Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

En doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

Helt organ kultur av mellankotskivan (IVD) bevarar den nativa extracellulära matrisen, cellfenotyper, och cellulär-matrisinteraktioner. Här beskriver vi ett IVD kultur system med musen ländryggen och stjärt IVDs i deras funktionella ryggradsenheter och flera program som använder detta system.

Abstract

Mellankotskiva (IVD) degeneration är en signifikant bidragsgivare till ländryggssmärta. IVD är en fibrocartilaginous gemensamma som tjänar till att sända och dämpa laster i ryggraden. IVD består av en proteoglykan-rika nucleus pulposus (NP) och ett kollagenrikt annulus fibrosis (AF) infogad broskgavelplåtarna. Tillsammans med de intilliggande ryggkotorna, bildar ryggkotorna-IVD-struktur en funktionell ryggradsenhet (FSU). Dessa mikro innehåller unika celltyper samt unika extracellulära matriser. Helt organ kultur av FSU bevarar den nativa extracellulära matrisen, celldifferentierings fenotyper, och cellulär-matrisinteraktioner. Sålunda, organkulturtekniker är särskilt användbara för att undersöka de komplexa biologiska mekanismerna i IVD. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för odling av hela ländryggen musen FSU som ger en idealisk plattform för att studera mekanismer och terapier sjukdoms för IVD. Dessutom beskriver vi several applikationer som utnyttjar denna organkultur metod att utföra ytterligare studier inkluderande kontrastförstärkt microCT avbildning och tredimensionella hög upplösning finita element modellering av IVD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ländryggssmärta (LBP) är den viktigaste faktorn för global funktionshinder och förlorad produktivitet på arbetsplatsen, och amerikaner ensam tillbringar mer än 50 miljarder dollar på LBP behandling 1. Även förhärskande, etiologi LBP förblir komplex och multifaktoriell. Dock är intervertebral skiva (IVD) degeneration bland de viktigaste riskfaktorerna för LBP 2.

IVD är gjord av tre mikrostrukturer: den yttre annulus fibrosis (AF), varvid den inre kärnan pulposus (NP), och två broskartade ändskivorna som omsluter hela strukturen proximalt och distalt 3. Med åldrande och degeneration, de IVD komponenterna förändras strukturellt, sammansättningsmässigt, och mekaniskt 4. Dessa förändringar innefattar förlusten av proteoglykaner och hydratisering i NP, minskade skivans höjd, och försämrade mekaniska kompetens 5. Dessa förändringar ärofta tillsammans med cytokiner som främjar ett inflammatoriskt svar, liksom neutrofila och dorsala ganglion intrång i det gemensamma utrymmet som kulminerade i en kaskad av händelser som leder till LBP symptom 6.

Studera mekanismerna för IVD degeneration är en utmaning för människor eftersom det ofta inte är möjligt att isolera orsaken till degeneration innan förekomsten av ländryggssmärta. Således ett reduktionistiskt tillvägagångssätt förenkla experimentella systemet ner till IVD organ tillåter mekanistiska finjustering av orsaksvariabler och undersöka deras nedströms effekter 5. Systemet reduceras till endast den nativa cellpopulationen och omgivande extracellulära matrisen, vilket således möjliggör direkt tolkning av effekterna av yttre stimuli på IVD degeneration. Dessutom den lägre kostnaden och skalbarhet av murina modeller, liksom det stora antalet genetiskt modifierade djur 7, medger than snabb riktad screening av IVD degenerativa mekanismer och potentiella behandlingar. Här beskriver vi en murin organkultursystem i vilket IVD cellulära och vävnadsstabilitet bibehålls över 21 dagar, med särskild fokusering på IVDs' homeostatiska, mekaniska, strukturella, och inflammatoriska mönster. Med denna metod, vi övervaka IVDs funktionella förändringar i ett hugg-inducerad skada modell 8 för att förstå mekanismerna bakom diskdegeneration. Dessutom beskriver vi flera tillämpningar av denna organkultur metod att genomföra ytterligare studier inklusive kontrastförstärkt microCT avbildning och tredimensionella hög upplösning modellering av IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurförsök utfördes i enlighet med Washington University i St. Louis Animal Studies kommittén.

1. Djur

  1. Erhålla två stammar av möss: 10 veckor gamla BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) och 10 veckor gamla nukleär faktor kappa-B-luciferas reporter djur (NF-κβ-luc) föds upp på en BALB / c-bakgrund (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
  2. Före dissektion, euthanize djur med CO 2 överdos vid en flödeshastighet av 2,5-3 l / min under 5 min följt av ytterligare 2 min av uppehållstid.
  3. Desinficera utanför regionen av djuret genom att bada den i en 70% etanolbad under 2 min före dissektion.

2. Dissektion

  1. Göra ett längsgående vertikalt snitt på den dorsala ytan av musen med hjälp av små dissektion sax för att exponera kroppskaviteten.
  2. Göra två longitudinella vertikala snitt på vardera sidan om djurets ryggrad utgående frånden första ländkotorna (L1) till svanskotan (C8).
  3. Med hjälp av en skalpell, fin pincett, och fina dissektion sax, försiktigt bort ryggraden från L1-C8 från djurets kroppshålan.
  4. Försiktigt avlägsna överskott mjuka vävnader som omger ryggraden, och samtidigt säkerställa att inte skrapa eller skada IVD på den ventrala sidan.
  5. Ytterligare dissekera ryggraden in i kotor-skiva-kotor funktionella ryggradsenheter (FSU) vid L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 och C7 / C8-skivor.
  6. Skölj FSU i Hanks balanserade saltlösning kompletterad med 1% penicillin-streptomycin i 2 min.
  7. Slumpmässigt tilldela FSU i tre grupper: uncultured och obehandlad FSU (Färsk), odlades men obehandlad FSU (kontroll), och odlades och stab behandlades FSU (Stab).
  8. Snäpp frysa Färsk FSU prover med flytande kväve omedelbart efter dissektion och förvara i en -20 ° C frys.

3. organkultur Villkor

  1. Förbereda 500 ml sterilt odlingsmedium av en: 1 Dulbeccos modifierade Eagles medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12) med tillsats av 20% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin.
  2. Med användning av 10 ml serologiska pipetter, pipett 2 ml av odlingsmedium i varje brunn av en 24-brunnars odlingsplatta.
  3. Efter dissektion och skölj, placera varje FSU till en individuell brunn i media fyllda 24-brunnsplatta.
  4. Inkubera proverna i en steril inkubator som upprätthåller 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 och> 90% fuktighet.
  5. Efter en initial odling under 24 h, mekaniskt skada Stab grupp samplar via nålpunktering av annulus fibrosus med en steril 27-gauge nål som visas i Figur 1A.
  6. Ändra media var 48 h genom att förbereda en ny mediafylld 24-brunnars odlingsplatta och överföringsprov från den gamla plåten till de nya med hjälp av sterila pincett. Aspirera gamla medier och Dispose av den gamla kulturen plattan i ett biologiskt soptunna.
  7. På den sista dagen av odlingen, inkubera alla prover i media som innehåller 0,75 mg / ml nitroblå tetrazoliumklorid för 24 timmar.
  8. Efteråt, frysa alla FSU med flytande kväve och förvara i en -20 ° C frys tills de var färdiga för mekanisk provning eller histologi (Figur 1B).

4. Längsgående Mätningar NF-KB

  1. Bild av FSU från NF-κβ-luciferas djur vid 1, 5, 13 och 19 dagar för att utvärdera NF-kB uttryck.
  2. Tillsätt 10 mikroliter av en mg / ml luciferin-lösning till varje brunn och inkubera i en steril inkubator vid 37 ° C under 10 min.
  3. Image proverna för bioluminiscens med användning av avbildningssystemet med en 1 min exponeringstid och bin inställning av 2.
  4. Samtidigt använda maskinen för att ta ett fotografi och överlagra den med mareld bilden för att bestämma den anatomiska placeringen av luminiscens i IVD.
  1. Bestämma det mekaniska uppträdandet hos de IVDs genom användning förskjutningsstyrda dynamisk komprimering 9.
  2. Med användning av ett dissektionsmikroskop, skalpell och pincett, avlägsna de beniga kotkropparna hos FSU från varje prov och samtidigt hålla de broskartade ändskivorna intakt och fäst till IVD.
  3. Fästa de isolerade IVDs till en 1 cm x 1 cm x 0,2 cm aluminiumplåt med hjälp av cyanoakrylatlim.
  4. Mäta skivans höjd och bredd genom att ta ett genomsnitt av tre mätningar på den längsgående axeln hos varje skiva med hjälp av en lasermikrometer. Beräkna skivans höjd förhållandet genom att dividera den genomsnittliga skivhöjden med den maximala bredden skivan.
  5. Använda den uppmätta skivans höjd för att beräkna ingångsbelastningsvärden som används i mekanisk provning. Observera att den genomsnittliga skivans höjd var ca 690 pm ± 39 pm.
  6. Placera proverna i en fosfatbuffrad saltlösning bad under compressipå maskinen och förbelasta skivan till 0,02 N.
  7. Cykliskt komprimera skivan med användning av en sinusformad vågform vid ett Hz under 20 cykler vid stamnivå den 1% och 5% stamnivå för 3 försök vardera och registrera de belastnings- och förskjutningsvärdena för IVD. Tillåta 10 min av vilande tid mellan försöken för skivan att slappna av och för att förhindra skador.
  8. Beräkna den genomsnittliga styvheten från laddningsfasen i den sista cykeln, och beräkna förlusttangenten från fasvinkeln mellan belastnings- och förskjutningsdata.

6. Proteoglykan och Collagen Kvantifiering

  1. Efter mekanisk provning, mäta skivan våtvikt genom att placera den isolerade IVD i en för-tarerad centrifugrör och mäta vikten med användning av en analytisk våg.
  2. Smälta de isolerade IVDs i 250 mikroliter papaindigerering lösning (0,1 M natriumacetat, 0,01 M EDTA, 0,005 M cystein HCl, pH 6,4) över natten vid 65 ° C med användning av en blockvärmare.
  3. Centrifugera prover för 10 minvid 2000 X g och samla den överstående vätskan.
  4. Mäta proteoglykaninnehåll av IVD med hjälp av dimetylmetylen blå (DMMB) -analys med kondroitinsulfat standarder.
  5. Förbereda DMMB-lösning (21 mg DMMB, 5 ml absolut etanol, 2 g natriumformiat i en L DDH 2 O).
  6. Pipettera 30 | il av standarder och prover i tre exemplar i en 96-brunnsplatta, tillsammans med 250 mikroliter av DMMB lösning i varje brunn.
  7. Läs av absorbansen av plattan vid 525 nm med användning av en spektrofotometer.
  8. Mäta kollagen innehåll med en hydroxiprolin analyskit enligt tillverkarens instruktioner.

7. Histologi

  1. Fastställa en underuppsättning av prover i 4% paraformaldehyd under 24 timmar, de-förkalkas i 5% myrsyra under 48 h, dehydrera med etanol, och bädda in i paraffin.
  2. Med användning av en mikrotom, avsnitt proverna sagittalt vid 10 pm tjocklek och applicera snitten till objektglasen. Färga sektioner med hjälp Safranin-O / Snabb Green och DAPI.
  3. Med hjälp av ett ljusmikroskop, bild glider vid 10X förstoring.

8. Kontrastförstärkt microComputed Tomography (microCT)

  1. Skanna en delmängd av proverna vid de 0, 2, 5, och 7-dagars tidpunkter med användning av längsgående Ioversol kontrastförbättring 10, och terminal fosfomolybdensyra (PMA) kontrastförbättring vid 7 dagars tidpunkt.
  2. 4 h före microCT avsökningstid, tillsätt 300 | il av 350 mg / ml jod Ioversol lösning till odlingsmediet för en slutlig koncentration av ca 50 mg / ml jodinnehållande Ioversol lösning och inkubera i en steril inkubator vid 37 ° C under 4 h.
  3. Efter inkubation, linda provet i steril gasbinda och lägg i en 1 ml mikrocentrifugrör.
  4. Placera proverna i microCT organen och skanna med 45 keVp, 177 uA, 10,5 um voxelstorlek, och 300 ms integrering.
  5. Exportera data från microCT som DICOM-filer och visualisera med hjälp av programvara (
  6. Vid 7-dagars tidpunkt fixa prov med användning av en 4% paraformaldehydlösning under 24 h, följt av 5% PMA-lösning under 3 dagar, och skanna med samma inställningar som de som användes i steg 8,4.

9. Tredimensionell Finite Element Modeling

  1. Segment av DICOM-filer i IVDs med hjälp av programvara med manuell tröskel (t.ex. OsiriX).
  2. Omvandla NP och AF volymer av IVD till voxel-baserade finita element maskor med hjälp Meshlab.
  3. Kombinera mikro av NP och AF för att bilda en komplett IVD och tillämpa experimentellt bestämda randvillkor i finita elementprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figurerna 2-3 visar representativa resultat från proteoglykan distribution, NF-KB-expression, styvhet, viskositet, skivans höjd, och våt vikt för odlade mus- IVDs. Om odlade på rätt sätt, bör IVD parametrar i kontrollgruppen inte vara signifikant skild från Fresh gruppen. Om odlingen är infekterad eller på annat sätt äventyras, kommer kontrollgruppen skilja sig från den färska grupp, särskilt i NF-KB-expression och proteoglykan fördelning (resultat ej visade). Figurerna 4-5 visar tillämpningar av organkultur med att använda kontrastförstärkt microCT att erhålla en tredimensionell modell av IVD; vidare, kan finita elementmodellering tillämpas på dessa strukturer för att bestämma vävnads stress och påfrestningar fördelningar på grund av att den globala mekaniska beteende.

Figur 1
Figur 1. ExperimentellÖversikt. (A) mellankotskiva funktionella ryggradsenheter (FSU) dissekerades från den lumbala och kaudala segment; den FSU innehöll två intakta kotorna, de broskartade ändskivorna och mellankotskivan. (B) Efter dissektion prover delas upp i behandlingsgrupper och odlas in vitro under 21 dagar. Efteråt tillsattes en delmängd av sampel som används för mekanisk provning och biokemiska analyser, medan en annan underuppsättning av prover användes för histologisk analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 2. Histologi och NF-KB-expression. (A) Efter 21 dagar i odling, Safranin O färgning (röd) visar att proteoglykaninnehåll bibehållsi både AF och NP i kontrollprover. (B) De Stab prover (punktionsstället som anges med pil) visade minskad proteoglykaninnehåll i både AF och NP. (C) Tetrazolium blåfärgning (blå) visar samlokalisering. (D) DAPI-färgning visar att celler är metaboliskt aktiva och viabla efter 21 dagar i organodling. (E) NF-KB-expression i både kontrollen och Stab prover indikerar också att IVD är livskraftig och reagerar på dess miljö. De Stab prover har ökat NF-kB uttryck på 1, 5, 13 och 19 dagars tidpunkter. Ländryggen IVDs visas här. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 3. Mekanik och sammansättning. ( B) Mekanisk testning visade att vid de töjningsnivåer 1% och 5%, Stab prov styvhet och förlusttangenten värdena är lägre i förhållande till kontrollprover. (C - D) Biokemiska analyser visade att sammansättnings, Stab prover hade lägre proteoglykan och kollagenhalt (normaliserad till våt vikt) i förhållande till kontrollprover. (E - F) Strukturellt Stab proverna hade en minskad skiva höjdförhållande och våt vikt i förhållande till kontroller. Mekaniskt, kompositionsmässigt, och strukturellt, färska och kontrollprover värden skilde sig inte signifikant från varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 4. Kontrastförstärkt microCT visualizatJon. Kontrastförstärkt microCT kan användas för att visualisera IVD i tre dimensioner under odlingsperioden. Stjärt IVDs visas här. Den differentiella bindningen av Ioversol till AF (lägre dämpning) och NP (högre dämpning) gör att man kan skilja AF från NP. Omvänt, PMA binder företrädesvis till kollagenrester i AF (högre dämpning), ändplattorna och notokorden. Bilderna visualiserades med användning av färg så att vitt representerar hög dämpning, gul representerar medel dämpning, och rött representerar låg dämpning. (A - E) sagittala vyer av IVD dag 0, 2, 5, och 7 med Ioversol kontrast och med PMA kontrast. (F - J) Tvärgående vyer av IVD vid dagarna 0, 2, 5 och 6 med Ioversol kontrast och med PMA kontrast. Stjärt IVDs visas här. Klicka här för att se en larger version av denna siffra.

