Bioengineering

使用3D生物印刷创建心脏组织展示球体的机械整合

Published: July 2, 2017 doi: 10.3791/55438

Chin Siang Ong^1,2, Takuma Fukunishi¹, Andrew Nashed¹, Adriana Blazeski³, Huaitao Zhang¹, Samantha Hardy¹, Deborah DiSilvestre², Luca Vricella¹, John Conte¹, Leslie Tung³, Gordon Tomaselli², Narutoshi Hibino¹

¹Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital, ²Division of Cardiology, Johns Hopkins Hospital, ³Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

Summary

该协议描述了不使用生物材料的心脏组织的3D生物印迹。 3D生物印迹的心脏贴片显示组件球体的机械整合，并且在心脏组织再生和心脏病的3D模型中是非常有希望的。

Abstract

该协议描述了仅使用细胞而不使用生物材料的心脏组织的3D生物印迹。首先分离心肌细胞，内皮细胞和成纤维细胞，计数并以所需细胞比例混合。它们在超低附件96孔板中的各个孔中共培养。在3天内，殴打球体。然后使用真空抽吸由喷嘴拾取这些球体，并使用3D生物打印机在针阵列上组装。然后允许球体在针阵列上熔断。三维生物印迹三天后，球状体作为完整的贴片被去除，已经自发地发生跳动。 3D生物印迹的心脏贴片显示组件球体的机械整合，并且在心脏组织再生和心脏病的3D模型中是非常有希望的。

Introduction

3D生物印迹有很多不同的方法^， ^1，2，3 。 3D生物打印通常通过印刷技术^1进行分类，例如喷墨生物印刷，微压缩生物印刷，激光辅助生物印刷，方法的组合或更新的方法。 3D生物印迹也可以分为无支架或支架依赖的方法⁴ 。 3D生物印迹的大多数方法是支架依赖的，其中需要生物材料，例如生物蛋白⁵或支架⁶ 。然而，支架依赖的3D生物印迹面临许多问题和局限性，如脚手架材料的免疫原性，专有生物蛋白的成本，降解产物的速度和毒性等。

SCAF已经尝试使用球体的无折叠心脏组织工程⁸ ，有可能克服支架依赖组织工程的这些缺点。然而，正如作者在该论文中所承认的那样，在生物制造过程中难以强力地处理和定位固定位置的球体。伴随使用3D生物印迹和基于球形的组织工程有可能克服这些困难。在本协议中，我们描述了没有其他生物材料的心脏组织的3D生物印迹，仅使用球形形式的细胞。

基于无支架的基于球体的3D生物打印机⁹具有使用真空抽吸拾取单个球体的能力，并将其定位在针阵列上。 3D生物印刷中针阵列上的定位球体的概念是从古代日本使用针阵（被称为“ kenzan ”）的灵感来的nese艺术的花卉安排， ikebana。该系统允许球体精确地定位在任何配置中，并导致单个球体在短时间内熔合在一起以产生3D生物印刷组织。因此，该方法允许容易地操纵球体，对于无支架器官生物制造的未来具有潜在的影响。

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Protocol

1.心肌细胞的制备

如上所述，在用基底膜基质包被的6孔板上产生和培养人诱导的多能干细胞（hiPSC）。
使用先前描述的方法^11,12将hiPSC分化为hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CM）。
分化后第19天，使用2mL胰蛋白酶/ EDTA的胰蛋白酶/ EDTA 0.05％的室温分离5分钟。
在光学显微镜下监测心肌细胞以观察细胞解离。
使用2mL胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶0.0125％。
放置分离的心肌细胞，并使用电动吸管填充物将其转移到一个50 mL锥形管中。
在室温下以250×g离心细胞悬液5分钟，得到沉淀物。
将沉淀物重新悬浮在5mL Roswell Park中补充有B-27（RPMI / B-27细胞培养基）的纪念研究所（RPMI）细胞培养基。
移取细胞培养液中的20μL细胞，并用等量的0.4％台盼蓝溶液进行染色。
使用自动细胞计数器或手动血细胞计数器来计数和获得细胞悬浮液的浓度和细胞活力。

2.成纤维细胞的制备

启动人心脏成纤维细胞（HCF）（成人心室型）细胞系¹³ 。
通过并根据HCF培养方案分离它们¹³ 。
移取细胞培养液中的20μL细胞，并用等量的台盼蓝溶液0.4％染色。
使用自动细胞计数器或手动血细胞计数器来计数和获得新细胞悬浮液的浓度和细胞活力。

3.内皮细胞的制备

启动人类的伞如静脉内皮细胞（HUVEC）线所述。按照HUVEC培养方案进行传播并分离，如图^14所示。
移取细胞培养液中的20μL细胞，并用等量的0.4％台盼蓝溶液进行染色。
使用自动细胞计数器或手动血细胞计数器来计数和获得细胞悬浮液的浓度和细胞活力。

共同文化：

将三种细胞类型（hiPSC-CM，HCF和HUVEC）混合在RPMI / B-27细胞培养基中，以一个hiPSC-CM：HCF：HUVEC细胞比率在50mL锥形管中产生混合细胞溶液原料70:15:15，浓度为165,000个细胞/ mL。
使用多通道移液管将混合细胞溶液分配到每孔200μL或每孔33,000个细胞的超低附着96孔U底板中。
将96孔板孵育3天（37℃，5％二氧化碳）ide，95％湿度）。
在光学显微镜下检查单个孔的中部和底部混合细胞多细胞球体的存在。
注意：在二维微观投影中，这些球体将呈圆形（图1 ）。在细胞接种到超低附着的96孔板后24小时内，球形体应形成。细胞播种到96孔板后48小时内，球体应开始跳动。不跳动的球体不应用于3D生物印刷，以确保最终的3D生物印迹心脏贴片是功能性的。球蛋白对连接蛋白43（Cx43）和肌钙蛋白的免疫荧光可用于评估球状细胞组成和质量¹⁵ 。

5.脚手架心脏组织的3D生物印迹

将含有球体的板载入无支架的基于球体的3D生物打印机的杂志。
打开3D生物打印机并执行3D生物打印软件。
1. 单击“辅助”，“操作准备”，“检查模式”，然后单击“归位”。
2. 单击“开始”下的绿色图标开始球体检查。
3. 观察球体直径出现在屏幕上的“（2）Dia（μm）”列下。
要将平均球体直径估算为最接近的100μm，请单击“初始设置”，并将平均球体直径输入到堆叠Z间距（μm）。
单击“总计”，“层”下的数字应自动调整。点击“应用”确认设置。
点击“针数组图”，进入“图层编号”，选择所需的3D生物印刷图层，并通过选择单个球体位置，在屏幕左侧的地图上绘制所需的3D生物印刷设计。社区法网k“应用”以确认3D生物印刷设计。
点击“针阵检查”开始针阵检查。如果针阵列失焦，则输入值为“OffsetZ（μm）”，范围为0〜500μm，调整摄像机对焦，起始时间为500μm，减少100μm至0μm。
单击“检查参数”，“类型1”，并将“直径（μm）”设置为所需的直径范围。将“圆度（％）”和“平滑度（％）”设置为所需的百分比。点击“应用”确认设置。
注意：这里的球体直径为450μm至550μm。 “圆度（％）”和“平滑度（％）”是计算机计算每个球体的评估。这里，用于“圆度（％）”的设置为60％，“平滑度（％）”为70％。
单击“存在”并将“直径（μm）”更改为相同的设置在上一步。点击“应用”确认设置。
单击“堆叠模式”，然后点击“开始”下的绿色图标，使用3D生物打印机的喷嘴通过真空吸力开始球体拾取，并将球体放置在针阵列中的特定位置。
注意：对于由81个球体（9个球体×9个球体）组成的心脏贴片，3D生物印迹需要约20至30分钟。
生物印刷后，使用无菌镊子，拿起包含3D生物印迹贴片的针阵列，并将其转移到含有150 mL RPMI / B-27细胞培养基的250 mL无菌烧杯中。
使用针阵列孵育3D生物印迹贴片3天（37℃，5％二氧化碳，95％湿度）。

6.从针阵列和贴片成熟中去除3D生物印迹贴片

孵育3天后，用一只手在针阵列的底部，另一只手在塑料盖上他补丁，轻轻地将塑料盖向上滑动以从针阵列中移除3D生物印迹补丁。
注意：根据需要，可以在本步骤之前将磷酸盐缓冲盐水（PBS）润滑施用于针头，以便更平滑和更容易地去除。
使用一对无菌镊子，将3D生物印迹贴片拾起塑料盖，并将贴片和塑料盖转移到含有RPMI / B-27细胞培养基的35 mm培养皿中。
使用RPMI / B-27细胞介质中的贴片轻轻摇动塑料盖，镊子仍贴在塑料盖上，将贴片释放到介质中。
在光学显微镜下检查3D生物印迹贴片可视化是否打败以确保3D生物印迹贴片功能正常。
将三维生物印迹贴片在35毫米的培养皿中孵育3天或更长时间（37℃，5％二氧化碳，95％湿度）。
注意：3天后，球体会熔合在一起，并将孔插入那些针头的补丁不应该再显眼了。

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Representative Results

在步骤4.4（共培养）结束时，每个孔中的细胞应在超低附着96孔U底板的底部聚集，通过重力形成球体。这些球体包含hiPSC-CM，HCF和HUVEC，并且可以在光学显微镜下目视检查，其中它们应该通过二维投影呈现圆形（图1 ）。在步骤6.3结束时，3D生物印迹的心脏贴片应该包含组织空隙，这是由于针阵列产生的针孔（图2左侧）。在这一点上，球体之间的边界应该变得模糊不清，补丁应该已经开始自发地击败，表现出球体的机械整合。在步骤6.5结束时，组织空隙应该被周围的组织填充（图2 ，右），而3D生物印迹的心脏贴片应该继续是自发地。

图1 ：创建混合细胞多细胞球体。将hiPSC-CM，HCF和HUVEC以hiPSC-CM：HCF：HUVEC细胞比为70:15:15混合，将细胞混合物分配到超低附着的96孔U底板中。在24小时内，形成混合细胞多细胞球体（左，右），每孔一个。刻度棒=500μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图2 ：表现出球状体机械整合的心脏组织的形成 。一个3D生物打印心脏贴片后立即从具有可见针孔的针阵列中取出（左）。此时，球体之间的边界已经变得模糊，补丁已经开始自发地跳动，因此球体已经变得机械一体化了。从针阵列中取出三天后，由针阵列引起的组织空隙被周围的组织（右）填充，并且贴片继续自发地跳动。比例尺= 1 mm。请点击此处查看此图的较大版本。

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Disclosures

作者没有什么可以披露的。

Acknowledgments

作者承认以下资金来源：神经科学心血管研究基金和马里兰州干细胞研究基金（2016-MSCRFI-2735）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935