Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

תרבות איבר שלם של הדיסק הבין חולייתי (IVD) משמר את מטריקס מקומיים, פנוטיפים התא, ואינטראקציות-מטריצה ​​הסלולר. כאן אנו מתארים מערכת תרבות IVD באמצעות המותני עכבר IVDs זנב ביחידות השדרה התפקודית שלהם וכמה יישומים ניצול מערכת זו.

Abstract

הדיסק הבין חולייתי (IVD) ניוון הוא תורם משמעותי כאבי גב תחתונים. IVD היא משותפת fibrocartilaginous המשמש להעברה ויחליש עומסים על עמוד השדרה. IVD מורכב pulposus גרעין proteoglycan העשירי (NP) ו סיסטיק כטבעת עשיר קולגן (AF) דחוק ידי-צלחים סוף סחוסים. יחד עם החוליות, במבנה החוליות-IVD מהווה יחידת עמוד שדרה תפקודית (חמ"ע). microstructures אלה מכילים סוגי תאים ייחודיים כמו גם מטריצות תאיות ייחודיות. תרבות איבר שלמה של בריה"מ לשעבר משמרת את מטריקס המקומי, פנוטיפים התמיינות תאים, ואינטראקציות-מטריצה ​​הסלולר. לפיכך, טכניקות תרבות איבר שימושיים במיוחד עבור חוקרת את המנגנונים הביולוגיים המורכבים של IVD. כאן, אנו מתארים גישה תפוקה גבוהה עבור culturing FSUs העכבר המותני שלם המספק פלטפורמה אידיאלית לחקר מנגנוני מחלות וטיפולים עבור IVD. יתר על כן, אנו מתארים יםיישומי everal כי לנצל שיטת תרבות איבר זה לערוך מחקרים נוספים כולל הדמית microCT משופרת ניגודיות דוגמנות אלמנטים סופיים תלת ממדים ברזולוציה גבוהה של IVD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאב גב תחתון (LBP) הוא הגורם המוביל נכות העולמי אובדן פרודוקטיביות במקום העבודה, ואת האמריקאים לבדם לבלות העולה על 50 מיליארד דולרים על הטיפול LBP 1. למרות הרווח, על האטיולוגיה של LBP נשאר מורכב מולטיפקטוריאלית. עם זאת, הדיסק הבין חולייתי (IVD) ניוון הוא בין גורמי הסיכון המשמעותיים ביותר עבור LBP 2.

IVD עשוי שלושה microstructures: את סיסטיק annulus החיצוני (AF), את pulposus הגרעין הפנימי (NP), ושני endplates סחוסי כי כריך המבנה כולו proximally ו distally 3. עם הזדקנות וניוון, רכיבי IVD לשנות מבני, בעלי רכב, ו 4 מכאני. שינויים אלה כוללים אובדן proteoglycans הידרציה של NP, ירד גובה דיסק, והידרדר יכולת 5 מכנים. שינויים אלהלעתים קרובות מלווה ציטוקינים המעודדים תגובה דלקתית, כמו גם חדירת גנגליון נויטרופילים שורש הגבה לחלל המשותף ששיאו מפל של אירועים שהובילו סימפטומי LBP 6.

חקר המנגנונים של ניוון IVD הוא מאתגר בבני אדם משום שהוא לעתים קרובות לא ניתן לבודד את הגורם לניוון לפני קרות כאבי גב תחתון. לפיכך, גישה הרדוקציוניסטית של פישוט המערכת הניסיונית עד איבר IVD מאפשרת כוונון עדין המכניסטי של משתנים סיבתי ובחינת השפעות הזרם שלהם 5. המערכת מצטמצמת לאוכלוסיית תא הילידים רק וסביבת מטריקס, ובכך לאפשר את הפרשנות הישירה של ההשפעות של גירויים חיצוניים על ניוון IVD. יתר על כן, העלות נמוכה יותר ויכולת הרחבה של מודלים בעכברים, כמו גם מספר רב של בעלי חיים מהונדסים גנטית 7, לאפשר tהוא הקרנה ממוקדת מהירה של מנגנוני ניוונית IVD וטיפולים פוטנציאליים. כאן, אנו מתארים מערכת תרבות איבר בעכברים בם יציבות הסלולר רקמות IVD נשמרו לאורך 21 ימים, עם דגש ספציפי שניתן ההומיאוסטטית, מכנים IVDs, מבניים, ודפוסים דלקתיים. באמצעות שיטה זו, אנו עוקבים אחר השינויים התפקודיים IVDs במודל פציעה נגרם דקירה 8 כדי להבין את המנגנונים מאחורי ניוון הדיסק. יתר על כן, אנו מתארים מספר יישומים של שיטת תרבות איבר זה לערוך מחקרים נוספים כולל הדמית microCT משופרת ניגודיות תלת ממד דוגמנות ברזולוציה גבוהה של IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס Animal מחקרים הוועדה.

1. בעלי חיים

  1. השג שני זנים של עכברים: 10-שבוע הישן BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) ו הפקטור הגרעיני הישן 10 שבועות חיות הכתב kappa-B-luciferase (NF-κβ-לוק) גזעי BALB / ג הרקע (n = 6, BALB / c-Tg (רלה-לוק) 31Xen).
  2. לפני לנתיחה, להרדים חיות עם מנת יתר 2 CO בקצב זרימה של 2.5-3 ליטר / דקה עבור 5 דקות ואחריו זמן 2 דקות של תוספת מגורים.
  3. לחטא את האזור החיצוני של החיה על ידי רחצה אותו באמבטיה אתנול 70% עבור 2 דקות לפני החיתוך.

2. Dissection

  1. ביצוע חתך אנכי האורך על פני השטח הגבי של העכבר באמצעות מספריים לנתיחה קטנים כדי לחשוף את חלל הגוף.
  2. בשני חתכים אנכיים אורכים משני צדי עמוד השדרה של החיה החלהחוליות הראשונות (L1) כדי חוליות הזנב (C8).
  3. באמצעות אזמל, מלקחיים בסדר, ומספרי דיסקציה בסדר, להסיר את עמוד השדרה בקפידה מתוך L1-C8 מחלל הגוף של החיה.
  4. מוציא בזהירות רקמות רכות עודפות סביב עמוד השדרה, תוך הקפדה שלא לגרד או לפצוע את IVD בצד הגחון.
  5. בהמשך לנתח את עמוד השדרה ליחידות השדרה פונקציונלי חוליות-דיסק-החוליות (FSUs) בבית L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, C7 ו- / דיסקים C8.
  6. יש לשטוף את FSUs תמיסת המלח המאוזן של האנק בתוספת 1% פניצילין, סטרפטומיצין עבור 2 דקות.
  7. אקראי להקצות את FSUs לשלוש קבוצות: חסרי תרבות ואינם מטופלים FSUs (טרי), תרבותי אך לא מטופל FSUs (Control), ו מתורבת דקירה טופלו FSUs (Stab).
  8. צמד להקפיא את הדגימות הטריות חמ"ע עם חנקן נוזל מייד לאחר דיסקציה ומאחסן במקפיא C -20 °.

3. תנאי תרבות איברים

  1. הכן 500 מ"ל של התקשורת בתרבות סטרילי של 1: שינוי המדיום הנשרים של 1 Dulbecco: F12 תערובת מזין (DMEM: F12) בתוספת 20% בסרום שור העובר (FBS) ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין.
  2. באמצעות 10 טפטפות סרולוגיות מ"ל, פיפטה 2 מ"ל של התקשורת בתרבות לבאר כל צלחת תרבות 24-היטב.
  3. בעקבות לנתיחה ולשטוף, למקם כל חבר עמים לתוך היטב בודד בצלחת 24-היטב בתקשורת המלאה.
  4. דגירה דגימות חממה סטרילית ששומר 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 ולחות 90%>.
  5. לאחר תקופת תרבות ראשונית של 24 h, מכאני לפצוע דגימות קבוצת הדקירה באמצעות לנקב מחט של fibrosus annulus באמצעות מחט 27-מד סטרילית כפי שמוצג באיור 1 א.
  6. שינוי בתקשורת בכל 48 h על ידי הכנת צלחת תרבות 24-היטב בתקשורת המלאה חדשה, ודגימות העברה מהצלחת הישנה פינצטה סטרילית באמצעות החדשה. לשאוב תקשורת dispos הישנה דואר הצלחה התרבות הישנה לפח פסולת ביולוגי.
  7. ביום תרבות הסופי, דגירה כל דגימות בתקשורת המכיל כלוריד tetrazolium כחול 0.75 מ"ג / מ"ל ​​Nitro עבור 24 h.
  8. לאחר מכן, להקפיא את כל FSUs עם חנקן נוזלי ולאחסן במקפיא C -20 ° עד מוכן לבדיקות מכניות או היסטולוגיה (איור 1B).

4. מדידות אורך NF-κB

  1. IMAGE ל- FSUs מ NF-κβ-luciferase חיות בבית 1, 5, 13, ו 19 ימים כדי להעריך ביטוי NF-κB.
  2. להוסיף 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון luciferin לכל היטב דגירה חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. תמונה דגימות עבור פליטת אור באמצעות מערכת הדמיה עם זמן חשיפה 1 דק 'ו bin ההגדרה של 2.
  4. במקביל, להשתמש במכונה כדי לצלם ולהצליב אותו עם תמונת פליטת האור כדי לקבוע את המיקום האנטומי של הארת IVD.

class = "jove_title"> 5. הערכה מכאנית

  1. לקבוע את ההתנהגות המכנית של IVDs באמצעות דחיסה דינמית, הנשלטת על עקירה 9.
  2. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, אזמל, פינצטה, להסיר את גופות שדרה הגרמיות של חמ"ע מכל מדגם תוך שמירה על endplates הסחוסים שלמים מצורף IVD.
  3. צרף את IVDs מבודד לצלחת אלומיניום 1 ס"מ x 1 ס"מ x 0.2 ס"מ בעזרת דבק cyanoacrylate.
  4. מדדו את גובה דיסק ורוחב לפי ממוצע של שלוש מדידות על ציר האורך של כל דיסק באמצעות מיקרומטר לייזר. חשב את יחס גובה הדיסק ידי חלוקת גובה הדיסק הממוצע ידי רוחב הדיסק המקסימאלי.
  5. השתמש בגובה הדיסק נמדד לחשב את ערכי המתח קלט המשמשים לבדיקות מכניות. שים לב שגובה דיסק הממוצע היה כ 690 מיקרומטר ± 39 מיקרומטר.
  6. מניחים את דגימות באמבט בופר פוספט תחת compressiעל מכונית לטעון מראש את הדיסק כדי 0.02 נ
  7. המחזור לדחוס את הדיסק באמצעות צורת גל סינוסי ב 1 הרץ עבור 20 מחזורים ברמה 1% זן ורמת המתח 5% עבור 3 סבבים ולהקליט את ערכי העומס ועקירה של IVD. אפשר 10 דקות של מנוחה בזמן בין ניסויים עבור הדיסק להירגע כדי למנוע פציעה.
  8. חשב את נוקשות ממוצע משלב ההעמסה של המחזור האחרון, ולחשב את משיק הפסד מזווית השלב בין נתוני עומס ותזוזה.

6. proteoglycan וכימות קולגן

  1. בעקבות בדיקות מכאניות, למדוד את משקל הדיסק הרטוב על ידי צבת IVD המבודד צינור צנטריפוגות מראש tared ומדידת המשקל באמצעות איזון אנליטיים.
  2. לעכל את IVDs מבודד 250 μL פתרון העיכול פפאין (0.1 נתרן אצטט M, 0.01 M EDTA, 0.005 M ציסטאין HCl, pH 6.4) לילה ב 65 ° C באמצעות תנור הבלוק.
  3. צנטריפוגה דגימות עבור 10 דקותב 2000 XG ולאסוף את הנוזלים supernatant.
  4. מדדו את התוכן proteoglycan של IVD באמצעות assay כחול (DMMB) dimethylmethylene לתקני כונדרואיטין סולפט.
  5. הכן פתרון DMMB (21 מ"ג DMMB, 5 מ"ל אתנול אבסולוטי, formate נתרן 2 גרם ב 1 L DDH 2 O).
  6. פיפטה 30 μL של סטנדרטים דגימות בשלושה עותקים בתוך צלחת 96-היטב, יחד עם 250 μL של פתרון DMMB בכל טוב.
  7. קראו את הספיגה של הצלחת ב 525 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  8. מדוד את תוכן קולגן באמצעות ערכת assay hydroxyproline פי הוראות יצרן.

7. היסטולוגיה

  1. תקן משנה של דגימות ב paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות, דה-לְהִסְתַיֵד בחומצה 5% פורמית עבור 48 h, מייבשים עם אתנול, ולהטמיע פרפין.
  2. באמצעות microtome, סעיף הדגימות sagittally ב 10 מיקרומטר עובי וליישם חלקי שקופיות זכוכית. הכתם בסעיפים באמצעות Safranin-O / Fast Green ו DAPI.
  3. באמצעות מיקרוסקופ אור, תמונה שקופיות בהגדלה 10X.

