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Bioengineering

Un doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

cultivo de órgano entero del disco intervertebral (DIV) conserva la matriz extracelular nativa, fenotipos de células, y las interacciones celulares-matriz. A continuación se describe un sistema de cultivo IVD utilizando lumbar del ratón y IVD caudales en sus unidades funcionales de la columna vertebral y varias aplicaciones que utilizan este sistema.

Abstract

disco (IVD) degeneración intervertebral es un contribuyente significativo al dolor de espalda baja. El IVD es una articulación fibrocartilaginous que sirve para transmitir y amortiguar las cargas en la columna vertebral. El IVD consiste en una pulposo rica en proteoglicanos núcleo (NP) y un anillo de fibrosis rico en colágeno (AF) insertado por placas extremas cartilaginosas. Junto con las vértebras adyacentes, la estructura de vértebras-IVD forma una unidad columna vertebral funcional (FSU). Estas microestructuras contienen tipos de células únicas, así como matrices extracelulares únicos. cultivo de órgano entero de la FSU conserva la matriz extracelular nativa, fenotipos de diferenciación celular, y las interacciones celulares-matriz. Por lo tanto, las técnicas de cultivo de órganos son particularmente útiles para la investigación de los complejos mecanismos biológicos de la IVD. A continuación, describimos un enfoque de alto rendimiento para el cultivo de toda UFA ratón lumbar que proporciona una plataforma ideal para el estudio de los mecanismos y las terapias de enfermedades para el IVD. Además, describimos saplicaciones everal que utilizan este método de cultivo de órganos para llevar a cabo estudios adicionales incluyendo imágenes microCT contraste mejorado y tridimensionales de alta resolución de elementos finitos modelado de la IVD.

Introduction

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El dolor lumbar (LBP) es el factor principal para la discapacidad global y la pérdida de productividad en el lugar de trabajo, y sólo los estadounidenses gastan más de 50 mil millones de dólares en el tratamiento LBP 1. Aunque prevalece, la etiología del dolor lumbar sigue siendo compleja y multifactorial. Sin embargo, el disco intervertebral (DIV) degeneración es uno de los factores de riesgo más importantes para la LBP 2.

El IVD está hecho de tres microestructuras: la fibrosis exterior del anillo (AF), el núcleo interior pulposo (NP), y dos placas terminales cartilaginosas ese sándwich toda la estructura proximal y distal 3. Con el envejecimiento y la degeneración, los componentes IVD cambian estructuralmente, de composición, y mecánicamente 4. Estos cambios incluyen la pérdida de proteoglicanos y la hidratación de la NP, disminución de la altura del disco, y se deterioró competencia mecánica 5. Estas alteraciones sona menudo acompañada de citoquinas que promueven una respuesta inflamatoria, así como los neutrófilos y de la raíz dorsal intrusión ganglio en el espacio articular culminando en una cascada de acontecimientos que conducen a síntomas de dolor lumbar 6.

El estudio de los mecanismos de degeneración IVD es un reto en los seres humanos, ya que a menudo no es posible aislar la causa de la degeneración antes de la aparición de dolor de espalda baja. Por lo tanto, un enfoque reduccionista de simplificar el sistema experimental hasta el órgano IVD permite mecanicista puesta a punto de las variables causales y examinar sus efectos aguas abajo 5. El sistema se reduce a solamente la población celular nativa y que rodea a la matriz extracelular, lo que permite la interpretación directa de los efectos de los estímulos externos sobre la degeneración IVD. Además, el coste más bajo y la escalabilidad de modelos murinos, así como el gran número de animales modificados genéticamente 7, permiten tque la detección rápida de los mecanismos dirigidos degenerativas IVD y terapias potenciales. A continuación, describimos un sistema de cultivo de órganos murino en el que IVD estabilidad celular y tisular se mantiene más de 21 días, con el foco específico dado a patrones homeostáticos, mecánicos, estructurales e inflamatorias las IVD. Usando este método, controlamos cambios funcionales los IVDs' en un modelo de lesión inducida por puñalada 8 para entender los mecanismos detrás de la degeneración del disco. Además, describimos varias aplicaciones de este método de cultivo de órganos para llevar a cabo estudios adicionales incluyendo imágenes microCT contraste mejorado y de alta resolución de modelado tridimensional de la IVD.

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Protocol

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Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Universidad de Washington en el Comité de Estudios en animales St. Louis.

1. Los animales

  1. Obtener dos cepas de ratones: 10-semanas de edad BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) y 10 semanas de factor nuclear animales reportero kappa-B-luciferasa de edad (NF-κβ-luc) criados en una BALB / c de fondo (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
  2. Antes de la disección, la eutanasia a los animales con CO 2 sobredosis a un caudal de 2,5-3 L / min durante 5 min seguido por un 2 minutos adicionales de tiempo de permanencia.
  3. Desinfectar la región exterior del animal por el baño en un baño de etanol al 70% durante 2 min antes de la disección.

2. Disección

  1. Haga un corte vertical longitudinal en la superficie dorsal del ratón utilizando pequeñas tijeras de disección para exponer la cavidad del cuerpo.
  2. Hacer dos cortes verticales longitudinales a ambos lados de la columna vertebral del animal a partir dela primera vértebra lumbar (L1) a la vértebra caudal (C8).
  3. El uso de un bisturí, pinzas finas y tijeras de disección finas, retirar cuidadosamente la columna vertebral de L1-C8 de la cavidad corporal del animal.
  4. Retire cuidadosamente el exceso de tejidos blandos que rodean la columna vertebral, garantizando al mismo tiempo para no raspar o dañar el IVD en el lado ventral.
  5. diseccionar la columna vertebral en vértebras-disco-vértebras espinales unidades funcionales (UFA) en la L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, y los discos C7 / C8.
  6. Enjuague el UFA en solución salina equilibrada de Hank suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina durante 2 min.
  7. Aleatoriamente asignar las UFA en tres grupos: uncultured y no tratada UFA (Fresh), culta pero sin tratar UFA (Control), y las UFA cultivadas y tratadas puñalada (puñalada).
  8. Snap congelar las muestras frescas FSU con nitrógeno líquido inmediatamente después de la disección y almacenar en un congelador de -20 °.

3. Condiciones de cultivo de órganos

  1. Preparar 500 ml de medio de cultivo estéril de 1: 1 de Dulbecco modificado medio de Eagle: Mezcla Nutriente F12 (DMEM: F12) complementado con suero de 20% de bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Usando 10 pipetas serológicas ml, de pipeta 2 ml de medio de cultivo en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos.
  3. Después de la disección y enjuague, coloque cada FSU en un pozo individual en la placa de 24 pocillos medios de comunicación-llenado.
  4. Se incuban las muestras en un incubador estéril que mantiene 37 ° C, 5% de CO2, 20% de O2 y> 90% de humedad.
  5. Después de un período de cultivo inicial de 24 h, herir mecánicamente las muestras de grupo puñalada a través de punción de la aguja del anillo fibroso utilizando una aguja de calibre 27 estéril como se muestra en la Figura 1A.
  6. Cambio de medio cada 48 h mediante la preparación de una nueva placa de cultivo de 24 pocillos medios llenas, y las muestras de transferencia de la placa de edad a las nuevas utilizando pinzas estériles. Aspirar los viejos medios de comunicación y dispose de la placa de cultivo de edad en un cubo de la basura de riesgo biológico.
  7. En el día final de la cultura, incubar todas las muestras en medios que contienen 0,75 mg / ml nitro cloruro de azul de tetrazolio durante 24 h.
  8. Después, congelar toda la UFA con nitrógeno líquido y almacenar en un congelador de -20 ° hasta que esté listo para la prueba mecánica o histología (Figura 1B).

4. Las mediciones longitudinales NF-kappa B

  1. Image la UFA de animales NF-κβ-luciferasa a 1, 5, 13, y 19 días para evaluar la expresión de NF-KB.
  2. Añadir 10 l de solución de luciferina 1 mg / ml a cada pocillo y se incuba en un incubador estéril a 37 ° C durante 10 min.
  3. Image las muestras para la bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen con un tiempo de exposición de 1 min y el ajuste de bin de 2.
  4. Al mismo tiempo, utilizar la máquina para tomar una fotografía y la cubrirás con la imagen de bioluminiscencia para determinar la localización anatómica de la luminiscencia en el IVD.
  1. Determinar el comportamiento mecánico de los IVDs mediante el uso de la compresión dinámica desplazamiento controlado 9.
  2. Utilizando un microscopio de disección, bisturí, y pinzas, retirar los cuerpos vertebrales óseos de la FSU de cada muestra mientras se mantiene intacto y unido a la IVD las placas terminales cartilaginosas.
  3. Una los IVDs aisladas para una placa de aluminio de 1 cm x 1 cm x 0,2 cm utilizando pegamento de cianoacrilato.
  4. Medir la altura del disco y la anchura tomando un promedio de tres mediciones en el eje longitudinal de cada disco usando un micrómetro láser. Calcular la relación altura del disco dividiendo la altura media de disco por la anchura máxima del disco.
  5. Utilice la altura del disco medido para calcular los valores de tensión de entrada utilizados en la prueba mecánica. Tenga en cuenta que la altura media de disco fue de aproximadamente 690 micras ± 39! M.
  6. Colocar las muestras en una solución salina tamponada con fosfato de baño bajo la compressien la máquina y precargar el disco a 0,02 N.
  7. En función del ciclo de comprimir el disco usando una forma de onda sinusoidal a 1 Hz durante 20 ciclos en el nivel de deformación 1% y el nivel de tensión 5% durante 3 ensayos cada y registrar los valores de carga y el desplazamiento del IVD. Espere 10 min de tiempo de descanso entre los ensayos para el disco para relajarse y para evitar lesiones.
  8. Calcular la rigidez media de la fase de carga del último ciclo, y calcular la tangente de pérdida del ángulo de fase entre los datos de carga y desplazamiento.

6. proteoglicanos y colágeno Cuantificación

  1. Después de los ensayos mecánicos, medir el peso húmedo disco colocando el IVD aislado en un tubo de centrífuga pre-tarado y midiendo el peso usando una balanza analítica.
  2. Digerir el IVDs aislados en 250! L solución de digestión de papaína (0,1 M de acetato de sodio, 0,01 M EDTA, 0,005 M de cisteína HCl, pH 6,4) durante la noche a 65 ° C usando un calentador de bloque.
  3. Centrifugar las muestras de 10 mina 2.000 xg y recoger el líquido sobrenadante.
  4. Mida el contenido de proteoglicano de la IVD utilizando el ensayo de dimetilmetileno azul (DMMB) con los estándares de sulfato de condroitina.
  5. Preparar la solución de DMMB (21 mg DMMB, 5 ml de etanol absoluto, 2 g de formiato de sodio en 1 L ddH 2 O).
  6. Pipetear 30 l de estándares y muestras, por triplicado, en una placa de 96 pocillos, junto con 250 l de solución de DMMB en cada pocillo.
  7. Leer la absorbancia de la placa a 525 nm utilizando un espectrofotómetro.
  8. Mida el contenido de colágeno utilizando un kit de ensayo de hidroxiprolina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Histología

  1. Fijar un subconjunto de las muestras en paraformaldehído al 4% durante 24 h, de-calcificar en ácido fórmico al 5% durante 48 h, deshidratar con etanol, e incrustar en parafina.
  2. Usando un microtomo, sección de las muestras sagitalmente en 10 m de espesor y aplicar secciones a portaobjetos de vidrio. Tinción de las secciones utilizando safranina-O / Fast Green y DAPI.
  3. El uso de un microscopio de luz, la imagen se desliza un aumento de 10x.

8. realzada con contraste microtomografía de Positrones (microCT)

  1. Analiza un subconjunto de muestras en los puntos temporales 0, 2, 5, y 7 días utilizando longitudinal ioversol contraste de realce 10, y la terminal de ácido fosfomolíbdico (PMA) de contraste para la mejora en el punto de tiempo de 7 días.
  2. 4 h antes de la microCT tiempo de exploración, añadir 300 l de 350 mg / ml de solución de yodo ioversol al medio de cultivo para una concentración final de la solución que contiene yodo de aproximadamente 50 mg / ml ioversol y se incuban en un incubador estéril a 37 ° C durante 4 marido.
  3. Después de la incubación, envuelva la muestra en una gasa estéril y colocarlo en un tubo de microcentrífuga de 1 mL.
  4. Colocar las muestras en el sistema microCT y escanear a 45 keVp, 177 μA, 10.5 tamaño m voxel, y 300 ms integración.
  5. Los datos de exportación de la microCT como archivos DICOM y visualizar el uso de software (
  6. En el punto de tiempo de 7 días, fijar muestras usando una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h, seguido de solución de PMA 5% durante 3 días, y escanear utilizando la misma configuración que los utilizados en el paso 8.4.

9. Tridimensional Modelado de Elementos Finitos

  1. Segmento de los archivos DICOM de los IVD utilizando el software con el manual de umbral (por ejemplo, OsiriX).
  2. Convertir los volúmenes NP y AF de la IVD en basada en voxel mallas de elementos finitos utilizando MeshLab.
  3. Combinar las microestructuras de la NP y AF para formar un IVD completa y aplicar condiciones límite determinado experimentalmente en el software de elementos finitos.

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Representative Results

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Las figuras 2-3 muestran los resultados representativos de la distribución de proteoglicanos, la expresión de NF-KB, la rigidez, la viscosidad, la altura del disco, y el peso húmedo para IVDs de ratón en cultivo. Si se cultivan adecuadamente, los parámetros IVD del grupo de control no debe ser significativamente diferente del grupo fresco. Si el cultivo está infectado o comprometido de otro modo, el grupo de control será diferente del grupo fresco, especialmente en la expresión de NF-KB y la distribución de proteoglicanos (resultados no mostrados). Las figuras 4-5 muestran aplicaciones de cultivo de órganos para el uso de microCT contraste mejorado para obtener un modelo tridimensional de la IVD; Además, el modelado de elementos finitos se puede aplicar a estas estructuras para determinar las distribuciones de esfuerzos y deformación del tejido debido al comportamiento mecánico global.

Figura 1
Figura 1. Experimentalvisión de conjunto. (A) del disco intervertebral funcionales unidades espinales (UFA) fueron disecados de la columna lumbar y segmentos de caudal; la UFA contenía dos vértebras intactas, las placas terminales cartilaginosas, y el disco intervertebral. (B) después de la disección, las muestras se dividieron en grupos de tratamiento y se cultivaron in vitro durante 21 días. Posteriormente, se utilizó un subconjunto de muestras para ensayos mecánicos y los ensayos bioquímicos, mientras que se utilizó otro subconjunto de muestras para análisis histológico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 2. Histología y la expresión de NF-KB. (A) Después de 21 días en cultivo, safranina O tinción (rojo) muestra que el contenido de proteoglicanos se mantienetanto en el AF y NP en las muestras de control. (B) Las muestras Stab (lugar de la punción indicada por la flecha) mostraron una disminución de contenido de proteoglicanos tanto en el AF y NP. (C) azul de tetrazolio tinción (azul) muestra co-localización. (D) tinción con DAPI muestra que las células son metabólicamente activas y viable después de 21 días en cultivo de órganos. Expresión (E) NF-KB, tanto en las muestras de control y apuñalar también indican que el IVD es viable y sensible a su entorno. Las muestras Stab tienen una mayor expresión de NF-KB en el 1, 5, 13, y los puntos de tiempo de 19 días. IVD lumbares se muestran aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 3. Mecánica y composición. ( B) Ensayos mecánicos mostró que en los niveles de deformación 1% y 5%, los valores de rigidez tangente de la muestra y de pérdida de Stab son más bajos con respecto a las muestras de control. (C - D) Ensayos bioquímicos mostraron que su composición, las muestras Stab tenían proteoglicano inferiores y el contenido de colágeno (normalizado para mojar peso) con respecto a muestras de control. (E - F) Estructuralmente, las muestras Stab tenía una disminución de la relación de la altura del disco y el peso húmedo respecto a los controles. Mecánicamente, su composición, y estructuralmente, los valores de muestras frescas y de control no fueron significativamente diferentes entre sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 4. visualizat microCT con contrasteion. microCT con contraste puede ser usado para visualizar el IVD en tres dimensiones durante el periodo de cultivo. IVD caudal se muestran aquí. La unión de ioversol a la AF (menor atenuación) y NP (atenuación más alta) diferencial permite distinguir la AF de la NP. A la inversa, PMA se une preferentemente a los residuos de colágeno en la AF (atenuación más alta), las placas terminales, y la notocorda. Las imágenes se visualizaron usando el color de tal manera que el blanco representa una alta atenuación, amarillo representa la atenuación medio, y el rojo representa baja atenuación. (A - E) vistas sagital de la IVD en los días 0, 2, 5, y 7 con ioversol contraste y con contraste PMA. (F - J) vistas transversales del IVD en los días 0, 2, 5, y 6 con ioversol contraste y con contraste PMA. IVD caudal se muestran aquí. Haga clic aquí para ver a larger versión de esta figura.

Figura 1
Figura 5. modelización de elementos finitos (FEM) de la estructura de IVD. análisis FEM es una poderosa herramienta matemática que permite el cálculo de la respuesta material local a condiciones de contorno más grandes. Por ejemplo, (A) la NP puede hacerse por separado a partir de (B) el AF, y cada compartimento se podría asignar propiedades constitutivas únicas. (C) Un combinado estructura IVD tanto con la AF y NP se muestra en 3D. Cuando las cargas axiales se aplican al disco en la placa de extremo superior con la placa de extremo inferior es un borde fijo, podemos determinar las concentraciones locales de tensiones y deformaciones. Los puntos amarillos y flechas negras representan está aplicando una carga nodal. Haga clic aquí para ver unaversión más grande de esta figura.

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Discussion

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Este protocolo describe un cultivo de órganos de la murino FSU con énfasis en el seguimiento de los cambios biológicos en el IVD. El mantenimiento con éxito de estos cultivos requiere técnicas estériles cuidadosas. En particular, la disección de los pasos 2.1 a 2.6 y la cultura los pasos 3.1 a 3.6 requieren un cuidado especial para asegurar que se mantengan las condiciones estériles, y estos pasos se debe realizar preferiblemente en una sala de procedimiento aislado con un flujo de aire HEPA para reducir al mínimo los contaminantes. Debido a que el proceso de disección causa trauma a los tejidos, se requiere que el periodo de preacondicionamiento 24-h en 3,5 para todos los grupos de tratamiento, incluyendo los controles. Los ensayos de viabilidad se pueden utilizar para asegurar muestras están vivos y no contaminada, y también sirven como una confirmación de que la homeostasis celular se mantiene. Las lecturas de luminiscencia NF-? B también se pueden utilizar para longitudinalmente controlar la respuesta inflamatoria de la cultivaron las UFA; un aumento en NF-KB expresoion durante el cultivo podría indicar la UFA están contaminados o de otro modo bajo el estrés de la infección 11, y por lo tanto que la incluimos aquí como un posible paso de solución de problemas. Finalmente, las comparaciones con los grupos frescas sirven como un punto de control adicional para las muestras cultivadas de control en la histología y el rendimiento mecánico. Esta técnica de cultivo es susceptible de múltiples muestras por placa, y en nuestra experiencia, hasta 24 muestras en una placa de 24 pocillos se puede realizar fácilmente. Sin embargo, la multiplexación de muestras también se propaga el riesgo de contaminación cruzada y, por tanto, se recomienda que las UFA ser cultivadas en placas separadas durante la resolución de problemas. Además, mientras que este protocolo proporciona instrucciones para un periodo de cultivo de 21 días, el mismo método puede ser utilizado para períodos de cultivo que son más largos o más cortos. UFA se han cultivado con éxito por nuestro laboratorio para períodos de cultivo que van de 1 semana a 5 semanas.

Like todos los modelos, los modelos de cultivo de órganos en murino tienen limitaciones, sobre todo en su capacidad para capturar las condiciones de carga de los seres humanos. También existen diferencias sutiles en la geometría entre el murino y IVDs humanos 12, y los seres humanos son bípedo con cargas principalmente axiales en la columna vertebral mientras que las ratas y los ratones son cuadrúpedos. Sin embargo, puesto que la condición cultivada se relativamente descargada en su forma actual, es probable que el modo de carga a no haber influido en los DIV. Otros sistemas, tales como modelos de cultivo de órganos IVD bovina 13, 14 pueden ser más adecuados para las interacciones mecánicas y de carga. El trabajo futuro se incorporará condiciones de carga para permitir la investigación de las interacciones entre los factores mecanobiológicos mecánicas y ambientales. El poder de este enfoque radica en su consistencia, versatilidad y capacidad para formación de imágenes de alta resolución. Nuestro enfoque aquí demuestra que es posible cultivar blumbar y OTH IVD caudal, pero es importante tener en cuenta que estos discos son anatómicamente diferentes a través de envejecimiento y el desarrollo 15. Como tal, nuestro diseño experimental aleatoriamente la zona lumbar y los niveles de caudal por separado.

microCT con contraste permite la alta resolución, no destructiva de formación de imágenes, en tres dimensiones de la IVD. Diferentes agentes de contraste pueden utilizarse para destacar diferentes aspectos de composición de la IVD. Demostramos aquí el uso de ioversol, un agente hidrófilo no citotóxico que contiene yodo-10, y ácido fosfomolíbdico (PMA), una molécula de metales pesados que quela a los residuos de aminoácidos de colágeno. El uso de estas contraste-agentes, las características microestructurales en el IVD se pueden destacar e identificados. Ioversol diferencia la hidratación relativa de los tejidos IVD, proporcionando de ese modo contraste entre el núcleo pulposo rica en agua y el anillo fibroso menos hidratado.El PMA proporciona diferenciación de composición de colágeno relativa en los tejidos y destacará las placas finales, anillo fibroso, y la notocorda. Ioversol se puede utilizar durante el cultivo para determinar los cambios longitudinales en la hidratación, mientras que PMA puede ser aplicado a la IVD en el punto terminal de la cultura para monitorear los cambios de colágeno.

Las futuras aplicaciones de esta tecnología incluyen la utilización de otras cepas de ratones transgénicos y knockout para comprender los diferentes aspectos de IVD degeneración en otras enfermedades. Además, es una plataforma potencial para co-cultivo con otros sistemas de órganos y células, tales como ganglios de la raíz dorsal para identificar las interacciones que pueden contribuir a IVD degeneración.

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Disclosures

Los autores de este manuscrito declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Washington Centro de Investigación musculoesqueléticos (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mecanobiología Formación Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, y los NIH K01AR069116. Los autores desean agradecer a Patrick Wong por sus contribuciones en la recolección de datos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

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References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
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Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

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