Summary
यह प्रोटोकॉल जैव पदार्थों के इस्तेमाल के बिना कार्डियाक टिश्यू के 3 डी बायोप्रिंटिंग का वर्णन करता है। 3 डी बायोप्रिंटर्ड कार्डियाक पैचेस घटक स्फेरोएड्स के यांत्रिक एकीकरण को प्रदर्शित करते हैं और कार्डियक टिशू रिजनरेशन में अत्यधिक वादा कर रहे हैं और हृदय रोग के 3 डी मॉडल्स के रूप में।
Abstract
यह प्रोटोकॉल केवल कोशिकाओं का उपयोग करते हुए बायोमैटिरियल्स के उपयोग के बिना कार्डियक टिश्यू के 3D बायोप्रिंटिंग का वर्णन करता है। कार्डियोमायसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट पहले वांछित सेल अनुपात पर पृथक, गिना और मिश्रित होते हैं। वे अल्ट्रा-कम लगाव 96-अच्छी तरह प्लेट्स में व्यक्तिगत कुओं में सह-सुसंस्कृत हैं। तीन दिनों के भीतर, गोलाकार रूपों को पीटा। इन गोलाकारों को एक वैक्यूम चूषण का उपयोग करके नोजल द्वारा उठाया जाता है और एक 3D बायोप्रिंटर का उपयोग करके सुई सरणी पर इकट्ठा किया जाता है। गोलाकारों को सुई सरणी पर फ्यूज करने की अनुमति होती है। 3D बायोप्रिंटिंग के तीन दिन बाद, गोलाकार एक बरकरार पैच के रूप में हटा दिए जाते हैं, जो कि पहले से ही सहज रूप से पिटाई कर रहा था। 3 डी बायोप्रिंटर्ड कार्डियाक पैचेस घटक स्फेरोएड्स के यांत्रिक एकीकरण को प्रदर्शित करते हैं और कार्डियक टिशू रिजनरेशन में अत्यधिक वादा कर रहे हैं और हृदय रोग के 3 डी मॉडल्स के रूप में।
Introduction
3 डी बायोप्रिंटिंग के कई अलग-अलग तरीके हैं 1 , 2 , 3 3 डी बायोप्रिंटिंग अक्सर प्रिंटिंग टेक्नोलॉजी 1 द्वारा वर्गीकृत किया जाता है, जैसे इंकजेट बायोप्रिंटिंग, माइक्रो एक्सट्रैक्शन बायोप्रिंटिंग, लेजर की सहायता से बायोप्रिंटिंग, तरीके का संयोजन, या नए दृष्टिकोण। 3 डी बायोप्रिंटिंग को स्कैफोल्ड-फ्री या पाड़-आश्रित विधियों में वर्गीकृत किया जा सकता है 4 । 3 डी बायोप्रिंटिंग के अधिकांश तरीके पाड़-आश्रित हैं, जहां बायोमैटिरियल्स की आवश्यकता है, जैसे कि बायोइंक्स 5 या स्कैफोल्ड 6 हालांकि, स्कैफोल्ड-आश्रित 3 डी बायोप्रिंटिंग कई मुद्दों और सीमाएं 4 , 7 का सामना करती है, जैसे मचान सामग्री की प्रतिरक्षा, स्वामित्व वाली बायोनिक्स की लागत, धीमी गति और गिरावट उत्पादों की विषाक्तता।
scafस्क्रैफोल्ड-आश्रित टिशू इंजीनियरिंग के इन नुकसानों को दूर करने की क्षमता के साथ, स्फेरोइड्स का उपयोग कर गुना-मुक्त हृदय टिशू इंजीनियरिंग 8 का प्रयास किया गया है। हालांकि, उस पत्र में लेखकों द्वारा स्वीकार किए जाने के अनुसार, बायोफैब्रिकेशन की प्रक्रिया में, निश्चिंत स्थानों पर सशक्त रूप से संभाल करने और गोलाकारों को संभालना मुश्किल था। 3 डी बायोप्रिंटिंग और गोलाकार-आधारित ऊतक इंजीनियरिंग के सहवर्ती उपयोग में इन कठिनाइयों को दूर करने की क्षमता है। इस प्रोटोकॉल में, हम अन्य बायोमैटिरियल्स के बिना कार्डियक टिश्यू के 3 डी बायोप्रिंटिंग का वर्णन करते हैं, जो केवल कोशिकाएं का उपयोग कर spheroids के रूप में करते हैं।
पाड़ से मुक्त गोलाकार-आधारित 3 डी बायोप्रिंटर्स 9 में वैक्यूम सक्शन का उपयोग करके व्यक्तिगत स्फेरोइड्स को लेने और उन्हें सुई सरणी पर स्थित करने की क्षमता है। 3 डी बायोप्रिंटिंग में एक सुई सरणी पर पोजीशनिंग स्पिरोइड्स की अवधारणा , प्राचीन जैपा में सुई सरणियों (" केन्ज़ान " के रूप में जाना जाता है) के उपयोग से प्रेरित हैफूल व्यवस्था की नीस कला, ikebana इस प्रणाली में spheroids किसी भी विन्यास में ठीक स्थिति में रहने की अनुमति देता है और परिणामस्वरूप व्यक्तिगत गोलाकारों में परिणाम होता है जो एक छोटी अवधि के लिए एक 3D बायोप्रिंटेड ऊतक तैयार करता है। इस पद्धति से स्फेरोएड्स को आसानी से हेरफेर करने की अनुमति मिलती है, जिसमें स्कैफोल्ड-मुक्त अंग बायोफैब्रिकेशन के भविष्य के संभावित प्रभाव पड़ता है।
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Protocol
1. कार्डियोमायोसाइट्स की तैयारी
- जनरेट और संस्कृति मानव प्रेरित बहुविकल्पी स्टेम कोशिकाओं (एचईपीएससी) 6-अच्छी तरह से तराजू झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित प्लेटों 10 वर्णित के रूप में।
- पहले वर्णित विधियों 11 , 12 का उपयोग करके hiPSCs को hiPSC-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) में विभेद करें।
- भेदभाव के बाद 1 9 दिन बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए हर अच्छी तरह से ट्रिप्सिन / ईडीटीए 0.05% के 2 एमएल का उपयोग कर कार्डियोमोसाइट्स अलग करें।
- कोशिका विस्थापन के लिए देखने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कार्डिय्योमोसाइट्स की निगरानी करें।
- Trypsin inhibitor 0.0125% के 2 एमएल का उपयोग कर Trypsin को बेअसर करना।
- पृथक कार्डियोमोओसाइट्स को पूल करें और उन्हें एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में मोटर चालित पिपेट भराव का उपयोग करके स्थानांतरित करें।
- एक गोली प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 250 xg पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
- रोसेवेल पार्क के 5 एमएल में गोली को फिर से खोलेंमेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) सेल मीडिया जो बी -27 (आरपीएमआई / बी -27 सेल मीडिया) के साथ पूरक है।
- सेल मीडिया में कोशिकाओं के 20 μL पिपेट करें और 0.4% ट्रिपेन ब्लू समाधान की एक समान राशि के साथ दाग।
- सेल निलंबन की एकाग्रता और सेल व्यवहार्यता की गणना और प्राप्त करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर या मैनुअल हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करें।
2. फाइब्रोब्लास्ट्स की तैयारी
- मानव कार्डियाक फाइब्रोब्लास्ट (एचसीएफ) (वयस्क निलय प्रकार) सेल लाइन 13 आरंभ करें
- एचसीएफ संवर्धन प्रोटोकॉल 13 के अनुसार मार्ग को अलग करना और अलग करना
- सेल मीडिया में कोशिकाओं के 20 μL पिपेट करें और ट्रिपन ब्लू समाधान 0.4% की एक समान मात्रा के साथ दाग।
- नए सेल निलंबन की एकाग्रता और सेल व्यवहार्यता की गणना और प्राप्त करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर या मैनुअल हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करें।
3. एंडोथेलियल सेल की तैयारी
- मानव अंग को आरंभ करेंइलैक्टिकल नाड़ी एंडोथेलियल सेल (एचयूईईईसी) लाइन के रूप में वर्णित 14 एचआईवीईसी संवर्धन प्रोटोकॉल के अनुसार 14 को वर्णित अनुसार पारित और अलग करना
- सेल मीडिया में कोशिकाओं के 20 μL पिपेट करें और 0.4% ट्रिपेन ब्लू समाधान की एक समान राशि के साथ दाग।
- सेल निलंबन की एकाग्रता और सेल व्यवहार्यता की गणना और प्राप्त करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर या मैनुअल हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करें।
4. सह संस्कृति:
- आरपीएमआई / बी 27 सेल मीडिया में तीन कोशिका प्रकार (एचईपीएससी-सीएम, एचसीएफ और एचयूवीईसी) को मिलाएं, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मिश्रित सेल समाधान का एक हाईपीएससी-सीएम में एचसीएफ: एचसीईएफ़ सेल अनुपात 70:15:15 और प्रति एमएल 165,000 कोशिकाओं की एकाग्रता
- एक मल्टी-चैनल विंदुक का उपयोग करते हुए 200 μL प्रति अच्छी तरह से, या प्रति अच्छी तरह से 33,000 कोशिकाओं पर अल्ट्रा-कम लगाव 96-अच्छी तरह से यू-तल प्लेट्स में मिश्रित सेल समाधान वितरित करें।
- 96 दिनों की अच्छी तरह से प्लेटें 3 दिनों के लिए सेते हैं (37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्सआईडीई, 95% नमी)।
- हल्के माइक्रोस्कोपी के तहत, व्यक्तिगत कुओं के केंद्र और नीचे मिश्रित सेल बहुकोशिकीय गोलाकारों की उपस्थिति का निरीक्षण करें।
नोट: एक दो-आयामी सूक्ष्म प्रक्षेपण में, इन गोलाकारों को आकार में परिपत्र ( चित्रा 1 ) दिखाई देगा। स्पेलरोड्स को 24 घंटे के भीतर, सेल सेसिंग के बाद अल्ट्रा-कम लगाव 96-अच्छी तरह प्लेट्स में होना चाहिए। सेलरोइड को 96-अच्छी तरह प्लेटों में पेश करने के बाद, स्पेलरोइड को 48 घंटे के भीतर पिटा होना चाहिए। पिटाई नहीं करने वाले गोलाकारों को 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अंतिम 3 डी बायोप्रिंट कार्डिया पैच कार्यात्मक है। कनेनसिन 43 (सीएक्स 43) और ट्रोपोनिन के लिए स्पाइरोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग स्फेरॉयड सेलुलर रचना और गुणवत्ता 15 का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
5. पाबंद मुक्त कार्डिएक टिश्यू के 3 डी बायोप्रिंटिंग
- पाड़ से मुक्त प्लैरोइड-आधारित 3D बायोप्रिंटर के पत्रिकाओं में स्फेरोइड्स युक्त प्लेटें लोड करें।
- 3 डी बायोप्रिंटर चालू करें और 3 डी बायोप्रिंटिंग सॉफ़्टवेयर निष्पादित करें।
- "सहायक", "ऑपरेशन की तैयारी", "निरीक्षण मोड", और फिर "होम रिटर्न" पर क्लिक करें
- गोलाकार निरीक्षण शुरू करने के लिए "प्रारंभ" के तहत हरे रंग के आइकन पर क्लिक करें।
- स्क्रीन पर "(2) व्यास (माइक्रोन)" कॉलम के नीचे आने के लिए गोलाकार व्यास के लिए देखें
- निकटतम 100 गोल के औसत गोलाकार व्यास का अनुमान लगाने के लिए, "आरंभिक सेटिंग" पर क्लिक करें और ढेर जैक पिच (माइक्रोन) में औसत गोलाकार व्यास दर्ज करें।
- "कुल" पर क्लिक करें, "परतों" के नीचे की संख्या को स्वचालित रूप से समायोजित करना चाहिए सेटिंग की पुष्टि करने के लिए "लागू करें" पर क्लिक करें
- "सुई अर्रे मानचित्र" पर क्लिक करें, "परत संख्या" पर जाएं, 3D बायोप्रिंटिंग के लिए वांछित परत का चयन करें, और अलग-अलग गोलाकार स्थितियों का चयन करके स्क्रीन के बाईं ओर के मानचित्र पर वांछित 3D बायोप्रिंटिंग डिज़ाइन बनाएं। CLIC3 डी बायोप्रिंटिंग डिजाइन की पुष्टि करने के लिए "लागू करें"
- सुई सरणी निरीक्षण शुरू करने के लिए "सुई अर्रे चेक" पर क्लिक करें। यदि सुई सरणी फ़ोकस से बाहर है, इनपुट मूल्यों को "ऑफसेटज़ (μm)" में 0 से 500 माइक्रोन तक, कैमरा फोकस को समायोजित करने के लिए, 500 माइक्रोन से शुरू करने और 100 माइक्रोन से 0 माइक्रोन तक घटते हैं।
- "निरीक्षण पैरामीटर्स", "प्रकार 1" पर क्लिक करें, और इच्छित व्यास श्रेणी में "व्यास (माइक्रोन)" सेट करें वांछित प्रतिशत के लिए "गोलाई (%)" और "चिकनाई (%)" सेट करें सेटिंग की पुष्टि करने के लिए "लागू करें" पर क्लिक करें
नोट: यहां गोलाकार व्यास को 450 μm से 550 माइक्रोन तक सेट किया गया था। "गोलाकार (%)" और "चिकनाई (%)" कंप्यूटर प्रत्येक व्यक्ति गोलाकार का गणना मूल्यांकन है। यहां, "गोलाई (%)" के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग 60% है और "चिकनाई (%)" 70% है - "उपस्थिति" पर क्लिक करें और एक ही सेटिंग में "व्यास (माइक्रोन)" को अपडेट करेंएस पिछले चरण में है सेटिंग की पुष्टि करने के लिए "लागू करें" पर क्लिक करें
- "स्टैक मोड" पर क्लिक करें, फिर "स्टार्ट" के तहत हरे रंग के आइकन को वैक्यूम चूषण द्वारा 3 डी बायोप्रिंटर की नोजल का प्रयोग करके गोलाकार लेना और एक सुई सरणी में विशिष्ट स्थानों में गोलाकारों का स्थान लेने के लिए शुरू करना।
नोट: 81 स्फेरोइड्स (9 गोलाकार x 9 गोलाकार) से युक्त हृदय पैच के लिए, 3 डी बायोप्रिंटिंग को लगभग 20 से 30 मिनट लगाना चाहिए। - जीवाणु संदंश का उपयोग करने के बाद, 3 डी बायोप्रिंटेड पैच युक्त सुई सरणी को उठाएं और उसे आरपीएमआई / बी 27 सेल मीडिया के 150 एमएल युक्त 250 एमएल बाँझ बीकर में स्थानांतरित करें।
- 3 दिन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड, 95% नमी) के लिए सुई सरणी के साथ 3 डी बायोप्रिंटेड पैच सेते हैं।
6. सुई सरणी और पैच परिपक्वता से 3 डी बायोप्रिंटेड पैच को हटाने
- ऊष्मायन के 3 दिनों के बाद, सुई सरणी के आधार पर एक तरफ और दूसरे को टी के नीचे प्लास्टिक के आवरण परवह पैच, सुई सरणी से 3 डी बायोप्रिंटेड पैच को निकालने के लिए प्लास्टिक कवर ऊपर की तरफ स्लाइड करें।
नोट: आसान और आसान हटाने के लिए, फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ स्नेहन को इस चरण के ठीक पहले सुई पर लागू किया जा सकता है। - बाँझ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके, इसके ऊपर 3 डी बायोप्रिंटेड पैच के साथ प्लास्टिक कवर को उठाओ और पैच और प्लास्टिक कवर को 35 मिमी डिश युक्त आरपीएमआई / बी 27 सेल मीडिया में स्थानांतरित करें।
- आरपीएमआई / बी -27 सेल मीडिया में पैच के साथ प्लास्टिक कवर को धीरे से हिलाएं, मीडिया में पैच को रिलीज करने के लिए अभी भी प्लास्टिक कवर पर रखे संदंश के साथ।
- प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत 3 डी बायोप्रिंटेड पैच का निरीक्षण करने के लिए कल्पना करें कि क्या यह सुनिश्चित करना है कि 3D बायोप्रिंट पैच कार्यात्मक है
- 3 दिन या उससे अधिक (37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड, 95% नमी) के लिए 35 मिमी डिश में 3 डी बायोप्रिंटेड पैच सेते।
नोट: 3 दिनों के बाद, गोलाकार एक साथ फ्यूज और छेद मेंपैच, जहां सुई थे, अब दिखाई नहीं देनी चाहिए।
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Representative Results
चरण 4.4 (सह-संस्कृति) के अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं को अल्ट्रा-निचले लगाव 96-अच्छी तरह से यू-तल प्लेटों के नीचे गुरुत्वाकर्षण द्वारा गोलाकार बनाने के लिए तैयार करना चाहिए। इन गोलाकारों में hiPSC-CM, HCFs, और HUVECs होते हैं, और उन्हें प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत निरीक्षण किया जा सकता है, जहां उन्हें दो-आयामी प्रक्षेपण ( चित्रा 1 ) द्वारा परिपत्र दिखाई देना चाहिए। चरण 6.3 के अंत में, सुई सरणी ( चित्रा 2 , बायां) द्वारा बनाई गई सुई छेद के कारण 3 डी बायोप्रिंट कार्डिया पैच में ऊतक वियोज़ होना चाहिए। इस बिंदु पर, गोलाकारों के बीच की सीमाओं को अस्पष्ट बना दिया जाना चाहिए और पैच को स्वैच्छिक रूप से हरा जाना चाहिए था, स्पिरोइड्स के यांत्रिक एकीकरण का प्रदर्शन करना। चरण 6.5 के अंत में, आसपास के ऊतक ( चित्रा 2 , दाएं) के द्वारा ऊतक की आवाज़ें भरी जानी चाहिए, जबकि 3 डी बायोप्रिंटर्ड कार्डियाक पैच बीए जारी रखना चाहिएस्वैच्छिक रूप से
चित्रा 1 : मिश्रित कोशिका बहुकोशिकीय spheroids का निर्माण। हायपीएससी-सीएम, एचसीएफ और एचयूवीईएस एक हायपीएससी-सीएम: एचसीएफ: एचयूईईईसी सेल अनुपात 70:15:15 पर मिश्रित थे, और सेल मिश्रण को अल्ट्रा-कम लगाव 96-अच्छी तरह से यू-नीचे प्लेट्स में वितरित किया गया था। 24 घंटे के भीतर, मिक्स्ड सेल बहुकोशिकीय spheroids (बाएं, दाएं) का गठन, प्रत्येक कण में एक स्केल बार = 500 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2 : स्फेरोएड के यांत्रिक एकीकरण का प्रदर्शन हृदय संबंधी ऊतक का निर्माण । एक 3 डी जैवदृश्य सुई छेद (बाईं) के साथ सुई सरणी से तुरंत हटाने के बाद मुद्रित कार्डियक पैच इस समय, spheroids के बीच की सीमाएं पहले से ही अस्पष्ट हो चुकी थीं और पैच पहले से ही सहजता से पिटाई शुरू कर चुकी थी, इस प्रकार वेफिरोइड्स यांत्रिक रूप से एकीकृत हो गए थे। सुई सरणी से निकालने के तीन दिन बाद, सुई सरणी के कारण ऊतक की आवाज़ें आसपास के ऊतकों (दाएं) से भर जाती थीं, और पैच अनायास धड़क रहा था स्केल बार = 1 मिमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों ने निम्नलिखित फंडिंग स्रोतों को स्वीकार किया: मेडिजैट मैटर्स फंड फॉर कार्डियोवास्कुलर रिसर्च और मैरीलैंड स्टेम सेल रिसर्च फंड (2016-एमएसआरआरएफआरआई -735)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
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