Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

bir doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

intervertebral disk (IVD) Whole organ kültür doğal hücre-dışı matrisi, hücre fenotipleri ve hücresel-matriks ilişkilerini kontrol korur. Burada fare bel ve bunların fonksiyonel spinal birimlerinde kaudal IVD'ler ve bu sistemi kullanan birçok uygulamaları kullanarak bir IVD kültür sistemi açıklanmaktadır.

Abstract

İntervertebral disk (IVD) dejenerasyonu, bel ağrısı için önemli bir katkıda bulunmaktadır. IVD iletmek ve omurgasında yükleri azaltacak hizmet veren bir fibrokartilajinöz eklemdir. IVD proteoglikandan zengin nucleus (NP) ve kıkırdak uç plakaları arasında kalan bir kolajen zengin halka fibroz (AF) oluşur. Birlikte komşu vertebralar ile omurlar-IVD yapısı fonksiyonel omurga birimi (ESB) oluşturmaktadır. Bu mikro benzersiz hücre türleri yanı sıra özgün hücre dışı matrisler içerir. FSU Whole organ kültür doğal hücre-dışı matrisi, hücre farklılaşması fenotipleri ve hücresel-matriks ilişkilerini kontrol korur. Bu nedenle, organ kültürü teknikleri IVD karmaşık biyolojik mekanizmaları araştırmak için yararlıdır. Burada, İVG hastalık mekanizmalarını ve terapileri eğitimi için ideal bir platform sağlar bütün bel fare FSUs yetiştirmek için kullanılan bir yüksek verimli bir yaklaşım açıklar. Ayrıca, s tarifkontrastlı microCT görüntüleme ve IVD üç boyutlu yüksek çözünürlüklü sonlu elemanlar modelleme dahil başka çalışmalar yapmak için bu organ kültürü yöntemi kullanan everal uygulamalar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bel ağrısı (BA) işyerinde küresel sakatlık için önde gelen faktör ve kayıp verimlilik ve Amerikalılar yalnız LBP tedavisi 1 50 milyar doların üzerinde harcama. yaygın olmakla birlikte, bel ağrısı etiyolojisi kompleks ve çok kalır. Bununla birlikte, intervertebral disk (IVD) dejenerasyon LBP 2 için en önemli risk faktörleri arasında yer almaktadır.

IVD üç mikroyapıların meydana gelir: dış halka fibroz (AF), iç çekirdeği pulposus (NP) ve proksimal ve distal olarak 3 bütün yapı sandviç iki kıkırdak omurun. Yaşlanma ve dejenerasyon ile IVD bileşenleri kompozisyonel yapısal değişiklik ve mekanik 4. Bu değişiklikler, NP proteoglikanlar ve hidrasyon kaybı gibi, disk yüksekliği azalması ve mekanik yetkinlik 5 bozulmuştur. Bu değişiklikler şunlardırgenellikle LBP semptomları 6 yol edilen bir olay grubuyla sonuçlanan eklem yeri boşluğuna bir enflamatuvar yanıtı ve aynı zamanda nötrofil ve dorsal kök ganglion girmesini teşvik sitokinler ile birlikte.

bel ağrısı verilmeden önceki dejenerasyon nedenini ortadan kaldırmak için çoğu zaman mümkün değildir, çünkü IVD dejenerasyon mekanizmalarının incelenmesi insanlarda zordur. Bu nedenle, IVD organa aşağı deneysel sistem basitleştirilmesi indirgemeci yaklaşım nedensel değişkenlerin mekanik ince ayarlanmasına izin verir ve bunların bir aşağı akış etkisine 5 incelenmesi. Sistem böylece IVD dejenerasyonu dış uyaranların etkileri doğrudan yorumlanmasını sağlar, ancak doğal hücre nüfusu ve hücre-dışı matrisi çevreleyen, indirgenir. Ayrıca, daha az maliyet ve fare modellerinin ölçeklenebilirlik, aynı zamanda, genetik olarak tadil edilmiş hayvanlar 7 çok sayıda, t izinIVD dejeneratif mekanizmalarla ve potansiyel terapilerin o hızla hedefe yönelik tarama. Burada, IVD hücre ve doku stabilitesi IVD'ler, homeostatik mekanik, yapısal ve inflamatuar desen verilen belirli bir odak ile, 21 gün boyunca muhafaza edildiği bir murin organ kültürü sistemi tarif eder. Bu yöntemi kullanarak, disk dejenerasyonu altında yatan mekanizmaları anlamak için bir bıçak kaynaklı yaralanma modelinde 8 IVD'ler fonksiyonel değişiklikleri izler. Ayrıca, kontrastlı microCT görüntüleme ve IVD üç boyutlu yüksek çözünürlüklü modelleme dahil başka çalışmalar yapmak için bu organ kültürü yönteminin çeşitli uygulamaları açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan deneyleri Louis Hayvan Araştırmaları Komitesi Washington Üniversitesi ile uyumlu olarak gerçekleştirildi.

1. Hayvanlar

  1. (N = 6, BALB-E, BALB / cAnNTac) ve 10 haftalık nükleer faktör kappa-B-lusiferaz raportör hayvanları (NF-κβ-luc) bir yetiştirilen 10 haftalık BABL / c farelerinin iki soy elde edilir BALB / c arka plan (n = 6, BALB / c-Tg (Relà-luc) 31Xen).
  2. Diseksiyon önce, zaman yaşayan ek bir 2 dakika, ardından 5 dakika boyunca 2.5-3 L / dk'lık bir akış hızında CO2, aşırı dozda hayvanların euthanize.
  3. Diseksiyon önce 2 dakika süreyle% 70 etanol banyosu içinde banyo ile hayvanın dış bölge dezenfekte.

2. Diseksiyon

  1. Vücut boşluğuna maruz küçük diseksiyon makas kullanılarak fare dorsal yüzeyi üzerinde bir uzunlamasına dikey kesim yapın.
  2. başlayarak hayvanın omurganın her iki tarafında iki boyuna dikey kesimler yapınİlk omurga kaudal vertebra (L1) (C8).
  3. neşter, ince forseps ve ince diseksiyon makas kullanarak dikkatli bir şekilde hayvanın vücut boşluğundan L1-C8 omurgaya çıkarın.
  4. kazımak veya ventral tarafında IVD zarar değil sağlarken dikkatlice, omurga çevreleyen, yumuşak dokuları çıkarın.
  5. Bundan başka, L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 ve C7 / C8 disklerinde vertebra-disk omurlar fonksiyonel omurga birimi (FSUs) içine omurga incelemek.
  6. % 1 2 dakika boyunca penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Hank dengeli tuz çözeltisi içinde FSUs durulayın.
  7. kültürlenmemiş ve işlenmemiş FSUs (Taze), kültürlenmiş ama tedavi edilmemiş FSUs (Kontrol) ve kültüre edildiği ve levha tedavi FSUs (Stab): rasgele üç gruba FSUs atar.
  8. Ek bileşen hemen -20 ° C dondurucu içinde diseksiyon ve depo edilmesinden sonra sıvı azot ile taze ESB örnekleri dondurma.

3. Organ Kültür Koşulları

  1. steril kültür ortamı 500 mL Hazırlama 1: 1 Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı: Nutrient Mixture F12:% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş (DMEM F12).
  2. 24 kuyucuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 10 ml serolojik pipetler, pipet kültür ortamı 2 ml kullanılması.
  3. diseksiyon sonra ve durulama, ortam ile doldurulmuş, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bir birey haline her FSU yerleştirin.
  4. 37 ° C,% 5 CO2,% 20 O2 ve>% 90 nem muhafaza eden bir steril bir inkübatörde inkübe edin.
  5. 24 saatlik bir başlangıç kültür döneminden sonra, mekanik olarak, Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, steril bir 27 gauge iğne ile annulus fibrosus iğne delinmesi ile delinmeye grubu örnekleri zarar.
  6. Yeni kullanılarak steril cımbız eski plakadan yeni bir ortam ile doldurulmuş 24 oyuklu bir kültür plakası hazırlanarak Ortam 48 saatte bir değiştirme ve aktarım örnekleri. Eski medya ve dispos aspireBir biyolojik tehlike atık kutusuna eski kültür plakasının e.
  7. kültürün son gününde, 24 saat süre ile 0.75 mg / ml nitro mavi tetrazolyum klorür ihtiva eden ortam içinde tüm örnekleri inkübe edin.
  8. Daha sonra, dondurarak tüm FSUs mekanik test veya histoloji (Şekil 1B) için hazır olana kadar -20 ° C dondurucu içinde sıvı azot ve mağaza ile.

4. Uzunlamasına Ölçümler NF-KB

  1. Görüntü 1 de NF-κβ-lusiferaz hayvanlardan FSUs, 5, 13 ve 19 gün NF-KB ifadesini değerlendirmek için.
  2. 10 dakika boyunca 37 ° C'de steril inkübatörde her 1 mg / ml lusiferin çözeltisinin 10 uL de ekleyin ve inkübe edilir.
  3. Görüntü bir 1 dk maruziyet süresi ve 2 bin ayarıyla görüntüleme sistemi kullanılarak biyolüminesans için örnekler.
  4. Eşzamanlı olarak, bir fotoğrafını çekip IVD içinde lüminesans anatomik yerini belirlemek için biyolüminesans görüntüsü ile bindirmek için makineyi kullanın.
  1. Deplasman kontrollü dinamik sıkıştırma 9 kullanarak IVD'ler mekanik davranışını belirler.
  2. sağlam ve IVD'nin bağlı kıkırdak uç plaka tutarken bir diseksiyon mikroskobu, neşter, ve cımbız kullanarak, her bir numuneden, eski Sovyetler kemik omur gövdelerinin çıkarın.
  3. siyanoakrilat yapıştırıcı ile, bir 1 cm x 1 cm x 0,2 cm alüminyum levhaya izole IVD'ler takın.
  4. bir lazer mikrometre kullanılarak her diskin uzunlamasına ekseni üzerinde üç ölçümün ortalaması alınarak disk yüksekliğini ve genişliğini ölçün. maksimum disk genişliği ortalama disk yüksekliğine bölerek disk yükseklik oranını hesaplar.
  5. mekanik test kullanılan girdi gerilme değerlerini hesaplamak için ölçülen disk yüksekliğini kullanın. Ortalama diski yüksekliği yaklaşık 690 um ± 39 um olduğu not edin.
  6. compressi altında, bir fosfat tamponlu tuzlu su içinde numunelerMakinede 0.02 N'ye disk önceden yüklenmesi
  7. Siklik 3 denemeleri için 20 1% tür düzeyinde döngüleri ve% 5 suşu seviyesi için 1 Hz, her bir sinüs dalga formu kullanılarak disk sıkıştırmak ve IVD'nin Yük ve yer değiştirme değerlerini kaydedin. dinlenmek ve yaralanmaları önlemek için disk için çalışmalar arasındaki dinlenme zaman 10 dakika bekleyin.
  8. Son çevrimin yükleme fazı ortalama sertlik hesaplayın ve Yük ve yer değiştirme verileri arasındaki faz açısı kayıp tanjantı hesaplar.

6. Proteoglikan ve Kolajen Niceleme

  1. mekanik test sonra, bir ön-darası alınmış santrifüj tüpüne izole IVD yerleştirilmesi ve bir analitik terazi kullanılarak ağırlığının ölçülmesi disk ıslak ağırlık ölçer.
  2. 250 uL papain sindirim çözeltisi izole IVD'ler Digest (0,1 M sodyum asetat, 0.01 M EDTA, 0.005 M sistein HCI, pH 6.4) bir blok ısıtıcı kullanılarak bir gece boyunca 65 ° C'de karıştırıldı.
  3. 10 dakika süre ile santrifüj örnekleri2.000 x g'de yüzeydeki sıvı toplamak ve.
  4. kondroitin sülfat standartlarına dimetilmetilen mavisi (DMMB) analizi kullanılarak IVD proteoglikan içeriği ölçülür.
  5. DMMB çözeltisi (21 mg, DMMB, 5 ml mutlak etanol, 1 L GKD 2 O 2 g sodyum format) hazırlayın.
  6. Pipet her yuva içinde, DMMB çözeltisi 250 uL ile birlikte 96 oyuklu bir plaka içerisinde, üç kopya halinde 30 standartları uL ve örnekler.
  7. Bir spektrofotometre kullanılarak 525 nm'de plakanın emilmesini okuyun.
  8. Üretici talimatlarına uygun olarak bir hidroksiprolin tahlili kiti kullanılarak kolajen içeriği ölçün.

7. Histoloji

  1. , 24 saat süresince% 4 paraformaldehit içinde numunelerinin bir alt saptamak 48 saat,% 5 formik asit içinde de-kalsifiye, etanol ile kurutmak, ve parafin içine yerleştirin.
  2. sajital 10 um kalınlığında bölüm, numune bir mikrotom kullanılarak ve cam slaytlara bölümleri uygulanır. Safranin-O / Hızlı Gr kullanılarak bölümleri Lekeeen ve DAPI.
  3. Bir ışık mikroskobu kullanılarak, görüntü 10X büyütmede kayar.

8. Kontrastlı microComputed Tomografi (mikroBT)

  1. 7 günlük bir zaman noktasında boylamasına iyoversol kontrastlı 10 ve terminal fosfomolibdik asit (PMA) kontrast iyileştirme sistemi kullanılarak, 0, 2, 5 ve 7 günlük zaman noktalarında numuneler bir alt tarama.
  2. mikroBT tarama süresi öncesinde 4 saat, 4, 37 ° C'de steril bir inkübatörde 350 mg / yaklaşık 50 mg / mL iyot içeren iyoversol solüsyonunun, nihai konsantrasyonu için kültür ortamına ml iyodin iyoversol çözeltisi 300 uL ekleyebilir ve inkübe h.
  3. İnkübasyondan sonra, 1 mL mikrosantrifüj tüpü içinde, steril bir gazlı bez ve yerine örnek sarın.
  4. mikroBT sisteminde yer örnekler ve 45 keVp, 177 uA, 10.5 um voksel boyutu, 300 ms, entegrasyon tarama.
  5. İhracat DICOM dosyaları olarak mikroBT gelen veriler ve yazılımlar kullanılarak görselleştirmek (
  6. 7 günlük bir zaman noktasında, 3 gün süre ile% 5 PMA çözeltisi, ardından 24 saat boyunca bir% 4 paraformaldehid çözeltisi kullanılarak örnekleri saptamak ve adım 8.4 kullanılanlar ile aynı ayarları kullanarak tarama.

9. Üç Boyutlu Sonlu Eleman Model

  1. Segment manuel eşikleme (örneğin OsiriX) ile yazılımı kullanarak IVD'ler DICOM dosyaları.
  2. Meshlab kullanarak voksel tabanlı sonlu elemanlar kafes içine IVD NP ve AF hacimleri dönüştürün.
  3. Tam bir IVD oluşturacak ve sonlu elemanlar yazılımında deneysel olarak belirlenen sınır koşulları kullanılarak NP ve AF mikro yapılarını birleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekiller 2-3 kültürlenmiş fare IVD'ler için proteoglikan dağılımı, NF-KB ekspresyonu, sertlik, viskozite, disk yüksekliği ve yaş ağırlık temsili sonuçlar göstermektedir. Düzgün kültürlendirilmiş, Denetim grubunun IVD parametreleri Taze grubundan önemli ölçüde farklı olmamalıdır. Kültür tehlikeye aksi enfekte edilmiş veya ise, kontrol grubu, özellikle NF-KB ekspresyonu ve proteoglikan dağıtımında, taze grubundan farklı olacaktır (sonuçlar gösterilmemiştir). IVD üç boyutlu bir model elde etmek kontrastlı mikroBT kullanılarak organ kültürü 4-5 gösteri uygulamalarını gösterir; ayrıca, sonlu elemanlar modelleme küresel mekanik davranışına doku baskı ve gerilme dağılımlarını belirlemek için bu yapılara uygulanabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Deneyselgenel bakış. (A), intervertebral disk, fonksiyonel spinal birimleri (FSUs) bel ve kaudal segmentlerinden disekte edildi; FSUs iki tam vertebra, kıkırdak uç plakaları ve omur diski ihtiva etmiştir. Diseksiyon sonra (B) numuneleri, 21 gün boyunca in vitro olarak muamele grupları olarak bölünmüştür ve kültüre edildi. Numunelerin bir alt-kümesi, histolojik analiz için kullanılmıştır Sonrasında, numune bir alt kümesi, mekanik test ve biyokimyasal analizler için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 1
Şekil 2. Histoloji ve NF-KB ifadesi. Kültür içinde 21 gün sonra, (A), Safranin O lekeleme (kırmızı) proteoglikan içeriği muhafaza edilmesini göstermektedirKontrol örneklerinde AF ve NP hem de. (B), delinmeye numuneleri (okla gösterilen delik bölgesine) AF ve NP proteoglikan içeriği azalma gözlendi. (C) Tetrazolyum mavi boyama (mavi) ko-lokalizasyonunu göstermektedir. (D) DAPI boyama hücreleri metabolik olarak aktif ve organ kültürü içinde 21 gün sonra canlı olduklarını göstermektedir. Kontrol ve Stab örneklerinde hem de (E) NF-KB ifadesi de IVD yaşayabilir ve çevresine duyarlı olduğunu göstermektedir. Bıçak örnekler 1, 5, 13, NF-KB ekspresyonunda artış, ve 19 günlük zaman noktaları var. Bel IVD'ler burada gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 1
3. Mekanik ve kompozisyon Şekil. ( B) mekanik test% 1 ve% 5 suşu seviyelerinde, Bıçak örnek sertliği ve kayıp tanjantı değerleri kontrol numunelere kıyasla daha düşük bağıl olduğunu göstermiştir. (Cı - D) Biyokimyasal analizler kompozisyonel Bıçak örnekleri düşük proteoglikan ve kontrol numuneleriyle karşılaştırıldığında (ağırlık ıslak normalize) kolajen sahip olduğunu göstermiştir. (E - F) Yapısal olarak, Stab örnekleri Kontroller azalan bir disk yükseklik oranı ve yaş ağırlık olarak kaldı. Mekanik olarak, bileşim açısından ve yapısal olarak, taze ve kontrol örnekleri değerleri birbirinden önemli ölçüde farklı değildi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 1
Şekil 4. Kontrastlı mikroBT visualizatiyon. Kontrastlı mikroBT kültür süresi boyunca üç boyutlu olarak IVD görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Kaudal IVD'ler burada gösterilmektedir. AF iyoversol (alt zayıflama) ve NP (daha yüksek zayıflama) bağlanması farklı bir NP AF ayırmasına olanak sağlar. Bunun aksine, PMA tercihen AF (daha yüksek zayıflama), uç plakalar ve Notokordun kolajen kalıntılarına bağlanır. görüntü sarı orta zayıflama temsil eder, yüksek zayıflama temsil edecek şekilde bir renk kullanılarak görselleştirilmiştir ve kırmızı düşük zayıflama temsil eder. (A - E) Sagital iyoversol kontrast 0, 2, 5, IVD ve 7 incelemeler, ve PMA kontrast. (F - J) enine 0, 2, 5, IVD incelemeler ve iyoversol kontrast 6, ve PMA kontrast. Kaudal IVD'ler burada gösterilmektedir. A la görmek için buraya tıklayınBu rakamın rger sürümü.

Şekil 1
IVD yapısı Şekil 5. sonlu eleman modeli (SEM). FEM analizi büyük sınır şartlarına yerel malzeme yanıtının hesaplama sağlayan güçlü bir matematiksel araçtır. Örneğin, (A), NP (B), AF ayrı kılınabilir ve her bölme, tek kurucu özelliklerini tayin edilebilir. AF ve NP hem (C) ile bir araya getirilen IVD yapısı 3D'de gösterilmiştir. eksenel yükleri alt uç plakasına üstün uç plakada diske sabit kenarı olan uygulandığı zaman, baskı ve gerilme kuvvetlerinin lokal konsantrasyonları belirleyebilir. Sarı noktalar ve siyah oklar bir düğüm uygulanan yükü temsil eder. Bir görüntülemek için lütfen tıklayınızBu rakamın daha büyük versiyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol IVD biyolojik değişikliklerin izlenmesi üzerinde durularak fare FSU bir organdır kültürünü özetliyor. Bu kültürlerin başarılı bakım dikkatli steril teknikler gerektirir. Özellikle, diseksiyon 2.1-2.6 adımları ve Kültür 3.1-3.6'da steril koşulların korunmasını sağlamak için özel dikkat gerektirir adım, ve bu aşamalar kirleticiler en aza indirmek için bir HEPA hava akışı ile izole edilmiş bir uygulama odasında tercihen yapılmalıdır. Diseksiyon işlemi dokularına travmasını neden olduğu için, 3.5 'te 24 saatlik ön şartlandırma süresi kontroller dahil tüm tedavi grupları için gereklidir. canlılık deneyleri örnekleri canlı ve kirlenmemiş olmasını sağlamak ve aynı zamanda hücre homeostazı muhafaza edildiği bir onay olarak hizmet etmek üzere kullanılabilir. NF-KB lüminesans okumalar da kültürlenmiş FSUs iltihabik tepkiyi izlemek uzunlamasına için kullanılabilir; NF-KB express bir artışFSUs gösterebilir kültürü sırasında iyon kirlenmiş veya başka enfeksiyon 11 stres altında ve biz bu nedenle olası bir sorun giderme adımı olarak buradan içerir. Son olarak, taze gruplara karşılaştırmalar histoloji ve mekanik performans kontrol kültürlenmiş örnekler için ek bir kontrol noktası olarak hizmet etmektedir. Bu kültür tekniği plaka başına birden numunelerine müsait, ve deneyimimize göre, bir 24 plaka üzerinde 24 kadar numuneler kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, örneklerin çoklayıcı aynı zamanda çapraz kontaminasyon riskini yayar ve bu yüzden FSUs sorun giderme sırasında ayrı levhalar üzerinde kültürlenebilir önerilir. Bu protokol, 21 günlük bir kültür dönemi için yönergeler Buna ilave olarak aynı yöntem daha uzun ya da daha kısa olan kültür dönemleri için kullanılabilir. FSUs başarıyla 1 haftadan 5 haftaya kadar değişen kültür dönemleri için laboratuarımızda tarafından kültürlenmiştir.

Like tüm modellerde kemirgen organ kültürü modelleri özellikle insanlarda yükleme koşulları yakalama becerisi de, sınırlamaları vardır. Orada murin ve insan IVD'ler 12 arasında geometride ince farklar da vardır, sıçanlar ve fareler dört ayaklı ise insan omurga üzerinde esas olarak eksenel kuvvetler iki ayaklı bulunmaktadır. kültürlü durum nispeten mevcut haliyle yüksüz olduğu için IVD'ler etkilemiş değil ancak, yükleme modu muhtemeldir. Sığır IVD organ kültürü modelleri gibi diğer sistemler 13, 14, mekanik ve yükleme etkileşimleri için daha uygun olabilir. Gelecekteki iş mekanik ve çevresel faktörler arasındaki mechanobiological etkileşimlerin soruşturma etkinleştirmek için yükleme koşulları dahil edecektir. Bu yaklaşımın gücü yüksek çözünürlüklü görüntüleme için onun tutarlılık, çok yönlülük ve yeteneği yatıyor. Buradaki yaklaşım kültür b mümkün olduğunu gösteriyoroth lomber ve kaudal IVD'ler, ancak diskler yaşlanma ve geliştirme 15 arasında anatomik olarak farklı olduğunu not etmek önemlidir. Bunun gibi, bizim deneysel tasarım bel ve ayrı ayrı kaudal seviyelerini randomizes.

Kontrastlı microCT IVD yüksek çözünürlüklü, tahribatsız, üç boyutlu görüntüleme izin verir. Farklı kontrast ajanlar IVD farklı bileşim yönlerini vurgulamak için kullanılabilir. Burada iyoversol, bir iyodin içeren sitotoksik olmayan hidrofilik madde 10 ve fosfomolibdik asit (PMA), kolajen amino artıklarına kelat haline sokan bir ağır metal molekülünün kullanımını göstermektedir. Bu kontrast maddeleri kullanarak, IVD içinde mikroyapı özellikleri vurgulanır ve tespit edilebilir. Iyoversol, böylece, su açısından zengin nucleus ve daha az hidratlanmış annulus fibrosus arasındaki kontrastı sağlayan IVD dokuların nispi hidrasyonunu ayırır.PMA dokudaki nispi kolajen bileşimin farklılaşmasını sağlar ve son-plakaları, annulus fibrosus ve Notokordun vurgulayacaktır. PMA kolajen değişiklikleri izlemek için kültür uç noktasında IVD uygulanabilir ise iyoversol, hidrasyon yatay değişiklikleri belirlemek için, kültür sırasında kullanılabilir.

Bu teknolojinin gelecek uygulamalar diğer hastalıklarda IVD dejenerasyonun çeşitli yönlerini anlamak için transgenik ve devre dışı bırakılmış farelerin diğer suşları kullanılarak içerir. Bundan başka, bu dejenerasyonu IVD'ye katkı etkileşimini tespit etmek amacıyla, arka kök gangliyon gibi diğer organ ve hücreler ile ko-kültür için potansiyel bir platformdur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu yazının yazarları hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma Washington Üniversitesi Kas İskelet Araştırma Merkezi (NIH P30 AR057235), Moleküler Görüntüleme Merkezi (NIH P50 CA094056), mechanobiology Eğitim Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 ve NIH K01AR069116 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar veri toplamada katkılarından dolayı Patrick Wong teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter