Summary
Denne protokol beskriver 3D bioprinting af hjertevæv uden brug af biomaterialer. 3D bioprintede hjertepletter udviser mekanisk integration af komponent sfæroider og er meget lovende i hjertevævregenerering og som 3D-modeller af hjertesygdomme.
Abstract
Denne protokol beskriver 3D bioprinting af hjertevæv uden brug af biomaterialer ved anvendelse af kun celler. Kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster isoleres først, tælles og blandes ved ønskede celleforhold. De er samdyrket i individuelle brønde i 96-brønds plader med ultra-low attachment. Inden for 3 dage, formende sfæroider form. Disse sfæroider hentes derefter af en dyse ved hjælp af vakuumsugning og monteres på en nålopsætning ved hjælp af en 3D bioprinter. Sfærerne får lov til at smelte på nålen. Tre dage efter 3D bioprinting fjernes sfæroiderne som en intakt patch, som allerede spontant slår. 3D bioprintede hjertepletter udviser mekanisk integration af komponent sfæroider og er meget lovende i hjertevævregenerering og som 3D-modeller af hjertesygdomme.
Introduction
Der findes mange forskellige metoder til 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting klassificeres hyppigt af trykteknologi 1 , med eksempler som inkjet bioprinting, microextrusion bioprinting, laserassisteret bioprinting, en kombination af metoder eller nyere tilgange. 3D bioprinting kan også klassificeres i stilladsfrie eller stilladsafhængige metoder 4 . De fleste metoder til 3D bioprinting er stilladsafhængige, hvor der er behov for biomaterialer, fx bioinks 5 eller stilladser 6 . Stilladsafhængig 3D bioprinting står over for mange problemer og begrænsninger 4 , 7 , som f.eks. Immunogenicitet af stilladsmateriale, omkostninger til proprietære biobrændstoffer, langsom hastighed og toksicitet af nedbrydningsprodukter.
SCAFFoldfri hjertevævsteknik ved anvendelse af sfæroider er blevet forsøgt 8 , med potentialet til at overvinde disse ulemper ved stilladsafhængig vævsteknik. Som det blev erkendt af forfatterne i det pågældende papir, havde det imidlertid været vanskeligt at håndtere og positionere sfæroider på faste steder under biofabricering. Den samtidige brug af 3D bioprinting og sfæroidbaseret vævsteknik har potentialet til at overvinde disse vanskeligheder. I denne protokol beskriver vi 3D bioprinting af hjertevæv uden andre biomaterialer ved kun at bruge celler i form af sfæroider.
Stilladsfri sfæroid-baserede 3D-bioprintere 9 har evnen til at samle individuelle sfæroider ved hjælp af vakuumsugning og placere dem på en nålarray. Konceptet med positionering af sfæroider på en nålestik i 3D bioprinting er inspireret af brugen af nålarrayer (kendt som " kenzan ") i den gamle JapaNese kunst af blomster arrangement, ikebana. Dette system gør det muligt at placere spheroider præcist i enhver konfiguration og resulterer i, at de individuelle sfæroider smelter sammen i løbet af en kort periode for at skabe et 3D bioprintet væv. Denne metode gør det således muligt for spheroider at blive manipuleret med lethed, med potentielle konsekvenser for fremtiden for stilladsfri organbiobroduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af kardiomyocytter
- Generere og dyrke humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) på 6-brøndsplader overtrukket med basalmembranmatrix som beskrevet 10 .
- Differentier hiPSC'er i hiPSC-afledte cardiomyocytter (hiPSC-CM'er) ved anvendelse af tidligere beskrevne fremgangsmåder 11 , 12 .
- På dag 19 efter differentiering isolerer kardiomyocytterne ved anvendelse af 2 ml trypsin / EDTA 0,05% i hver brønd i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Overvåg kardiomyocytterne under et optisk mikroskop for at se på celledissociation.
- Neutraliser trypsin ved anvendelse af 2 ml trypsininhibitor 0,0125%.
- Pool de isolerede kardiomyocytter og overfør dem til et 50 ml konisk rør ved brug af et motoriseret pipettefyldstof.
- Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 250 xg ved stuetemperatur for at opnå en pellet.
- Resuspender pelleten i 5 ml Roswell ParkMemorial Institute (RPMI) celle medier suppleret med B-27 (RPMI / B-27 celle medier).
- Pipetter 20 μl celler i cellemedia og farvning med en lige stor mængde 0,4% Trypan Blue-opløsning.
- Brug en automatiseret celletæller eller et manuel hæmocytometer til at tælle og opnå cellesuspensionens koncentration og cellelevedygtighed.
2. Fremstilling af fibroblaster
- Initér cellelinien 13 for human hjertefibroblast (HCF) (voksen ventrikulær type).
- Passage og isolere dem i overensstemmelse med HCF-kulturprotokoller 13 .
- Pipetter 20 μl celler i cellemedier og farv med en lige stor mængde Trypan Blue-opløsning 0,4%.
- Brug en automatiseret celletæller eller et manuel hæmocytometer til at tælle og opnå koncentrationen og cellelevedygtigheden af den nye cellesuspension.
3. Fremstilling af endotelceller
- Initér den menneskelige umbIlisk venet endotelcelle (HUVEC) linje som beskrevet 14 . Passage og isolere dem i overensstemmelse med HUVEC dyrkning protokoller som beskrevet 14 .
- Pipetter 20 μl celler i cellemedia og farvning med en lige stor mængde 0,4% Trypan Blue-opløsning.
- Brug en automatiseret celletæller eller et manuel hæmocytometer til at tælle og opnå cellesuspensionens koncentration og cellelevedygtighed.
4. Co-kultur:
- Bland de tre celletyper (hiPSC-CM, HCF'er og HUVEC'er) i RPMI / B-27-cellemedier til dannelse af en bestanddel af blandet celleopløsning i et 50 ml konisk rør ved et hiPSC-CM: HCF: HUVEC-celleforhold på 70:15:15 og koncentration på 165.000 celler pr. Ml.
- Fordel den blandede celleopløsning i ultra-lave vedhæftede 96-brønds U-bundplader ved 200 μL pr. Brønd eller 33.000 celler pr. Brønd ved anvendelse af en flerkanalspipette.
- Inkuber 96-brøndspladerne i 3 dage (37 ° C, 5% carbondioxidIde, 95% fugtighed).
- Undersøg for forekomst af blandede celle multicellulære sfæroider i midten og bunden af de enkelte brønde under lysmikroskopi.
BEMÆRK: I en todimensionel mikroskopisk fremspring vil disse sfæroider fremstå cirkulære i form ( figur 1 ). Spheroider bør danne sig inden for 24 timer efter cellesedning i 96-brønds plader med ultra-lav vedhæftning. Spheroider skal begynde at slå inden for 48 timer, efter at cellerne har podet i 96-brønds plader. Spheroider, der ikke slår, bør ikke bruges til 3D bioprinting for at sikre, at den endelige 3D-bioprintede hjerteplaster er funktionel. Immunofluorescens af sfæroider for connexin 43 (Cx43) og troponin kan anvendes til at bedømme sfæroid cellulær sammensætning og kvalitet 15 .
5. 3D bioprinting af stilladsfrie hjertevæv
- Læg pladerne, der indeholder sfæroiderne, ind i magasinet på stilladsfrit sfæroidbaseret 3D-bioprinter.
- Tænd 3D bioprinteren og udfør 3D bioprinting software.
- Klik på "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode" og derefter "Home Return".
- Klik på det grønne ikon under "Start" for at starte sfæroid inspektion.
- Se efter, at sfæriske diametre vises under kolonnen "(2) Dia (μm)" på skærmen.
- For at estimere den gennemsnitlige sfæroiddiameter til nærmeste 100 μm skal du klikke på "Indledende indstillinger" og indtaste den gennemsnitlige sfæroiddiameter i Stack Z-pitchen (μm).
- Klik på "Total", tallet under "Lag" skal automatisk justeres. Klik på "Apply" for at bekræfte indstillingerne.
- Klik på "Needle Array Map", gå til "Layer No.", vælg det ønskede lag til 3D bioprinting, og træk det ønskede 3D bioprinting design på kortet til venstre på skærmen ved at vælge individuelle sfæriske positioner. clicK "Apply" for at bekræfte 3D bioprinting design.
- Klik på "Needle Array Check" for at påbegynde nålens array inspektion. Hvis nålearrangementet er ude af fokus, indtast værdierne i "OffsetZ (μm)", der varierer fra 0 til 500 μm for at justere kamerafokus, der starter med 500 μm og falder med 100 μm til 0 μm.
- Klik på "Inspektionsparametre", "Type 1" og indstil "Diameter (μm)" til det ønskede diameterområde. Indstil "Rundhed (%)" og "Glathed (%)" til ønskede procentdele. Klik på "Apply" for at bekræfte indstillingerne.
BEMÆRK: Her blev sfæriske diametre indstillet fra 450 μm til 550 μm. "Rundhed (%)" og "Glathed (%)" er computerberegnes vurdering af hver enkelt sfæroid. Her er indstillingerne anvendt til "Rundhed (%)" 60% og "Glathed (%)" er 70%. - Klik på "Tilstedeværelse" og opdater "Diameter (μm)" til den samme indstillingS i det foregående trin. Klik på "Apply" for at bekræfte indstillingerne.
- Klik på "Stack Mode", hvorefter det grønne ikon under "Start" for at starte sfæroid opsamling ved hjælp af dysen af 3D bioprinteren ved vakuumsugning og placering af sfæroider på bestemte steder i en nålgruppe.
BEMÆRK: For et hjerteplaster bestående af 81 sfæroider (9 sfæroider x 9 sfæroider), skal 3D bioprinting tage ca. 20 til 30 minutter. - Efter bioprinting, brug sterile pincett, hent nålen arrayet indeholdende 3D bioprintet patch og overfør det til et 250 ml sterilt bæger indeholdende 150 ml RPMI / B-27 cellemedier.
- Inkuber den 3D bioprintede patch med nålen array i 3 dage (37 ° C, 5% carbondioxid, 95% fugtighed).
6. Fjernelse af 3D Bioprinted Patch fra Needle Array og Patch Maturation
- Efter 3 dages inkubation, med den ene hånd ved bunden af nålen og den anden på plastdækslet under tHan patch, forsigtigt glide plastdækslet opad for at fjerne den 3D bioprintede patch fra nålen array.
BEMÆRK: Smøring med fosfatbufret saltvand (PBS) kan påføres nålene lige før dette trin, efter behov, til glattere og lettere fjernelse. - Ved hjælp af et par sterile pincetter skal du hente plastikdækslet med 3D-bioprintet patch oven på det og overføre plasteret og plastikdækslet til en 35 mm skål, der indeholder RPMI / B-27-cellemedier.
- Skub forsigtigt plastikdækslet med plasteret i RPMI / B-27-cellemediet, med tængerne stadig på plastdækslet, for at frigøre patchen i mediet.
- Undersøg den 3D bioprintede patch under lysmikroskopi for at visualisere, om det slår for at sikre, at 3D-bioprintet patch er funktionelt.
- Inkubér den 3D bioprintede patch i 35 mm fadet i 3 dage eller længere (37 ° C, 5% carbondioxid, 95% fugtighed).
BEMÆRK: Efter 3 dage smelter sfæroderne sammen og hullerne iLappen, hvor nålene var, skulle ikke længere være synlige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved slutningen af trin 4.4 (samkultur) bør cellerne i hver brønd aggregere i bunden af de ultra-lave vedhæftede 96-brønds U-bundplader for at danne sfæroider med tyngdekraften. Disse sfæroider indeholder hiPSC-CM, HCF'er og HUVEC'er og kan inspiceres visuelt under lysmikroskopi, hvor de skal forekomme cirkulære ved todimensionelle fremspring ( Figur 1 ). I slutningen af trin 6.3 skal det 3D bioprintede hjerteplaster indeholde vævshuler på grund af nålhuller, der er skabt af nålearrangementet ( Figur 2 , venstre). På dette tidspunkt skulle grænserne mellem sfæroiderne være blevet utydelige, og lappen skulle være begyndt at slå spontant og udvise mekanisk integration af sfæroider. Ved slutningen af trin 6.5 skal vævshulerne udfyldes af omgivende væv ( figur 2 , højre), mens 3D-bioprintede hjerteplaster skal fortsætte med at bliveT spontant.
Figur 1 : Oprettelse af blandede celle multicellulære sfæroider. HiPSC-CM, HCF'er og HUVEC'er blev blandet ved et hiPSC-CM: HCF: HUVEC-celleforhold på 70:15:15, og celleblandingen blev fordelt i ultra-lave vedhæftede 96-brønds U-bundplader. Inden for 24 timer dannedes blandede celle multicellulære sfæroider (venstre, højre), en i hver brønd. Målestang = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Oprettelse af hjertevæv, der udviser mekanisk integration af sfæroider . En 3D bioTrykt hjerteplaster umiddelbart efter fjernelse fra nålearray med synlige nålehuller (til venstre). På dette tidspunkt var grænserne mellem sfæroiderne allerede blevet utydelige, og lappen var allerede begyndt at slå spontant, således at sfæroiderne var blevet mekanisk integreret. Tre dage efter fjernelse fra nålearrayet blev vævshulerne forårsaget af nålarrayet udfyldt af omgivende væv (højre), og plasterne fortsatte at slå spontant. Skalbjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender følgende finansieringskilder: Magic That Matters Fund for Kardiovaskulær Forskning og Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