8. ניגודיות משופרת טומוגרפיה microComputed (microCT)

  1. סרוק משנה של דגימות על 0, 2, 5, ו 7 ימים זמן נקודות באמצעות Ioversol האורך לעומת שיפור 10, וחומצה phosphomolybdic הטרמינל (PMA) לעומת שיפור בנקודת הזמן 7 ימים.
  2. 4 שעות לפני מועד סריקה microCT, להוסיף 300 μL של 350 מ"ג / מ"ל ​​פתרון יוד Ioversol לתקשורת תרבות ריכוז סופי של כ 50 מ"ג / יוד המכילים מ"ל פתרון Ioversol דגירה חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס למשך 4 ח.
  3. לאחר דגירה, לעטוף את המדגם גזה סטרילי ומכניסים צינור microcentrifuge 1 מ"ל.
  4. מקום דגימות במערכת microCT ולסרוק ב 45 keVp, 177 מיקרו-אמפר, 10.5 מיקרומטר גודל של פיקסלים, ואינטגרציה 300 ms.
  5. נתוני היצוא מן microCT כמו קבצי DICOM ולדמיין באמצעות תוכנה (
  6. באותה נקודת זמן 7 ימים, לתקן דגימות באמצעות פתרון paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות, ואחריו פתרון PMA 5% עבור 3 ימים, ולסרוק באמצעות אותן הגדרות כמו אלה המשמשים צעד 8.4.

דוגמנות 9. שלושה אלמנטים סופיים Dimensional

  1. לפלח את קבצי DICOM של IVDs באמצעות תוכנה עם thresholding ידנית (למשל, OsiriX).
  2. המרת הכרכים NP ו AF של IVD לתוך משתלב אלמנטים סופיים מבוססי voxel באמצעות Meshlab.
  3. מערבב את microstructures של NP ו AF להקים IVD מלא ולהחיל תנאי גבול לקבוע באופן ניסיוני בתוכנת האלמנטים הסופית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דמויות 2-3 להראות תוצאות נציג ההפצה proteoglycan, NF-κB ביטוי, נוקשות, צמיגות, בגובה הדיסק, ומשקל רטוב עבור IVDs עכבר בתרבית. אם מתורבת כמו שצריך, את פרמטרי IVD של קבוצת הביקורת לא צריכים להיות שונים באופן משמעותי מהקבוצה הטריה. אם התרבות נגועה או נפגע בדרך אחרת, בקבוצת הביקורת תהיה שונה מהקבוצה הטריה, בעיקר בהבעת NF-κB והפצת proteoglycan (תוצאות לא מוצגות). איורי 4-5 יישומי מופע של תרבות איבר באמצעות microCT contrast-enhanced להשיג מודל תלת ממדי של IVD; עוד, ניתן ליישם מודלים אלמנטים סופיים למבנים אלה כדי לקבוע הפצות לחץ ומתח ברקמות בשל התנהגות מכנית העולמי.

איור 1
איור 1. ניסיוניסקירה כללית. (א) חולייתי דיסק פונקציונלי יחידות שדרה (FSUs) נותחו מן המותני פלחי זנב; FSUs הכיל שני שלמים החוליות, את endplates סחוסי, ואת הדיסק הבין חולייתי. (ב) בעקבות לנתיחה, דגימות חולקו לקבוצות טיפול בתרבית במבחנה עבור 21 ימים. לאחר מכן, תת-קבוצה של דגימות ששימש לבדיקות מכניות מבחני ביוכימיים, תוך משנה אחר של דגימות שימש ניתוח היסטולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 2. היסטולוגיה וביטוי NF-κB. (א) לאחר 21 ימים בתרבות, מכתים Safranin O (באדום) מראה תוכן proteoglycan נשמרהן AF ו- NP בדגימות הבקרה. (ב) דגימות הדקירה (במקום נשיכה שמציין חץ) הראה ירידת תוכן proteoglycan הוא AF ו- NP. (ג) tetrazolium מכתים כחול (כחול) מראה-לוקליזציה שיתוף. (ד) DAPI מכתים מראה כי תאי מטבולית פעילים קיימא לאחר 21 ימים בתרבות איבר. (E) ביטוי NF-κB בשתי דגימות הבקרה ולדקור גם מצביע על כך IVD היא בת קיימא ומגיב לסביבתה. דגימות הדקירה גדלו ביטוי NF-κB בבית 1, 5, 13, ו נקודות זמן 19 ימים. IVDs המותני מוצגים כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 3. מכניקה ורכב. ( B) בדיקה מכנית הראו כי על 1% ו 5% רמות המתח, אובדן נוקשות מדגם Stab ערכים המשיק ביחס נמוך כדי לשלוט דגימות. (C - D) מבחני ביוכימיים הראו כי בעלי הרכב, דגימות הדקירה proteoglycan נמוך ותוכן קולגן (מנורמל להרטיב משקל) ביחס שליטה דגימות. (E - F) מבחינה מבנית, דגימות דקירת יחס גובה דיסק ירד ביחס משקל רטוב לבקרות. מבחינה מכנית, בעלי הרכב, ואת מבנית, ערכים דגימות טריים ובקרה לא היו שונים משמעותית זה מזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 4. visualizat microCT משופרת ניגודיותיוֹן. ניגודיות משופרת microCT יכול לשמש כדי להמחיש את IVD בשלושה מימדים בתקופת התרבות. IVDs זנב מוצג כאן. פער עקדת Ioversol אל AF (הנחתה נמוכה) ו NP (הנחתה גבוהה) מאפשר לאדם להבחין בין AF מן NP. לעומת זאת, PMA נקשר מעדיפים את שאריות הקולגן AF (הנחתה גבוהה), את endplates, ואת notochord. התמונות היו דמיינו באמצעות צבע כזה לבן מייצג הנחתה גבוהה, צהוב מייצג הנחתה בינונית, ואדום מייצג ניחות נמוך. (A - E) נופים sagittal של IVD בבית ימים 0, 2, 5, ו 7 עם ניגודיות Ioversol, ועם ניגודיות PMA. (F - J) נופים רוחבי של IVD בבית ימים 0, 2, 5, ו 6 עם ניגודיות Ioversol, ועם ניגודיות PMA. IVDs זנב מוצג כאן. אנא לחץ כאן כדי לצפות להגרסת rger של דמות זו.

איור 1
איור 5. דוגמנות אלמנטים סופיים (פאם) של המבנה IVD. ניתוח פאם הוא כלי מתמטי רב עוצמה המאפשר חישוב תגובת החומר המקומי לתנאי גבול גדול. לדוגמא, (א) NP ניתן שניתנו בנפרד (ב ') את AF, וכל תא יכול להיות מוקצה מאפיינים מכוננים ייחודיים. (ג) מבנה IVD בשילוב עם שני AF ו- NP מוצג 3D. כאשר המון ציריים מוחלים על הדיסק על endplate המעולה עם endplate הנח הוא יתרון קבוע, אנו יכולים לקבוע את הריכוז המקומי של מתחים ולחצים. נקודות צהובות וחצים שחורים מייצגים עומס קטרים ​​מיושם. אנא לחץ כאן כדי לצפותגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר תרבות איבר חמ"ע בעכברים עם דגש על ניטור השינויים הביולוגיים של IVD. התחזוקה המוצלחת של תרבויות אלה דורשת טכניקות סטרילי זהירות. בפרט, לנתיחת צעדי 2.1-2.6 ואת תרבות צעדים 3.1-3.6 דורשים טיפול מיוחד כדי להבטיח נשמרים בתנאים סטריליים, וצעדים אלה צריכות להתבצע רצויים בחדר הליך מבודד עם זרימת אוויר HEPA כדי למזער מזהמים. בגלל תהליך דיסקציה גורם לטראומה לרקמות, בתקופה הנפשית מראש 24-h ב 3.5 נדרשת עבור כל קבוצות הטיפול כולל הבקרות. מבחני הכדאיות יכולים לשמש כדי להבטיח דגימות הם בחיים לא מזוהמים, וגם לשמש כאישור כי הומאוסטזיס הסלולר נשמר. קריאות הארת NF-κB יכולות לשמש גם כדי אורכית לפקח על התגובה הדלקתית של FSUs התרבותי; עלייה אקספרס NF-κBהיון במהלך התרבות עשוי להצביע על FSUs מזוהם או אחרת תחת לחץ מזיהום 11, ואנחנו ובכך לכלול אותו כאן כשלב בפתרון בעיות אפשרי. לבסוף, השוואות לקבוצות הטריות לשמש נקודת בדיקה נוספת עבור הדגימות תרבותיות בקרת היסטולוגיה וביצועים מכאניים. טכניקה זו התרבות ניתנת דגימות מרובות לכל צלחת, ומניסיוננו, עד 24 דגימות על צלחת 24-היטב ניתן להשיג בקלות. עם זאת, ריבוב של דגימות גם מפיץ את הסיכון של זיהום צולב ולכן, מומלץ כי FSUs להיות מתורבת על צלחות נפרדות במהלך פתרון בעיות. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מספק הוראות לתקופת תרבות של 21 ימים, באותה השיטה ניתן להשתמש לתקופות התרבות כי הם ארוכים או קצרים. FSUs כבר מתורבת בהצלחה על ידי המעבדה שלנו לתקופות התרבות החל 1 שבוע 5 שבועות.

Lיש אייק כל הדגמים, מודלי תרבות איבר בעכברי מגבלות, בעיקר ביכולתם ללכוד את תנאי הטעינה של בני האדם. ישנם גם הבדלים דקים בין גיאומטריה בעכברים ו IVDs האנושי 12, ובני האדם הוא שני גפיים עם המון ציריים בעיקר על עמוד השדרה תוך חולדות ועכברים הם בעלי ארבע. עם זאת, מאז מצבו התרבותי נפרק יחסית בצורתו הנוכחית, במצב הטעינה עשוי לא השפיע על IVDs. מערכות אחרות כגון מודלי תרבות איבר IVD שור 13, 14 עשויות להיות מתאימות יותר עבור אינטראקציות מכאניות וטעינה. עבודה עתידית תשלב תנאי העמסה כדי לאפשר החקירה של אינטראקציות mechanobiological בין גורמים מכאניים וסביבתיים. כוחה של גישה זו טמון העקביות, הצדדי שלה, ואת יכולת הדמיה ברזולוציה גבוהה. הגישה שלנו כאן מוכיחה כי אפשר ב התרבותהמותני oth ו IVDs הזנב, אך חשוב לציין כי הדיסקים האלה הם שונים מבחינה אנטומית ברחבי הזדקנות והתפתחות 15. ככזה, תכנון הניסוי שלנו randomizes המותני ורמות הזנב בנפרד.

microCT משופרת ניגודיות לאפשר הדמיה ברזולוציה הגבוהה, הורסות, תלת ממדית של IVD. סוכנים בניגוד שונים שניתן להשתמש בהם כדי להאיר היבטים שונים ההלחנה של IVD. אנחנו מדגימים כאן שימוש Ioversol, סוכן הידרופילי יוד המכילה הלא ציטוטוקסיות 10, וחומצת phosphomolybdic (PMA), מולקולת רוק כבד כי chelates למשקעי אמינו קולגן. שימוש בניגוד הסוכנים הללו, התכונות microstructural של IVD יכול להיות מודגשים וזיהו. Ioversol מבדיל בין הידרציה היחסי של רקמות IVD, ובכך מתן הניגוד בין pulposus גרעין עשירים במים ואת fibrosus annulus hydrated פחות.PMA מספק בידול של רכב קולגן יחסי רקמות ידגיש הסוף-צלחות, annulus fibrosus, ואת notochord. Ioversol ניתן להשתמש במהלך התרבות כדי לקבוע את השינויים האורך הידרציה, בעוד PMA ניתן להחיל את IVD בנקודת הטרמינל של תרבות לנטר שינויים קולגן.

יישומים עתידיים של הטכנולוגיה הזו כוללים ניצול זנים אחרים של עכברים טרנסגניים ו בנוקאאוט להבין היבטים שונים של ניוון IVD במחלות אחרות. יתר על כן, היא פלטפורמה פוטנציאל לתרבות משותפת עם מערכות איברים אחרות ותאיים כגון גרעיני שורש הגבה לזהות אינטראקציות שיכולים לתרום IVD ניוון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים של כתב היד הזה מצהירים כי אין להם שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המחקר השלד והשרירים אוניברסיטת וושינגטון (AR057235 P30 NIH), מרכז הדמיה מולקולרית (CA094056 P50 NIH), Mechanobiology הדרכה גרנט (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, ו- NIH K01AR069116. המחברים מבקשים להודות פטריק וונג על תרומתו באיסוף הנתונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter