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Bioengineering

A doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

cultura de órgão inteiro do disco intervertebral (IVD) preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos celulares, e interacções de matriz celular. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura IVD utilizando lombar do mouse e IVDs caudal em suas unidades da coluna vertebral funcionais e várias aplicações que utilizam este sistema.

Abstract

degeneração do disco intervertebral (IVD) é um contribuinte significativo para a dor lombar. O IVD é uma joint fibrocartilaginous que serve para transmitir e amortecer cargas na coluna vertebral. O IVD consiste de um pulposo rica em proteoglicanos núcleo (NP) e um anel fibrose rico em colagénio (AF) ensanduichado por placas terminais cartilaginosas. Juntamente com as vértebras adjacentes, a estrutura vértebras-IVD forma uma unidade funcional coluna (FSU). Estas microestruturas contêm tipos de células únicas, bem como matrizes extracelulares únicas. cultura de órgão inteiro do FSU preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos de diferenciação celular, e interacções de matriz celular. Assim, as técnicas de cultura de órgãos são particularmente úteis para a investigação dos mecanismos biológicos complexos da IVD. Aqui, descrevemos uma abordagem de alto rendimento para a cultura FSUs rato lombar inteiro que fornece uma plataforma ideal para estudar os mecanismos da doença e terapias para o IVD. Além disso, descrevemos several aplicações que utilizam este processo de cultura de órgão para conduzir mais estudos de imagiologia incluindo microCT com contraste e tridimensional de alta resolução de modelagem de elemento finito da IVD.

Introduction

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Dor lombar (LBP) é o principal fator para a deficiência global e perda de produtividade no local de trabalho, e os americanos sozinho gastar em excesso de 50 bilhões de dólares em tratamento LBP 1. Embora prevalente, a etiologia da LBP permanece complexa e multifatorial. No entanto, disco intervertebral (IVD) degeneração está entre os factores de risco mais importantes para a LBP 2.

O IVD é feito de três microestruturas: a fibrose exterior do anel (FA), o interior do núcleo pulposo (NP), e duas placas extremas cartilaginosos que sanduíche toda a estrutura proximal e distalmente 3. Com o envelhecimento ea degeneração, os componentes IVD mudar estruturalmente, de composição, e mecanicamente 4. Estas alterações incluem a perda de proteoglicanos e hidratação da NP, diminuição da altura do disco, e deteriorou competência mecânico 5. Estas alterações sãomuitas vezes acompanhada de citoquinas que promovem uma resposta inflamatória, bem como de neutrófilos e gânglio da raiz dorsal de intrusão no espaço da articulação culminando numa cascata de eventos que levam à sintomas LBP 6.

O estudo dos mecanismos de degeneração IVD é um desafio em seres humanos, porque muitas vezes não é possível isolar a causa da degeneração antes da ocorrência de dor lombar. Assim, uma abordagem redutora de simplificar o sistema experimental para baixo para o órgão IVD permite o ajuste fino mecanicista de variáveis causais e examinando os seus efeitos a jusante 5. O sistema é reduzida para apenas a população celular nativo e matriz extracelular circundante, permitindo assim que a interpretação directa dos efeitos de estulos externos sobre a degeneração IVD. Além disso, o custo mais baixo e escalabilidade de modelos de murino, bem como o grande número de animais geneticamente modificados 7, para permitir que tele triagem direcionada rápida de mecanismos degenerativas IVD e terapias potenciais. Aqui, descrevemos um sistema de cultura de órgãos de murino em que IVD estabilidade celular e do tecido é mantida ao longo de 21 dias, com foco específico dado de padrões homeostáticos, mecânicas, estruturais e inflamatórias dos IVDs. Usando esse método, podemos monitorar as mudanças funcionais dos IVDs em um modelo de lesão induzida por facada 8 de compreender os mecanismos por trás degeneração do disco. Além disso, nós descrevemos várias aplicações deste processo de cultura de órgão para conduzir mais estudos de imagiologia incluindo microCT com contraste e modelação tridimensional de alta resolução da IVD.

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Protocol

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Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a Universidade de Washington em Comissão Estudos Animais St. Louis.

1. Os animais

  1. Obter duas estirpes de ratinhos: 10 semanas de idade BALB / c (n = 6, Balb-H, BALB / cAnNTac) e 10 semanas os animais velhos do factor nuclear kappa-B-luciferase repórter (NF-κβ-luc) criado numa ratinhos BALB / c de fundo (n = 6, ratinhos BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
  2. Antes da dissecção, sacrificar os animais com CO 2 sobredosagem a uma taxa de fluxo de 2,5-3 L / min durante 5 min, seguido por uma 2 min adicional de tempo de permanência.
  3. Desinfectar a região exterior do animal por banhar-lo em um banho de etanol a 70% durante 2 min antes da dissecação.

2. Dissecção

  1. Fazer um corte vertical e longitudinal na superfície dorsal do rato usando pequenas tesouras de dissecação para expor a cavidade do corpo.
  2. Fazer dois cortes verticais longitudinais de cada lado da espinha dorsal do animal a partir dea primeira vértebra lombar (L1) até às vértebras caudais (C8).
  3. Usando um bisturi, uma pinça fina, e tesouras de dissecação finas, retire cuidadosamente a coluna vertebral de L1-C8 da cavidade do corpo do animal.
  4. Cuidadosamente remover o excesso de tecidos moles em torno da coluna vertebral, enquanto assegurando a não raspar ou ferir o IVD no lado ventral.
  5. Além disso dissecar a coluna vertebral em vértebras-disco-vértebras da coluna vertebral unidades funcionais (FSU) no L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, e discos C7 / C8.
  6. Lavar o FSU em solução salina equilibrada de Hank suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina durante 2 min.
  7. Aleatoriamente atribuir os FSUs em três grupos: sem cultura e não tratada FSU (fresca), cultivadas mas não tratada FSU (Controlo), e cultivadas e tratadas facada FSU (Stab).
  8. Encaixe congelar as amostras frescas FSU com azoto líquido imediatamente após a dissecação, e armazenar em congelador a -20 ° C.

3. Condições cultura de órgão

  1. Preparar 500 mL de meio de cultura estéril de 1: 1 de meio Dulbecco modificado por Eagle: Mistura de Nutrientes F12 (DMEM: F12) suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Usando 10 mL pipetas serológicas, pipeta de 2 ml de meio de cultura em cada cavidade de uma placa de cultura de 24 poços.
  3. A seguir a dissecção e enxaguar, colocar cada FSU em uma cavidade individual na placa de 24 poços cheios com meios de comunicação.
  4. Incubar as amostras numa incubadora esterilizada que mantém a 37 ° C, 5% de CO2, 20% de O2 e> 90% de humidade.
  5. Após um período de cultura inicial de 24 h, mecanicamente ferir as amostras Stab grupo por punção de agulha do anel fibroso usando uma agulha estéril de calibre 27, como mostrado na Figura 1A.
  6. Mudar meios a cada 48 h através da preparação de uma nova placa de cultura de 24 poços cheios com meios de comunicação e de transferência de amostras da placa de idade para os novos usando pinças estéreis. Aspirar a velha mídia e dispose da placa de cultura de idade em um caixote do lixo de risco biológico.
  7. No último dia da cultura, todas as amostras incubar em meios contendo 0,75 mg / mL de cloreto de nitro azul de tetrazólio durante 24 h.
  8. Em seguida, congelar todo o FSU com azoto líquido e armazenar em congelador de -20 ° C até estar pronto para o teste mecânico ou histologia (Figura 1B).

4. As medições longitudinais NF-kB

  1. Imagem a FSU a partir de animais-NF-κβ luciferase a 1, 5, 13, e 19 dias para avaliar a expressão de NF-kB.
  2. Adicionar 10 uL de solução a 1 mg luciferina / mL a cada poço e incubar numa incubadora estéril a 37 ° C durante 10 min.
  3. Imagem as amostras para a bioluminescência, utilizando o sistema de imagem com um tempo de exposição de 1 min e configuração do compartimento de dois.
  4. Ao mesmo tempo, usar a máquina para tirar uma fotografia e cobri-la com a imagem de bioluminescência para determinar a localização anatômica de luminescência no IVD.
  1. Determinar o comportamento mecânico das IVDs usando compressão dinâmica controlada pelo deslocamento 9.
  2. Usando um microscópio dissecção, escalpelo e pinças, remover os corpos vertebrais ósseas do FSU a partir de cada amostra, mantendo as placas terminais cartilaginosas intacto e ligado ao IVD.
  3. Anexar as IVDs isolados para uma placa de alumínio de 1 cm x 1 cm x 0,2 centímetros utilizando cola de cianoacrilato.
  4. Medir a altura do disco e largura, tendo uma média de três medições no eixo longitudinal de cada disco, utilizando um micrómetro de laser. Calcular a proporção da altura do disco dividindo a altura média do disco pela largura máxima do disco.
  5. Utilizar a altura do disco medido para calcular os valores de tensão de entrada utilizados em testes mecânicos. Note-se que a altura média do disco foi de aproximadamente 690 ± 39? M? M.
  6. Coloque as amostras em um banho de solução salina tamponada com fosfato sob a compressina máquina e pré-carregar o disco a 0,02 N.
  7. Ciclicamente comprimir o disco, utilizando uma forma de onda sinusoidal a 1 Hz durante 20 ciclos ao nível de tensão de 1% e nível de tensão de 5% para cada 3 ensaios e gravar os valores de carga e de deslocamento da IVD. Permitir 10 minutos de descanso tempo entre ensaios para o disco para relaxar e para evitar ferimentos.
  8. Calcular a rigidez média a partir da fase de carga do último ciclo, e calcular a perda tangente do ângulo de fase entre os dados de carga e deslocação.

6. proteoglicanos e colágeno Quantificação

  1. Seguindo o teste mecânico, medir o peso húmido do disco colocando o IVD isolado em um tubo de centrífuga previamente tarado e medindo o peso, utilizando uma balança analítica.
  2. Digerir os IVDs isolado em 250 ul solução de digestão de papaína (0,1 M acetato de sódio, 0,01 M de EDTA, 0,005 M de cisteína HCl, pH 6,4) durante a noite a 65 ° C utilizando um aquecedor de bloco.
  3. Centrifugar as amostras durante 10 mina 2000 xg e recolher o fluido sobrenadante.
  4. Medir o teor de proteoglicano da IVD utilizando o ensaio de azul de dimetilmetileno (DMMB) com padrões de sulfato de condroitina.
  5. Preparar a soluo de DMMB (21 mg DMMB, 5 mL de etanol absoluto, 2 g de formiato de sódio em 1 L de ddH 2 O).
  6. Pipetar 30 ul dos padrões e amostras, em triplicado, numa placa de 96 pos, juntamente com 250 mL de solução de DMMB em cada poço.
  7. Leia a absorvância da placa a 525 nm utilizando um espectrofotómetro.
  8. Medir o teor de colagénio usando um kit de ensaio de hidroxiprolina de acordo com as instruções do fabricante.

7. Histologia

  1. Fixar um subconjunto das amostras em 4% de paraformaldeído durante 24 h, de-calcificar em ácido fórmico a 5% durante 48 h, desidratar com etanol, e incorporar-se em parafina.
  2. Utilizando um micrótomo, as amostras de secção sagital em 10 de espessura e aplicar secções de lâminas de vidro. Manchar as seções usando safranina-O / Fast Green e DAPI.
  3. Usando um microscópio de luz, imagem desliza em aumento de 10x.

8. Contraste-enhanced microComputed Tomografia (microCT)

  1. Digitalizar um subconjunto de amostras nos pontos de tempo 0, 2, 5, e 7 dias usando longitudinal Ioversol realce 10, e de ácido fosfomolíbdico (PMA) realce terminal no ponto de tempo de 7 dias.
  2. 4 horas antes da microCT tempo de varredura, adicionam-se 300 uL de 350 mg / mL de solução de iodo Ioversol para o meio de cultura para uma concentração final de aproximadamente 50 mg de solução Ioversol / mL contendo iodo e incubar numa incubadora estéril a 37 ° C durante quatro h.
  3. Após a incubação, a amostra embrulhar em gaze estéril e colocar num tubo de microcentrífuga de 1 mL.
  4. Colocar as amostras no sistema microCT e digitalizar em 45 keVp, 177 mA, 10,5 tamanho mm voxel, e 300 ms integração.
  5. Exportar dados do microCT como arquivos DICOM e visualizar usando software (
  6. No ponto de tempo de 7 dias, corrigir amostras usando uma solução de paraformaldeído a 4% durante 24 h, seguido por solução a 5% de PMA durante 3 dias, e digitalizar utilizando as mesmas definições como as utilizadas na etapa 8.4.

9. Tridimensional Modelação Elementos Finitos

  1. Segmento os arquivos DICOM dos IVDs usando software com limiarização manual (por exemplo, OsiriX).
  2. Converter os volumes NP e AF do IVD em malhas de elementos finitos baseada em voxel usando MeshLab.
  3. Combine as microestruturas da NP e AF para formar um IVD completa e aplicar condições de contorno determinadas experimentalmente no software de elementos finitos.

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Representative Results

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As Figuras 2-3 mostram resultados representativos de distribuição de proteoglicano, a expressão de NF-kB, a rigidez, a viscosidade, a altura do disco, e peso molhado para IVDs cultivadas de ratinho. Se cultivadas adequadamente, os parâmetros IVD do grupo de controlo não deve ser significativamente diferente do grupo de fresco. Se a cultura está infectado ou de outro modo comprometida, o grupo de controlo irá ser diferente do grupo de fresco, especialmente na expressão de NF-kB e de distribuição de proteoglicano (resultados não mostrados). As Figuras 4-5 mostra as aplicações de cultura de órgão para usando microCT intensificação de contraste para obter um modelo tridimensional da IVD; Além disso, a modelagem de elemento finito pode ser aplicada a essas estruturas, para determinar a distribuição de tensões e deformação do tecido devido ao comportamento mecânico global.

figura 1
Figura 1. ExperimentalVisão geral. (A) do disco intervertebral da coluna vertebral unidades funcionais (FSUs) foram dissecadas do lombar e segmentos caudais; o FSU continha duas vértebras intactas, as placas terminais cartilaginosas, e o disco intervertebral. (B) Após dissecção, as amostras foram divididas em grupos de tratamento e cultivados in vitro durante 21 dias. Depois disso, um subconjunto das amostras foi usada para testes mecânicos e ensaios bioquímicos, enquanto um outro subconjunto de amostras foi usado para análise histológica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figura 1
Figura 2. Histologia e a expressão de NF-kB. (A) após 21 dias em cultura, safranina O coloração (vermelho) mostra que o conteúdo de proteoglicanos é mantidaem ambos o AF e NP nas amostras de controlo. (B) As amostras de Stab (local de punção indicado pela seta) apresentaram o decréscimo do conteúdo de proteoglicano em ambos o AF e NP. (C) coloração azul de tetrazólio (azul) mostra a co-localizao. (D) DAPI coloração mostra que as células são metabolicamente activo e viável após 21 dias em cultura de órgão. Expressão (E) de NF-? B em ambas as amostras, de controlo e Stab também indicam que o IVD é viável e que responde ao seu ambiente. As amostras Stab aumentaram a expressão de NF-kB, no 1, 5, 13, e pontos de tempo de 19 dias. IVDs lombares são mostrados aqui. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figura 1
Figura 3. Mecânica e composição. ( B) Ensaio mecânico mostraram que a nível de tensão de 1% e 5%, os valores de tangente de rigidez e perda de amostra são Stab inferior relativamente ao controlo de amostras. (C - D) Os ensaios bioquímicos revelaram que em termos de composição, amostras de Stab tinha proteoglicano inferiores e teor de colagénio (normalizado para molhar peso) relativamente ao controlo de amostras. (E - F) Estruturalmente, as amostras Stab tinha uma proporção da altura do disco diminuída e peso molhado em relação aos controlos. Mecanicamente, em termos de composição, e estruturalmente, os valores de amostras frescas e de controlo não eram significativamente diferentes uma da outra. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figura 1
Figura 4. visualizat microCT contrastadaíon. microCT intensificação de contraste pode ser utilizado para visualizar o IVD em três dimensões durante o período de cultura. IVDs caudais são mostrados aqui. O diferencial de ligação de ioversol para o AF (atenuação inferior) e NP (maior atenuação) permite distinguir o AF do NP. Por outro lado, PMA se liga preferencialmente aos resíduos de colagénio em AF (maior atenuação), as placas terminais, e o notocórdio. As imagens foram visualizadas utilizando a cor de tal modo que o branco representa a atenuação elevada, amarela representa atenuação meio, e vermelho representa baixa atenuação. (A - E) vista sagital da IVD nos dias 0, 2, 5, e 7 com contraste ioversol, e com contraste PMA. (F - J) vistas transversais da IVD nos dias 0, 2, 5 e 6 com contraste ioversol, e com contraste PMA. IVDs caudais são mostrados aqui. Por favor clique aqui para ver a laversão rger desta figura.

figura 1
Figura 5. modelação de elementos finitos (FEM) da estrutura IVD. análise FEM é uma ferramenta matemática poderosa que permite o cálculo da resposta material local para condições de contorno maiores. Por exemplo, (A) a NP pode ser processado separadamente a partir de (B) o AF, e cada compartimento possa ser atribuído propriedades constitutivas exclusivos. (C) Uma estrutura combinada IVD com ambos o AF e NP é mostrado em 3D. Quando as cargas axiais são aplicados para o disco na placa terminal superior com a placa terminal inferior é um bordo fixo, que pode determinar as concentrações locais de tensões e deformações. pontos amarelos e setas pretas representam uma carga nodal sendo aplicada. Por favor clique aqui para ver umaversão maior desta figura.

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Discussion

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Este protocolo descreve uma cultura de órgão do FSU murino com ênfase sobre o controlo das alterações biológicas no IVD. A manutenção bem-sucedida dessas culturas requer técnicas estéreis cuidadosos. Em particular, a dissecção passos 2,1-2,6 e a cultura passos 3,1-3,6 requerem um cuidado especial para garantir condições estéreis são mantidas, e estes passos deverá ser realizada preferencialmente numa sala de procedimentos isolado com um fluxo de ar HEPA para minimizar contaminantes. Uma vez que o processo de dissecção provoca trauma para os tecidos, o período de pré-condicionamento 24 h em 3.5 é necessário para todos os grupos de tratamento, incluindo os controlos. Os ensaios de viabilidade pode ser utilizado para assegurar amostras estão vivas e não contaminada, e também servem como uma confirmação de que a homeostase celular seja mantida. As leituras de luminesccia de NF-kB também pode ser utilizado para monitorar longitudinalmente a resposta inflamatória do FSU cultivadas; um aumento no NF-kB expressaion durante a cultura poderia indicar a FSUs estão contaminados ou sob estresse de infecção 11, e, portanto, incluí-lo aqui como um passo possível solução de problemas. Finalmente, as comparações para os grupos frescas servir como um ponto de verificação adicional para as amostras de controlo cultivadas na histologia e desempenho mecânico. Esta técnica de cultura é passível de várias amostras por placa, e em nossa experiência, até 24 amostras em uma placa de 24 poços pode ser facilmente realizado. No entanto, a multiplexagem de amostras também propaga o risco de contaminação cruzada e, assim, é recomendado que as FSU ser cultivadas em placas separadas durante a resolução de problemas. Além disso, enquanto este protocolo proporciona instruções para um período de cultura de 21 dias, o mesmo método pode ser utilizado durante períodos de cultura que são mais longos ou mais curtos. FSUs foram cultivadas com sucesso por nosso laboratório por períodos de cultura que variam de 1 semana para 5 semanas.

euike todos os modelos, modelos de cultura de órgãos em murino têm limitações, particularmente na sua capacidade para capturar as condições de carga dos seres humanos. Existem também diferenças subtis na geometria entre o mureo e humanos IVDs 12, e seres humanos são bípedes com cargas axiais principalmente sobre a coluna vertebral, enquanto ratos e murganhos são quadrúpedes. No entanto, desde que a condição cultivado é relativamente descarregado na sua forma actual, o modo de carregamento é susceptível de não ter influenciado as IVDs. Outros sistemas, tais como modelos de cultura IVD bovino órgão 13, 14 podem ser mais adequados para interacções mecânicas e de carga. Trabalho futuro vai incorporar condições de carga para permitir a investigação das interacções entre mechanobiological factores mecânicos e ambientais. O poder desta abordagem reside na sua consistência, versatilidade e capacidade para imagens de alta resolução. Nossa abordagem aqui demonstra que é possível à cultura blombar oth e IVDs caudais, mas é importante notar que estes discos são anatomicamente diferentes entre envelhecimento e desenvolvimento 15. Como tal, nosso projeto experimental randomizes lombar e os níveis de caudal separadamente.

microCT com contraste permitem a alta resolução, imagens não destrutiva, tridimensional do IVD. Diferentes agentes de contraste pode ser utilizado para realçar diferentes aspectos de composição da IVD. Nós demonstramos aqui o uso de ioversol, um agente hidrofílico não-citotóxico contendo iodo de 10, e de ácido fosfomolíbdico (PMA), uma molécula de metais pesados que quelata para resíduos de colagénio aminoácidos. Utilizando estes agentes de contraste-, as características microestruturais da IVD podem ser destacadas e identificados. Ioversol diferencia a hidratação relativa dos tecidos IVD, proporcionando deste modo o contraste entre o núcleo pulposo rico em água e o anel fibroso menos hidratada.O PMA fornece diferenciação de composição de colagénio relativa nos tecidos e vai realçar as placas terminais, anel fibroso, e o notocórdio. Ioversol pode ser utilizado durante a cultura para determinar as alterações longitudinais na hidratação, enquanto PMA pode ser aplicado para o IVD no ponto terminal da cultura para monitorar as alterações de colagénio.

futuras aplicações desta tecnologia incluem a utilização de outras estirpes de ratinhos transgénicos e knockout para compreender diferentes aspectos da degeneração IVD em outras doenças. Além disso, é uma plataforma potencial para co-cultura com outros sistemas de órgãos e células, tais como gânglio da raiz dorsal para identificar interacções que podem contribuir para a degeneração IVD.

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Disclosures

Os autores deste manuscrito declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Universidade Musculoskeletal Research Center Washington (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), mechanobiology Formação Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, e NIH K01AR069116. Os autores gostariam de agradecer a Patrick Wong por suas contribuições na coleta de dados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc
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Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

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