Summary
Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.
Abstract
Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais, utilizando apenas células. Os cardiomiócitos, as células endotélias e os fibroblastos são primeiro isolados, contados e misturados às proporções de células desejadas. Eles são co-cultivados em poços individuais em placas de 96 poços de ultra-baixa fixação. Dentro de 3 dias, formando esferóides. Esses esferóides são então apanhados por um bico com aspiração a vácuo e montados em uma agulha com uma bioprantia 3D. Os esferóides são então autorizados a fundir na disposição da agulha. Três dias após a bioprinção em 3D, os esferóides são removidos como um remendo intacto, que já está espancando espontaneamente. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.
Introduction
Existem muitos métodos diferentes de bioprinção 3D 1 , 2 , 3 . A bioprinção em 3D é freqüentemente classificada pela tecnologia de impressão 1 , com exemplos como bioprintagem a jato de tinta, bioprinção de microextrusão, bioprinção assistida a laser, uma combinação de métodos ou abordagens mais recentes. A bioprinção 3D também pode ser classificada em métodos não dependentes de andaimes ou dependentes de andaimes 4 . A maioria dos métodos de bioprinção em 3D são dependentes de andaimes, onde há necessidade de biomateriais, por exemplo , bioinks 5 ou andaimes 6 . No entanto, a bioprinção 3D dependente do andaime enfrenta muitos problemas e limitações 4 , 7 , como a imunogenicidade do material de andaimes, o custo dos bioinks proprietários, a velocidade lenta e a toxicidade dos produtos de degradação.
ScafA engenharia de tecido cardíaco sem dobra usando esferóides foi tentada 8 , com o potencial de superar essas desvantagens da engenharia de tecido dependente de andaimes. No entanto, como reconhecido pelos autores nesse artigo, foi difícil manipular e posicionar robustos esferoides em locais fixos, no processo de biofabricação. O uso concomitante de bioprinção 3D e engenharia de tecido à base de esferóides tem o potencial de superar essas dificuldades. Neste protocolo, descrevemos a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem outros biomateriais, utilizando apenas células na forma de esferóides.
As bioprinteiras 3D baseadas em esferóides sem cadastro 9 possuem a capacidade de retirar esferóides individuais usando aspiração a vácuo e colocá-los em uma disposição de agulhas. O conceito de posicionamento de esferóides em uma disposição de agulhas em bioprinção 3D, é inspirado no uso de matrizes de agulhas (conhecidas como " kenzan ") no antigo JapaNese arte de arranjo de flores, ikebana. Este sistema permite que os esferóides sejam posicionados com precisão em qualquer configuração e resulte em esferóides individuais fundindo em um curto período para criar um tecido 3D bioprinted. Este método permite que os esferóides sejam manipulados com facilidade, com implicações potenciais para o futuro da biofabricação de órgãos isentos de andaimes.
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Protocol
1. Preparação de cardiomiócitos
- Gerar e cultivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) em placas de 6 poços revestidas com a matriz da membrana basal como descrito 10 .
- Diferencie o HiPSCs em cardiomiócitos derivados de HiPSC (HiPSC-CMs) utilizando métodos previamente descritos 11 , 12 .
- No dia 19 após a diferenciação, isolar os cardiomiócitos usando 2 mL de tripsina / EDTA 0,05% em cada poço durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Monitore os cardiomiócitos sob um microscópio óptico para verificar a dissociação celular.
- Neutralize Trypsin usando 2 mL de inibidor de tripsina 0,0125%.
- Coloque os cardiomiócitos isolados e transfira-os para um tubo cônico de 50 mL usando um enchimento de pipeta motorizado.
- Centrifugar a suspensão celular durante 5 min a 250 xg à temperatura ambiente para obter um grânulo.
- Ressuspender o sedimento em 5 mL de Roswell ParkMeio celular do Instituto Memorial (RPMI) suplementado com B-27 (mídia celular RPMI / B-27).
- Pipetar 20 μL de células em meio celular e manchar com uma quantidade igual de 0,4% solução de Trypan Blue.
- Use um contador de células automatizado ou um hemocitômetro manual para contar e obter a concentração ea viabilidade celular da suspensão celular.
2. Preparação de fibroblastos
- Inicie a linha celular 13 do grupo de fibroblasto cardíaco humano (HCF) (tipo ventricular adulto).
- Passar e isolá-los de acordo com os protocolos de cultivo de HCF 13 .
- Pipetar 20 μL de células em meio celular e manchar com uma quantidade igual de solução de Trypan Blue 0,4%.
- Use um contador de células automatizado ou um hemocitômetro manual para contar e obter a concentração e a viabilidade celular da nova suspensão celular.
3. Preparação de células endoteliais
- Inicie o umb humanoLinha de células endoteliais da veia ilíaca (HUVEC) como descrito 14 . Passar e isolá-los de acordo com os protocolos de cultura HUVEC conforme descrito 14 .
- Pipetar 20 μL de células em meio celular e manchar com uma quantidade igual de 0,4% solução de Trypan Blue.
- Use um contador de células automatizado ou um hemocitômetro manual para contar e obter a concentração ea viabilidade celular da suspensão celular.
4. Co-cultura:
- Misture os três tipos de células (HiPSC-CM, HCFs e HUVECs) em meios celulares RPMI / B-27 para gerar um estoque de solução celular mista em um tubo cônico de 50 mL, em uma relação de células HiPCC-CM: HCF: HUVEC de 70:15:15 e concentração de 165,000 células por mL.
- Distribua a solução de células misturadas para placas de fundo em U de 96 poços de ultra-baixa em 200 μL por poço, ou 33,000 células por poço, usando uma pipeta multicanal.
- Incubar os pratos de 96 poços durante 3 dias (37 ° C, 5% de diox de carbonoIde, 95% de umidade).
- Inspecione a presença de esferóides multicelulares de células misturadas no centro e na parte inferior dos poços individuais, sob microscopia óptica.
NOTA: Em uma projeção microscópica bidimensional, esses esferóides aparecerão de forma circular ( Figura 1 ). Os esferóides devem se formar dentro de 24 h, após a semeadura de células em placas de 96 poços de inserção ultra baixa. Os esferóides devem começar a bater dentro de 48 h, após a semeadura de células em placas de 96 poços. Os esferóides que não estão batendo não devem ser usados para a bioprinção em 3D para garantir que o patch cardiológico 3D bioprinted final seja funcional. A imunofluorescência de esferóides para a conexina 43 (Cx43) e troponina pode ser utilizada para avaliar a composição e a qualidade celular esferoidais 15 .
5. Bioprintagem 3D de tecidos cardíacos isentos de andaimes
- Carregue as placas que contêm os esferoides nas revistas da bioprintura 3D à base de esferóides isqueiro.
- Ligue o bioprinter 3D e execute o software de bioprinção 3D.
- Clique em "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode" e depois "Home Return".
- Clique no ícone verde em "Iniciar" para iniciar a inspeção esferóide.
- Observe se os diâmetros esferoidais aparecerão na coluna "(2) Dia (μm)" na tela.
- Para estimar o diâmetro esferoide médio para os 100 μm mais próximos, clique em "Configurações iniciais" e digite o diâmetro médio da esferóide no passo Stack Z (μm).
- Clique em "Total", o número em "Camadas" deve ser ajustado automaticamente. Clique em "Aplicar" para confirmar as configurações.
- Clique em "Mapa da Arraise da Agulha", vá para "No. da Camada", selecione a camada desejada para a biologia biológica em 3D e desenhe o desenho de bioprinção 3D desejado no mapa à esquerda da tela, selecionando posições esferoidais individuais. ClicK "Aplicar" para confirmar o desenho 3D bioprinting.
- Clique em "Controle da Armazenagem da Agulha" para iniciar a inspeção da matriz de agulhas. Se a disposição da agulha estiver fora de foco, introduza valores em "OffsetZ (μm)", variando de 0 a 500 μm para ajustar a focagem da câmera, começando com 500 μm e diminuindo de 100 μm a 0 μm.
- Clique em "Parâmetros de inspeção", "Tipo 1" e defina "Diâmetro (μm)" para a faixa de diâmetro desejada. Defina "Redondeza (%)" e "Suavidade (%)" para as porcentagens desejadas. Clique em "Aplicar" para confirmar as configurações.
NOTA: Aqui os diâmetros esferoidais foram ajustados de 450 μm a 550 μm. "Roundness (%)" e "Smoothness (%)" são calculados pela computação de cada esferóide individual. Aqui, as configurações usadas para "Roundness (%)" são 60% e "Loughness (%)" é de 70%. - Clique em "Presença" e atualize o "Diâmetro (μm)" para a mesma configuraçãoS no passo anterior. Clique em "Aplicar" para confirmar as configurações.
- Clique em "Modo de pilha", depois no ícone verde em "Iniciar" para iniciar a retirada de esferóides usando o bocal da bioprítica 3D por aspiração de vácuo e colocação de esferoides em locais específicos em uma disposição de agulhas.
NOTA: Para um adesivo cardíaco consistindo de 81 esferóides (9 esferóides x 9 esferóides), a bioprinção 3D deve demorar cerca de 20 a 30 minutos. - Após a bioprintagem, usando fórceps esterilizados, pegue o conjunto de agulhas contendo o patch 3D bioprinted e transfira-o para um copo esterilizado de 250 mL contendo 150 mL de meio celular RPMI / B-27.
- Incubar o patch 3D bioprinted com o conjunto de agulhas durante 3 dias (37 ° C, 5% de dióxido de carbono, 95% de umidade).
6. Remoção do Patch Bioprinted 3D da Matriz de Agulhas e Maturação de Patch
- Após 3 dias de incubação, com uma mão na base do conjunto de agulhas e a outra na tampa de plástico sob tEle patch, deslize suavemente a tampa de plástico para cima para remover o patch 3D bioprinted da matriz de agulhas.
NOTA: A lubrificação com solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser aplicada às agulhas imediatamente antes desta etapa, conforme necessário, para uma remoção mais suave e fácil. - Usando um par de pinças estéreis, pegue a tampa de plástico com o remendo bioprinológico 3D em cima dele e transfira o patch e a tampa de plástico para um prato de 35 mm contendo mídia celular RPMI / B-27.
- Agite suavemente a tampa de plástico com o patch na mídia celular RPMI / B-27, com a pinça ainda segurando a tampa de plástico, para liberar o patch na mídia.
- Inspecione o patch 3D bioprinted sob microscópio de luz para visualizar se está batendo para garantir que o patch 3D bioprinted seja funcional.
- Incubar o patch 3D bioprinted no prato de 35 mm por 3 dias ou mais (37 ° C, 5% de dióxido de carbono, 95% de umidade).
NOTA: Após 3 dias, os esferóides se fundem e os orifícios emO patch, onde as agulhas estavam, não deveria mais ser visível.
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Representative Results
No final do passo 4.4 (co-cultura), as células em cada poço devem agregar no fundo das placas de fundo em U de 96 poços de montagem ultra baixa para formar esferóides por gravidade. Esses esferóides contêm hiPSC-CM, HCFs e HUVECs e podem ser vistos visualmente sob microscopia de luz, onde devem aparecer de forma circular por projeção bidimensional ( Figura 1 ). No final do passo 6.3, o remendo cardíaco bioprinted 3D deve conter vazios de tecido, devido a orifícios de agulha criados pela disposição da agulha ( Figura 2 , à esquerda). Neste ponto, os limites entre os esferóides devem se tornar indistintos e o parto deveria ter começado a bater espontaneamente, exibindo integração mecânica de esferóides. No final do passo 6.5, os vazios do tecido devem ser preenchidos pelo tecido circundante ( Figura 2 , à direita), enquanto o remendo cardíaco bioprinted 3D deve continuar a serT espontaneamente.
Figura 1 : Criação de esferóides multicelulares de células misturadas. HiPSC-CM, HCFs e HUVECs foram misturados em uma relação de células HiPSC-CM: HCF: HUVEC de 70:15:15, e a mistura celular foi distribuída em placas de fundo em U de 96 poços de inserção ultra baixa. Dentro de 24 h, formaram-se esferóides multicelulares de células misturadas (esquerda, direita), um em cada poço. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2 : Criação de tecido cardíaco que exibe integração mecânica de esferóides . Uma biografia 3DPatch cardíaco impresso imediatamente após a remoção do conjunto de agulhas com orifícios de agulhas visíveis (esquerda). Neste momento, os limites entre os esferóides já se tornaram indistintos e o remendo já havia começado a bater espontaneamente, assim os esferóides se tornaram mecanicamente integrados. Três dias após a remoção da disposição da agulha, os vazios do tecido causados pela disposição da agulha foram preenchidos pelo tecido circundante (à direita), e o adesivo continuou batendo espontaneamente. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research e o Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
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