Figur 1
Figur 5. Finita elementmodellering (FEM) av IVD strukturen. FEM-analys är ett kraftfullt matematiskt verktyg som tillåter beräkning av lokala material svar på större randvillkor. Till exempel, (A) NP kan göras separat från (B) AF, och varje fack kunde tilldelas unika konstitutiva egenskaper. (C) En kombinerad IVD struktur med både AF och NP visas i 3D. När axiella belastningar appliceras på skivan på den övre ändplattan med den undre ändplattan är en fast kant, kan vi bestämma de lokala koncentrationer av spänningar och töjningar. Gula prickar och svarta pilar representerar en nodal last som appliceras. Klicka här för att se enstörre version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll beskriver ett organ kultur mus FSU med tonvikt på övervakning av biologiska förändringar i IVD. Den framgångsrika underhåll av dessa kulturer kräver noggranna sterila tekniker. I synnerhet, steg dissektion 2,1-2,6 och kulturen steg 3,1-3,6 kräver särskild omsorg för att säkerställa sterila förhållanden upprätthålls, och dessa steg bör utföras företrädesvis i en isolerad förfarande rum med ett HEPA luftflöde för att minimera föroreningar. Eftersom dissektion processen orsakar trauma på vävnaderna, krävs det 24-h förkonditionering period 3,5 för alla behandlingsgrupper inklusive kontroll. De viabilitetsanalyser kan användas för att säkerställa prover är vid liv och okontaminerad, och också fungera som en bekräftelse på att cellulär homeostas bibehålls. NF-KB-luminiscens avläsningar kan också användas för att i längdled övervaka den inflammatoriska responsen hos den odlade FSU; en ökning av NF-KB-uttryckjon under odling kunde indikera FSU är förorenade eller på annat sätt under stress från infektion 11, och vi inkluderar det alltså här som en möjlig felsökningssteg. Slutligen, jämförelser med de färska grupper tjänar som en ytterligare kontroll punkt för kontroll odlade proverna i histologi och mekanisk prestanda. Denna kultur teknik är mottaglig för flera prover per platta, och i vår erfarenhet, kan upp till 24 prover på en 24-brunnar lätt åstadkommas. Emellertid multiplexering av prover fortplantar också risken för korskontaminering och således, är det rekommenderat att FSU odlas på separata plattor under felsökning. Dessutom, medan detta protokoll innehåller instruktioner för en odlingsperiod på 21 dagar, samma metod kan användas för odlingsperioder som är längre eller kortare. FSU har framgångsrikt odlats av vårt labb för kultur perioder från en vecka till 5 veckor.

Like alla modeller, organkultur modeller i mus har begränsningar, särskilt i deras förmåga att fånga lastförhållanden människorna. Det finns också små skillnader i geometri mellan de murina och humana IVDs 12, och människor är tvåbent med primärt axiella belastningar på ryggraden medan råttor och möss är fyrfota. Eftersom den odlade tillstånd relativt lossas i sin nuvarande form, är laddningsläget sannolikt inte ha påverkat IVDs. Andra system såsom bovint IVD organodlingsmodeller 13, 14 kan vara bättre lämpade för mekaniska och lastnings interaktioner. Framtida arbete kommer att innehålla belastningsförhållanden för att möjliggöra undersökning av mechanobiological interaktioner mellan mekaniska och miljöfaktorer. Kraften med detta tillvägagångssätt ligger i dess konsistens, mångsidighet och kapacitet för hög upplösning avbildning. Vår inställning här visar att det är möjligt att odla Both ländryggen och stjärt IVDs, men det är viktigt att notera att dessa skivor är anatomiskt olika över åldrande och utveckling 15. Som sådan, vår experimentell design slumpmässig ländryggen och stjärt nivåer separat.

Kontrastförstärkt microCT tillåter hög upplösning, icke-förstörande, tredimensionell avbildning av IVD. Olika kontrastmedel kan användas för att belysa olika kompositions aspekter av IVD. Vi visar här användningen av Ioversol, en jod-innehållande icke-cytotoxiskt hydrofilt medel 10, och fosfomolybdensyra (PMA), en tung-metall-molekyl som kela till kollagen aminorester. Med hjälp av dessa kontrastagenter, kan mikro funktioner i IVD markeras och identifieras. Ioversol differentierar relativa hydratiseringen av IVD vävnader, varigenom kontrasten mellan den vattenrika nucleus pulposus och den mindre hydratiserade annulus fibrosus.PMA tillhandahåller differentiering av relativ koUagenkompositionen i vävnader och kommer att belysa gavelplåtarna, annulus fibrosus, och notochord. Ioversol kan användas under odling för att bestämma de längsgående förändringar i hydratisering, medan PMA kan appliceras på IVD vid slutpunkten för kulturen för att övervaka kollagenförändringar.

Framtida tillämpningar av denna teknik innefattar användning av andra stammar av transgena och knockout-möss för att förstå olika aspekter av IVD degenerering vid andra sjukdomar. Vidare är det en potentiell plattform för samarbete kultur med andra organsystem och celler som dorsalrotsganglier att identifiera interaktioner som kan bidra till IVD degeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna till detta manuskript förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056) Mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 och NIH K01AR069116. Författarna vill tacka Patrick Wong för sina insatser i datainsamling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter