Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

en doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

Hele organkultur av mellomvirvelskiven (IVD) bevarer det native ekstracellulære matriks, celle fenotyper, og cellulær-matriks-vekselvirkninger. Her beskriver vi en IVD kultur system ved hjelp av musen korsryggen og caudal IVDs i deres funksjonelle spinal enheter og flere programmer som bruker dette systemet.

Abstract

Mellomvirvelskive (IVD) degenerasjon er en betydelig bidragsyter til ryggsmerter. IVD er en fibrocartilaginous ledd som tjener til å overføre og dempe belastninger i ryggraden. IVD består av et proteoglykan-rik nucleus pulposus (NP) og et kollagenrikt ringrommet fibrosis (AF) klemt av bruskendeplater. Sammen med de tilstøtende ryggvirvler, danner virvler-IVD struktur en funksjonell ryggrad enhet (FSU). Disse mikrostrukturene inneholder unike celletyper samt unike ekstracellulære matriser. Hele organkultur av FSU bevarer den opprinnelige ekstracellulære matriks, av celledifferensiering fenotyper, og cellulær-matriks-vekselvirkninger. Således, organkulturteknikker er særlig nyttige for å undersøke de komplekse biologiske mekanismer for IVD. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming tilnærming for dyrking hele korsrygg mus FSU som gir en ideell plattform for å studere sykdomsmekanismer og terapier for IVD. Videre beskriver vi several applikasjoner som benytter denne organkultur-metoden for å gjennomføre ytterligere studier, inkludert kontrastforsterket avbildning microCT og tredimensjonale høy oppløsning endelig elementmodellering av IVD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ryggsmerter (LBP) er den ledende faktor for global funksjonshemming og tapt produktivitet på arbeidsplassen, og amerikanerne alene bruker i overkant av 50 milliarder dollar på LBP behandling 1. Selv utbredt, forblir etiologien av LBP kompleks og multifaktoriell. Imidlertid er mellomvirvelskive (IVD) degenerasjon blant de mest betydelige risikofaktorer for LBP 2.

IVD består av tre mikrostrukturer: det ytre ringrommet fibrosis (AF), den indre nucleus pulposus (NP), og to endeplater brusk denne sandwich hele strukturen proksimalt og distalt 3. Med aldring og degenerasjon, IVD komponentene endres strukturelt, sammensetningsmessig og mekanisk 4. Disse endringene omfatter tapet av proteoglykaner og hydrering i NP, redusert skivehøyde, og svekket mekanisk kompetanse 5. Disse endringene erofte ledsaget av cytokiner som fremmer en inflammatorisk respons, så vel som nøytrofil og dorsalrotganglion inntrengning i leddrommet som kulminerer i en kaskade av hendelser som fører til LBP symptomer 6.

Å studere mekanismene for IVD degenerasjon er utfordrende hos mennesker, fordi det ofte ikke er mulig å isolere årsaken til degenerasjon før forekomsten av ryggsmerter. Således, en reduksjonistisk tilnærming for å forenkle den eksperimentelle system ned til IVD organ tillater mekanistisk finjustering av årsaksvariabler og undersøke deres nedstrøms effekter 5. Systemet er redusert til bare den opprinnelige cellepopulasjon og omgivende ekstracellulær matriks, slik at den direkte tolkning av virkninger av eksterne stimuli på IVD degenerasjon. Videre er den lavere pris og skalerbarhet av murine modeller, så vel som det store antall av genetisk modifiserte dyr 7, gi rom for than rask målrettet screening av IVD degenerative mekanismer og mulige behandlinger. Her beskriver vi et murint organkultursystem i hvilket IVD cellulær og vev stabilitet blir opprettholdt i løpet av 21 dager, med spesiell vekt gitt til IVDs' homeostatiske, mekaniske og strukturelle, og inflammatoriske mønstre. Ved hjelp av denne metode, overvåker vi IVDs' funksjonelle forandringer i en stikk-indusert skade-modell 8 for å forstå mekanismene bak platen degenerasjon. Videre beskriver vi en rekke anvendelser av denne organkultur-metoden for å gjennomføre ytterligere studier, inkludert kontrastforsterket avbildning microCT og tredimensjonale høy oppløsning modellering av IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Washington University i St. Louis Dyreforsøk komiteen.

1. Dyr

  1. Oppnå to stammer av mus: 10 uker gamle BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) og 10 uker gamle nukleær faktor kappa-B-luciferase reporter dyr (NF-κβ-Luc) oppdrettet på en BALB / c bakgrunn (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
  2. Før disseksjon, avlive dyrene med CO 2 overdose ved en strømningshastighet på 2,5 til 3 l / min i 5 minutter, fulgt av ytterligere 2 min av oppholdstiden.
  3. Desinfisere den utenfor området for dyret ved å bade det i en 70% etanol-bad i 2 min før disseksjon.

2. Dissection

  1. Gjøre et langsgående vertikalt snitt på den dorsale overflaten av mus ved hjelp av små disseksjon saks for å utsette kroppshulrom.
  2. Lag to langsgående vertikale kutt på hver sin side av dyrets ryggraden ved å starte fraden første lumbale ryggvirvler (L1) i den kaudale virvler (C8).
  3. Ved hjelp av en skalpell, fin pinsett, og fine disseksjon saks, forsiktig fjerne ryggraden fra L1-C8 fra dyrets kroppshulrom.
  4. Fjern forsiktig overskudd bløtvev som omgir ryggmargen, samtidig som man sikrer ikke å skrape eller skade på IVD på den ventrale side.
  5. Ytterligere dissekere ryggsøylen til virvler-plate-virvler funksjonelle ryggradsenheter (FSU) på L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, C7 og / C8 plater.
  6. Skyll FSU i Hanks balanserte saltløsning supplementert med 1% penicillin-streptomycin i 2 min.
  7. Tilfeldig tildele FSU i tre grupper: ubehandlet uncultured og FSU (fersk), kultivert men ubehandlet FSU (kontroll), og dyrket og stikk behandlet FSU (Stab).
  8. Snap fryse Frisk FSU prøvene med flytende nitrogen umiddelbart etter disseksjon og oppbevares i en -20 ° C fryser.

3. Organ Kultur betingelser

  1. Forbered 500 ml sterilt dyrkingsmedier av 1: 1 Dulbeccos modifiserte Eagles medium: næringsblanding F12 (DMEM: F12) supplert med 20% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin.
  2. Anvendelse av 10 ml serologiske pipetter, pipettes 2 ml kulturmedium i hver brønn av en 24-brønners kulturplate.
  3. Etter disseksjon og skyll, plassere hver FSU i en individuell brønn i mediene fylte 24-brønners plate.
  4. Prøvene inkuberes i en steril inkubator som holder 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og> 90% fuktighet.
  5. Etter en innledende dyrkningsperiode på 24 timer, mekanisk skade stavforbindelsen gruppeprøver via nålestikk av ringrommet fibrosus ved hjelp av en steril 27-gauge nål, som vist i figur 1A.
  6. Endre medium hver 48 t ved å fremstille en ny media fylt 24-brønns kulturplate, og overføring av prøvene fra den gamle platen til de nye ved hjelp av sterile pinsetter. Aspirer de gamle medier og disponiblee av den gamle kulturen plate i en biohazard avfallet.
  7. På den siste dag av kulturen inkuberes alle prøver i medium inneholdende 0,75 mg / ml nitroblått tetrazoliumklorid i 24 timer.
  8. Etterpå fryse alle de FSU med flytende nitrogen og oppbevares i en -20 ° C fryser inntil de er klare for mekanisk testing eller histologi (figur 1B).

4. Langsgående Målinger NF-KB

  1. Bilde den FSU fra NF-κβ-luciferase dyr ved 1, 5, 13, og 19 dager for å vurdere NF-kB uttrykk.
  2. Tilsett 10 ul av 1 mg / ml luciferin-løsning til hver brønn og inkuber i en steril inkubator ved 37 ° C i 10 min.
  3. Bilde prøvene i bioluminescens ved bruk av avbildningssystem med en 1 min eksponeringstid og bin innstilling av to.
  4. Samtidig bruke maskinen til å ta et bilde og kle det med bioluminescence bildet for å bestemme den anatomiske plasseringen av luminescens i IVD.
  1. Bestem den mekaniske oppførselen til IVDs ved hjelp av fortrengning-styrt dynamisk kompresjon 9.
  2. Ved hjelp av en diseksjonsmikroskop, skalpell og pinsetter, fjerne bony vertebrale legemer av FSU fra hver prøve samtidig som de bruskaktige endeplatene intakt og festet til IVD.
  3. Feste de isolerte IVDs til en 1 cm x 1 cm x 0,2 cm aluminiumplate ved hjelp av cyanoakrylat-lim.
  4. Mål platen høyde og bredde ved å ta et gjennomsnitt av tre målinger på lengdeaksen av hver plate ved hjelp av en laser mikrometer. Beregn platen høydeforhold ved å dividere den gjennomsnittlige platen høyde med maksimal platebredden.
  5. Bruke den målte skivehøyden for å beregne inngangs deformasjonsverdier brukes i mekanisk testing. Legg merke til at den gjennomsnittlige skivehøyden var omtrent 690 um ± 39 um.
  6. Plassere prøvene i en fosfat-bufret saltløsning bad under compressipå maskinen, og forhånds platen til 0,02 N.
  7. Syklisk komprimering av platen ved hjelp av en sinusformet bølgeform ved 1 Hz til 20 sykluser ved 1% belastning-nivå og 5% belastning nivå for 3 forsøk hver og ta opp belastningen og forskyvningsverdiene til IVD. Tillat 10 minutts hvile tid mellom forsøkene for platen til å slappe av og for å forhindre skade.
  8. Beregne den gjennomsnittlige stivheten fra lastefasen av den siste syklus, og beregne den dynamiske tapsfaktor fra fasevinkelen mellom belastnings og forskyvningsdata.

6. proteocrlykanfierning og kollagen Kvantifisering

  1. Etter mekanisk testing, måle platen våtvekt ved å plassere den isolerte IVD i en pre-tarert sentrifugerør og måling av vekt ved hjelp av en analysevekt.
  2. Fordøye de isolerte IVDs i 250 ul papain fordøyelse oppløsning (0,1 M natriumacetat, 0,01 M EDTA, 0,005 M cystein-HCl, pH 6,4) over natten ved 65 ° C med en motorvarmer.
  3. Å sentrifugere prøven 10 minved 2000 xg og samle den overstående væske.
  4. Mål proteoglycan innholdet av IVD ved hjelp av dimetylmetylen blå (DMMB) assay med chondroitin sulfat standarder.
  5. Fremstill DMMB oppløsning (21 mg DMMB, 5 ml absolutt etanol, 2 g natriumformat i 1 L DDH 2 O).
  6. Pipetter 30 ul standarder og prøver i triplikat i en 96-brønns plate, sammen med 250 ul av DMMB oppløsningen i hver brønn.
  7. Les av absorbansen av platen ved 525 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
  8. Mål kollagen innholdet ved hjelp av en hydroksyprolin analysesett i henhold til produsentens instruksjoner.

7. Histologi

  1. Fastsette en undergruppe av prøvene i 4% paraformaldehyd i 24 timer, de-forkalke i 5% maursyre i 48 timer, dehydratisere med etanol, og legge inn i parafin.
  2. Ved hjelp av en mikrotom, seksjon prøvene sagittally ved 10 um tykkelse og anvende seksjoner for objektglass. Flekk snitt ved bruk av safranin-O / Fast Green og DAPI.
  3. Ved hjelp av et lysmikroskop, glir bildet ved 10X forstørrelse.

8. Kontrastforsterket microComputed tomografi (microCT)

  1. Skanne et undersett av prøver ved 0, 2, 5, og 7-dagers tid punkter ved hjelp av langsgående ioversol kontrastforsterkning 10, og terminal fosfomolybdensyre (PMA) i kontrastforbedring ved 7 dagers tidspunkt.
  2. 4 h før microCT skannetiden, tilsett 300 pl 350 mg / ml jod ioversoloppløsning til kulturmedier for en endelig konsentrasjon på omtrent 50 mg / ml jod-inneholdende ioversol løsning og inkuberes i en steril inkubator ved 37 ° C i 4 h.
  3. Etter inkubering, vikle prøven i sterilt gasbind og plasser i en 1 ml mikrosentrifugerør.
  4. Plasser prøver i microCT system og skanning ved 45 keVp, 177 uA, 10,5 um voxel størrelse, og 300 ms integrasjons.
  5. Eksportere data fra microCT som DICOM-filer og visualisere ved hjelp av programvare (
  6. Ved 7-dagers tidspunkt, feste prøver ved å bruke en 4% paraformaldehydløsning i 24 timer, etterfulgt av 5% PMA oppløsning i 3 dager, og skanne med de samme innstillinger som de som anvendes i trinn 8.4.

9. Three Dimensional elementmodellering

  1. Segment DICOM filer av IVDs ved hjelp av programvare med manuell thresholding (f.eks OsiriX).
  2. Konverter NP og AF volumer av IVD til voxel-baserte element maskene ved hjelp av Meshlab.
  3. Kombiner de mikrostrukturer av NP og AF å danne en komplett IVD og bruke eksperimentelt bestemte grensebetingelser i element programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figurene 2-3 viser representative resultater fra proteoglykan fordeling, NF-KB-ekspresjon, stivhet, viskositet, skivehøyde, og våtvekt for dyrkede mus IVDs. Dersom det ble dyrket på riktig måte, bør IVD parametrene for kontrollgruppen ikke være signifikant forskjellig fra den friske gruppe. Hvis dyrkningen er infisert eller på annen måte svekket, vil kontrollgruppen være forskjellig fra den friske gruppe, spesielt i NF-KB-ekspresjon og proteoglykaner fordeling (resultater ikke vist). Figurene 4-5 viser anvendelser av organkultur ved å bruke kontrastforsterket microCT for å oppnå en tredimensjonal modell av IVD; Videre kan endelig elementmodellering brukes om disse strukturer for å fastslå vev spennings- og belastningsfordelinger grunn av den globale mekaniske oppførsel.

Figur 1
Figur 1. Eksperimentelloversikt. (A) i mellomvirvelskive funksjonelle ryggradsenheter (FSU) ble skåret fra det lumbale og caudale segmenter; de FSU inneholdt to intakt ryggvirvler, bruskendeplatene, og den mellomvirvelskiven. (B) Ved å følge disseksjon, ble prøvene delt i behandlingsgrupper og dyrket in vitro i 21 dager. Deretter ble en undergruppe av prøver som brukes for mekanisk testing og biokjemiske analyser, mens en annen undergruppe av prøver ble anvendt for histologisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 2. Histologi og NF-kB uttrykk. (A) Etter 21 dager i kultur, viser safranin O-farging (rød) som proteoglykan-innhold opprettholdesbåde i AF og NP i kontrollprøvene. (B) det stikkprøver (punkteringsstedet antydet med pil), viste redusert proteoglykan innhold i både AF og NP. (C) Tetrazolium blåfarging (blå) viser co-lokalisering. (D) DAPI farging viser at cellene er metabolsk aktiv, og levedyktige etter 21 dager i organkultur. (E) NF-kB-ekspresjon i både kontroll- og Stab prøvene indikerer også at IVD er levedyktig og som reagerer på omgivelsene. Sentreringsdel prøvene har økt NF-kB uttrykk ved 1, 5, 13, og 19-dagers tidspunkter. Lumbale IVDs Her vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 3. mekanikk og sammensetning. ( B) Mekanisk testing viste at ved 1% og 5% strekknivå, Stab stivheten til prøvestykker og tapsfaktoren lavere verdier i forhold til kontrollprøvene. (C - D) Biokjemisk analyse viste at sammensetningsmessig, Stab prøvene hadde lavere proteoglykan og kollagen-innhold (normalisert til våt vekt) i forhold til kontrollprøvene. (E - F) Strukturelt Stab prøver hadde en redusert plate høydeforhold og våt vekt i forhold til kontroller. Mekanisk, sammensetningsmessig og strukturelt, friske og kontrollprøver verdier var ikke signifikant forskjellige fra hverandre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 4. Kontrastforsterket microCT visualization. Kontrastforsterket microCT kan anvendes for å visualisere IVD i tre dimensjoner i løpet av dyrkningsperioden. Hale IVDs Her vises. Den differensiell binding av ioversol til AF (lavere demping) og NP (høyere dempning) gjør det mulig å skjelne den AF fra NP. Omvendt, PMA bindes fortrinnsvis til kollagen restene i AF (høyere dempning), endeplatene, og ryggstreng. Bildene ble visualisert ved anvendelse av farge, slik som hvit representerer høy dempning, gul representerer medium dempning, og rød representerer lav dempning. (A - E) sagittale visninger av IVD på dag 0, 2, 5, og 7 med ioversol kontrast, og med PMA kontrast. (F - J) Tverr utsikt over IVD på dagene 0, 2, 5 og 6 med ioversol kontrast, og med PMA kontrast. Hale IVDs Her vises. Klikk her for å vise en laRger versjon av denne figuren.

Figur 1
Figur 5. Finite element modellering (FEM) av IVD-struktur. FEM-analyse er et kraftig matematisk verktøy som gjør det mulig å beregne lokale materiale respons til større grensebetingelser. For eksempel, (A) NP kan gjøres separat fra (B) AF, og hvert kammer kan bli tildelt unike konstitutive egenskaper. (C) En kombinert IVD struktur med både AF og NP er vist i 3D. Når aksiale belastninger som påføres på platen på den overlegne endeplaten med den nedre endeplate er en fast kant, kan vi bestemme de lokale konsentrasjonene av påkjenninger og belastninger. Gule prikker og sorte piler representerer en knutepunkt belastning påføres. Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen beskriver en organkultur av den murine FSU med vekt på å kartlegge de biologiske endringer i IVD. Den vellykkede vedlikehold av disse kulturene krever nøye sterile teknikker. Spesielt disseksjonen trinn 2,1-2,6 og dyrkningstrinnene 3,1-3,6 krever spesiell omsorg for å sikre sterile betingelser blir opprettholdt, og denne fremgangsmåten skal utføres fortrinnsvis i et isolert rom prosedyre med et HEPA luftmengde for å minimalisere forurensning. Fordi disseksjon prosessen fører til traumer til vevet, blir den 24-timers forbehandling periode på 3,5 nødvendig for alle behandlingsgrupper, inkludert kontrollene. Levedyktigheten analyser kan anvendes for å sikre at prøvene er levende og uforurenset, og også tjene som en bekreftelse på at cellulær homeostase opprettholdes. De NF-KB luminescens opplesninger kan også brukes til å overvåke i lengderetningen av inflammatorisk respons i dyrkede FSU; en økning i NF-kB expression under dyrkingen kan indikere den FSU er kontaminert eller på annen måte under stress fra infeksjon 11, og vi således inkludere det her som en mulig feilsøkingen. Endelig sammenligninger til den friske grupper tjene som en ytterligere kontroll punkt for kontrollprøvene i dyrkede histologi og mekanisk ytelse. Denne kulturen teknikken er mottagelig for flere prøver per plate, og i vår erfaring, kan opp til 24 prøver på en 24-brønns plate lett oppnås. Imidlertid multipleksing av prøvene forplanter seg også risikoen for kryss-kontaminering og således, er det anbefalt at FSU dyrkes på separate plater under feilsøking. I tillegg, mens denne protokollen gir instruksjoner for en dyrkningsperiode på 21 dager, den samme metode kan brukes for dyrkingsperioder som er lengre eller kortere. FSU har blitt dyrket ved vårt laboratorium for kultur perioder fra 1 uke til 5 uker.

Like alle modeller, organkultur modeller i mus har begrensninger, spesielt i deres evne til å fange opp de belastningsbetingelsene for mennesker. Det finnes også små forskjeller i geometri mellom de murine og humane IVDs 12, og mennesker er tobent med hovedsakelig aksiale belastninger på ryggraden samtidig som rotter og mus er firbente. Men siden dyrket tilstanden er relativt ubelastet i sin nåværende form er den lastemodusen vil sannsynligvis ikke har påvirket IVDs. Andre systemer slik som bovin IVD organkultur modeller 13, 14 kan være bedre egnet for mekaniske og lasting interaksjoner. Det videre arbeidet vil innlemme belastningsforhold for å muliggjøre undersøkelse av mechanobiological interaksjoner mellom mekaniske og miljømessige faktorer. Kraften av denne fremgangsmåte ligger i dens konsistens, allsidighet, og mulighet for høy oppløsning avbildning. Vår tilnærming her viser at det er mulig å dyrke både korsryggen og caudal IVDs, men det er viktig å merke seg at disse platene er anatomisk forskjellig på tvers av aldring og utvikling 15. Som sådan, vår eksperimentell design randomiserer korsryggen og caudal nivåer separat.

Kontrastforsterket microCT tillate høy oppløsning, ikke-destruktiv, tre-dimensjonal avbildning av IVD. Ulike kontrastmidler kan brukes til å fremheve ulike kompositoriske aspekter av IVD. Vi viser her at bruken av ioversol, en jod-inneholdende ikke-cytotoksiske hydrofilt middel 10, og fosfomolybdensyre (PMA), et tungmetall molekyl som chelaterer til kollagen aminorester. Ved hjelp av disse kontrast-midler, kan mikrostrukturene trekk som fremgår av IVD bli markert og identifisert. Ioversol skiller den relative fuktighet av IVD vev, for derved å gi kontrast mellom den vannrike nucleus pulposus, og den mindre hydratiserte ringrommet fibrosus.PMA gir differensiering av relativ kollagen sammensetning i vevene, og vil fremheve de endeplater, ringrommet fibrosus, og ryggstreng. Ioversol kan brukes under dyrking for å bestemme de langsgående forandringer i fuktighet, mens PMA kan påføres på IVD ved endepunktet av kulturen for å overvåke endringer kollagen.

Fremtidige anvendelser av denne teknologi omfatter anvendelse av andre stammer av transgene mus og knockout å forstå ulike aspekter av IVD-degenerasjon i andre sykdommer. Videre er det en potensiell plattform for ko-kultur med andre organsystemer og celler slik som dorsalrotganglia for å identifisere interaksjoner som kan bidra til IVD degenerasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne av dette manuskriptet erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Washington University i muskler Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Trening Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, og NIH K01AR069116. Forfatterne ønsker å takke Patrick Wong for hans bidrag i datainnsamling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter