de traitement et mis en culture in vitro pendant 21 jours. Par la suite, un sous-ensemble d'échantillons a été utilisé pour les essais mécaniques et les analyses biochimiques, tandis qu'un autre sous-ensemble d'échantillons a été utilisé pour l'analyse histologique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 1
Figure 2. Histologie et expression NF-kB. (A) Après 21 jours de culture, la safranine O coloration (rouge) montre que la teneur en protéoglycanes est maintenuedans les deux AF et NP dans les échantillons de contrôle. (B) Les échantillons Stab (site de ponction indiqué par la flèche) ont montré une diminution du contenu en protéoglycanes dans les deux AF et NP. (C) tétrazolium coloration au bleu (bleu) montre la co-localisation. (D) la coloration DAPI montre que les cellules sont métaboliquement actives et viable au bout de 21 jours en culture d'organe. (E) expression NF-kB dans les deux échantillons de contrôle et Stab indiquent également que le IVD est viable et sensible à son environnement. Les échantillons Stab ont une expression accrue de NF-kB dans le 1, 5, 13, et des points de temps de 19 jours. IVD sont présentés ici Lombaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 1
Figure 3. Mécanique et composition. ( B) Essais mécaniques ont montré que les 1% et 5% des niveaux de déformation, rigidité de l' échantillon par arme blanche et des valeurs de tangente de perte sont plus faibles par rapport à des échantillons de configuration. (C - D) des dosages biochimiques ont montré que la composition, les échantillons étaient moins Stab protéoglycane et la teneur en collagène (normalisée pour mouiller poids) par rapport à des échantillons de configuration. (E - F) Structurellement, les échantillons Stab avait un rapport de la hauteur du disque et une diminution du poids humide par rapport aux témoins. Mécaniquement, de composition et de structure, de nouveaux échantillons et contrôle les valeurs ne sont pas significativement différents les uns des autres. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 1
Figure 4. microtomographie contraste amélioré visualization. microtomographie produit de contraste peut être utilisé pour visualiser l'IVD en trois dimensions au cours de la période de culture. IVD caudales sont présentés ici. La liaison différentielle de Ioversol à l'AF (atténuation inférieure) et NP (d'atténuation plus élevée) permet de distinguer l'AF à partir de la NP. A l'inverse, PMA se lie de préférence aux résidus de collagène dans l'AF (atténuation supérieure), les plaques d'extrémité, et la notocorde. Les images ont été visualisées en utilisant la couleur de telle sorte que blanc représente une forte atténuation, jaune représente une atténuation moyenne et rouge représente une faible atténuation. (A - E) une vue sagittale de la IVD aux jours 0, 2, 5 et 7 avec un contraste Ioversol et avec un contraste de PMA. (F - J) des vues transversales de l'IVD aux jours 0, 2, 5 et 6 avec un contraste Ioversol et avec un contraste de PMA. IVD caudales sont présentés ici. S'il vous plaît cliquer ici pour voir à laversion rger de ce chiffre.

Figure 1
Figure 5. modélisation par éléments finis (FEM) de la structure d'IVD. analyse FEM est un puissant outil mathématique qui permet le calcul de la réponse de matériaux locaux à des conditions aux limites plus grandes. Par exemple, (A) le NP peut être rendu séparément (B) l'AF, et chaque compartiment peut être affecté propriétés constitutives uniques. (C) Structure de IVD combiné à la fois avec l'AF et NP est représentée en 3D. Lorsque des charges axiales sont appliquées sur le disque sur le plateau supérieur avec la plaque d'extrémité inférieure est un bord fixe, on peut déterminer les concentrations locales de stress et les tensions. Les points jaunes et des flèches noires représentent une charge nodal étant appliqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir uneplus grande version de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ce protocole décrit une culture d'organes de l'ex-URSS de souris en mettant l'accent sur le suivi des changements biologiques dans le diagnostic in vitro. Le maintien de succès de ces cultures nécessite une étude minutieuse des techniques stériles. En particulier, la dissection étapes et 2/1 à 2/6 la culture étapes 03.01 à 03.06 ont besoin de soins spéciaux pour assurer des conditions de stérilité soient maintenues, et ces étapes doit être effectuée de préférence dans une salle d'opération isolée avec un flux d'air HEPA pour réduire au minimum les contaminants. Parce que le processus de dissection provoque un traumatisme aux tissus, la période de préconditionnement 24 h en 3,5 est nécessaire pour tous les groupes de traitement, y compris les contrôles. Les tests de viabilité peuvent être utilisés pour assurer que les échantillons sont vivants et non contaminés, et servir également comme une confirmation que l'homéostasie cellulaire est maintenue. Les lectures de luminescence NF-kB peut également être utilisé pour surveiller le sens longitudinal de la réponse inflammatoire du FSU cultivées; une augmentation rapide de NF-kBion pendant la culture pourrait indiquer la FSU sont contaminés ou non soumis à un stress de l' infection 11, et nous incluons donc ici comme une étape de dépannage possible. Enfin, les comparaisons avec les groupes frais servent de point de contrôle supplémentaire pour les échantillons de culture de contrôle en histologie et performances mécaniques. Cette technique de culture se prête à de multiples échantillons par plaque, et dans notre expérience, jusqu'à 24 échantillons sur une plaque de 24 puits peut être facilement accompli. Cependant, le multiplexage d'échantillons également le risque se propage de contamination croisée et donc, il est recommandé que les FSU être cultivées sur des plaques séparées lors d'un dépannage. De plus, alors que ce protocole donne des instructions pour une période de culture de 21 jours, la même méthode peut être utilisée pour les périodes de culture qui sont plus ou moins. FSU ont été cultivées avec succès par notre laboratoire pour des périodes de culture allant de 1 semaine à 5 semaines.

Like tous les modèles, les modèles de culture d'organes dans murin ont des limites, en particulier dans leur capacité à saisir les conditions de chargement des humains. Il existe également des différences subtiles dans la géométrie entre la souris et l' homme 12 IVD, et les humains sont bipèdes avec des charges axiales principalement sur la colonne vertébrale alors que les rats et les souris sont quadrupèdes. Toutefois, étant donné l'état de culture est relativement déchargée sous sa forme actuelle, le mode de chargement est susceptible de ne pas avoir influencé les IVD. D' autres systèmes tels que les modèles de culture d'organes de IVD bovine 13, 14 peut - être mieux adapté pour les interactions mécaniques et de chargement. Les travaux futurs intégrera les conditions de chargement pour permettre l'étude des interactions entre les facteurs mécanobiologique mécaniques et environnementaux. La puissance de cette approche réside dans sa cohérence, la polyvalence et la capacité d'imagerie à haute résolution. Notre approche démontre ici qu'il est possible de la culture blombaire OTH et IVDs caudales, mais il est important de noter que ces disques sont anatomiquement différents sur le vieillissement et le développement 15. À ce titre, notre conception expérimentale randomizes lombaire et niveaux caudales séparément.

microCT de contraste amélioré permet la haute résolution, non destructive, l'imagerie tridimensionnelle de l'IVD. Différents agents de contraste peuvent être utilisés pour mettre en évidence les différents aspects de composition de l'IVD. Nous démontrons ici l'utilisation de Ioversol, un contenant de l' iode agent hydrophile non cytotoxique 10, et de l' acide phosphomolybdique (PMA), une molécule de métal lourd qui chélate de résidus d'acides de collagène. L'utilisation de ces agents de contraste-, les caractéristiques des microstructures du IVD peuvent être mis en évidence et identifiés. Ioversol différencie l'hydratation relative des tissus IVD, fournissant ainsi le contraste entre le noyau riche en eau pulposus et l'annulus fibrosus moins hydraté.Le PMA fournit la différenciation de la composition de collagène dans les tissus par rapport et mettra en évidence les plaques d'extrémité, l'anneau fibreux, et la notocorde. Ioversol peut être utilisé pendant la culture pour déterminer les changements longitudinaux dans l'hydratation, alors que PMA peut être appliqué à la IVD au point terminal de culture pour surveiller les changements de collagène.

Les applications futures de cette technologie comprennent l'utilisation d'autres souches de souris transgéniques et knock-out pour comprendre les différents aspects de la dégénérescence IVD dans d'autres maladies. En outre, il est une plate-forme potentiel de co-culture avec d'autres systèmes d'organes et de cellules telles que les ganglions de la racine dorsale pour identifier les interactions qui peuvent contribuer à la dégénérescence IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs de ce manuscrit déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le (AR057235 P30 NIH) Centre de recherche musculo-squelettique Washington University, Centre d'imagerie moléculaire (NIH P50 CA094056), mécanobiologie subvention de formation (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 et NIH K01AR069116. Les auteurs tiennent à remercier Patrick Wong pour sa contribution à la collecte des données.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter