Summary
פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials, באמצעות תאים בלבד. Cardiomyocytes, תאים אנדותל fibroblasts מבודדים הראשון, נספר ומעורב ביחסים התא הרצוי. הם שיתוף תרבותי בארות בודדים נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. תוך 3 ימים, להכות בצורת spheroids. אלה spheroids אז הרימו ידי זרבובית באמצעות יניקה ואקום התאספו על מערך מחט באמצעות bioprinter 3D. את spheroids מותר אז כדי fuse על מחט מערך. שלושה ימים לאחר bioprinting 3D, spheroids מוסרים כתיקון שלם, אשר כבר ספונטני מכות. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.
Introduction
ישנן שיטות רבות ושונות של 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting מסווגת לעתים קרובות על ידי טכנולוגיית הדפסה 1 , עם דוגמאות כגון bioprinting דיו, biocrinting microextrusion, לייזר בסיוע bioprinting, שילוב של שיטות, או גישות חדשות יותר. 3D bioprinting יכול גם להיות מסווגים לתוך ללא פיגומים או שיטות פיגום תלוי 4 . רוב השיטות של bioprinting 3D הם תלויים פיגום, שם יש צורך biomaterials, למשל ביוינקים 5 או פיגומים 6 . עם זאת, תלוי 3D פיגום bioprinting פנים בעיות רבות ומגבלות 4 , 7 , כגון immunogenicity של חומר פיגום, עלות bioinks קניינית, מהירות איטית ורעילות של השפלה מוצרים.
סקאףהנדסת רקמת לב ללא קפל באמצעות spheroids כבר ניסה 8 , עם פוטנציאל להתגבר על החסרונות האלה של הנדסת רקמות תלוי פיגום. עם זאת, כפי שהוכיחו על ידי המחברים באותו נייר, זה היה קשה לטפל בחוזקה מיקום spheroids במקומות קבועים, בתהליך של biofabrication. השימוש המלווה של bioprinting 3D ו הנדסת רקמות מבוסס spheroid יש פוטנציאל להתגבר על קשיים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים bioprinting 3D של רקמת לב ללא biomaterials אחרים, תוך שימוש רק בתאים בצורת spheroids.
פיגומים מבוססי spheroid מבוססי spheroid 3D יש את היכולת להרים spheroids בודדים באמצעות שאיבה ואקום ולמקם אותם על מערך מחט. הרעיון של מיקום spheroids על מערך מחט ב bioprinting 3D, הוא בהשראת השימוש של מערכי מחט (המכונה " קנזאן ") של Japa העתיקהNese, אומנות, סידור פרחים, ikebana. מערכת זו מאפשרת spheroids להיות ממוקם במדויק בכל תצורה ותוצאות הספירואידים הפרט fusion יחד לאורך תקופה קצרה כדי ליצור רקמות bioprinted 3D. שיטה זו מאפשרת spheroids להיות מניפולציה בקלות, עם השלכות פוטנציאליות לעתיד של ביו-אפורציה אורגנית ללא פיגום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Cardiomyocytes
- יצירת ותרבות האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) על 6-גם צלחות מצופה מטריצה במרתף במרתף כמתואר 10 .
- הבדל hiPSCs לתוך cardiomyocytes hiPSC נגזר (hiPSC-CMs) באמצעות שיטות המתוארות לעיל 11 , 12 .
- ביום 19 לאחר הבחנה, לבודד את cardiomyocytes באמצעות 2 מ"ל של טריפסין / EDTA 0.05% בכל טוב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צג cardiomyocytes תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לצפות דיסוציאציה התא.
- לנטרל טריפסין באמצעות 2 מ"ל של מעכב טריפסין 0.0125%.
- בריכת cardiomyocytes מבודדים ולהעביר אותם לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי אחד באמצעות מילוי פיפטה ממונע.
- צנטריפוגה ההשעיה התא עבור 5 דקות ב 250 xg בטמפרטורת החדר להשיג גלולה.
- Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של רוזוול פארקמדיה ממוריאל (RPMI) התקשורת התא בתוספת B-27 (RPMI / B-27 התקשורת התא).
- פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון 0.4% Trypan כחול.
- השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה התא.
2. הכנת פיברובלסטים
- ליזום fibroblast הלב של הלב (HCF) (סוג החדר הבוגר) קו התא 13 .
- המעבר לבודד אותם בהתאם HCF פרוטוקולים culturing 13 .
- פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון טריפאן כחול 0.4%.
- השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה תא חדש.
3. הכנת תאים אנדותל
- ליזום את המטלית האנושיתוריאלי של תא תא אנדותלי (HUVEC) כמתואר 14 . המעבר לבודד אותם בהתאם HUVEC פרוטוקולים culturing כמתואר 14 .
- פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון 0.4% Trypan כחול.
- השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה התא.
4. שיתוף תרבות:
- מערבבים את שלושת סוגי התאים (hiPSC-CM, HCFs ו- HUVECs) בתקשורת RPMI / B-27 כדי ליצור מלאי של תמיסת תאים מעורבים בצינור חרוטי 50 מ"ל, ב- hiPSC-CM: HCF: יחס תא HUVEC של 70:15:15 וריכוז של 165,000 תאים לכל מ"ל.
- להפיץ את הפתרון התא המעורב לתוך מצורף נמוך במיוחד 96-טוב צלחות U- התחתונה ב 200 μL לכל טוב, או 33,000 תאים לכל טוב, באמצעות פיפטה רב ערוצי.
- דגירה צלחות 96-היטב במשך 3 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצניאידיאל, לחות 95%).
- בדיקת נוכחות של ספיראידים תאיים רב תאיים מעורבים במרכז ובתחתית בארות בודדים, תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: בהקרנה מיקרוסקופית דו מימדי, אלה spheroids יופיע עגול בצורת ( איור 1 ). Spheroids צריך טופס בתוך 24 שעות, לאחר זריעת תאים לתוך נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. Spheroids צריך להתחיל להכות בתוך 48 שעות, לאחר זריעת תאים לתוך צלחות 96-היטב. Spheroids שאינם מכות לא צריך לשמש 3D bioprinting כדי להבטיח כי הסופי bioprinted 3D תיקון הלב הוא פונקציונלי. Immunofluorescence של spheroids עבור connexin 43 (Cx43) וטרופונין ניתן להשתמש כדי להעריך הרכב הסלולר spheroid ואיכות 15 .
5. 3D ביופרינטינג של רקמות ללא קרם רקמות
- טען את הצלחות המכילות את spheroids לתוך מגזינים של bioprinter ללא פיגום 3D מבוסס פיגום.
- הפעל את bioprinter 3D ולבצע את התוכנה bioprinting 3D.
- לחץ על "עזר", "מבצע הכנה", "בדיקת מצב", ולאחר מכן "דף הבית לחזור".
- לחץ על הסמל הירוק תחת "התחל" כדי להתחיל בדיקה spheroid.
- צפה בקטעי spheroid להופיע מתחת לעמודה "(2) Dia (מיקרומטר)" על המסך.
- כדי להעריך את קוטר spheroid הממוצע של 100 מיקרומטר הקרוב, לחץ על "הגדרות ראשוניות" והזן את קוטר spheroid הממוצע לתוך המגרש Z ערמה (מיקרומטר).
- לחץ על "סה"כ", המספר תחת "שכבות" צריך להתאים באופן אוטומטי. לחץ על "החל" כדי לאשר את ההגדרות.
- לחץ על "מפת מערך מחט", עבור "שכבה לא", בחר את השכבה הרצויה עבור bioprinting 3D, ולצייר את העיצוב bioprintinting 3D הרצוי על המפה בצד שמאל של המסך על ידי בחירת עמדות ספרואיד בודדים. קלישK "החל" כדי לאשר את העיצוב bioprinting 3D.
- לחץ על "מחט מערך בדוק" כדי להתחיל בדיקת מערך המחט. אם מערך המחט הוא מתוך המוקד, ערכי קלט לתוך "OffsetZ (מיקרומטר)", החל מ 0 עד 500 מיקרומטר כדי להתאים את המיקוד המצלמה, החל עם 500 מיקרומטר ירידה של 100 מיקרומטר עד 0 מיקרומטר.
- לחץ על "פרמטרים ביקורת", "סוג 1", ולהגדיר "קוטר (מיקרומטר)" אל טווח קוטר הרצוי. הגדר "סיבוב (%)" ו "חלקות (%)" לאחוזים הרצוי. לחץ על "החל" כדי לאשר את ההגדרות.
הערה: כאן בקוטר spheroid נקבעו מ 450 מיקרומטר עד 550 מיקרומטר. "סיבוב (%)" ו "חלקות (%)" הם מחשב מחושב הערכה של כל הספרואיד הפרט. כאן, ההגדרות המשמשות "עגול (%)" הוא 60% ו "חלקות (%)" הוא 70%. - לחץ על "נוכחות" ועדכן את "קוטר (מיקרומטר)" לאותה הגדרהS בשלב הקודם. לחץ על "החל" כדי לאשר את ההגדרות.
- לחץ על "מצב מחסנית", ולאחר מכן את הסמל הירוק תחת "התחל" כדי להתחיל spheroid להרים באמצעות הזרבובית של bioprinter 3D על ידי שאיבת ואקום, ואת המיקום של spheroids במקומות ספציפיים במערך מחט.
הערה: עבור תיקון לב המורכב 81 spheroids (9 spheroids x 9 spheroids), 3D bioprinting צריך לקחת על 20 עד 30 דקות. - לאחר bioprinting, באמצעות מלקחיים סטרילית, להרים את מחט מערך המכיל את התיקון bioprinted 3D ולהעביר אותו לתוך כוס מ"ל סטרילי 250 מ"ל המכיל 150 מ"ל של RPMI / B-27 התקשורת התא.
- דגירה תיקון 3D bioprinted עם מערך מחט במשך 3 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, לחות 95%).
6. הסרת תיקון 3D Bioprinted ממערך מחט תיקון התבגרות
- לאחר 3 ימים של הדגירה, עם יד אחת בבסיס מערך המחט והשני על כיסוי פלסטיק תחת tהוא תיקון, בעדינות להחליק את כיסוי הפלסטיק כלפי מעלה כדי להסיר את תיקון 3D bioprinted ממערך המחט.
הערה: סיכה עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) ניתן להחיל על המחטים רק לפני שלב זה, לפי הצורך, להסרה חלקה וקלה יותר. - באמצעות זוג מלקחיים סטרילית, להרים את כיסוי פלסטיק עם תיקון bioprinted 3D על גבי זה ולהעביר את התיקון ואת כיסוי פלסטיק לתוך צלחת 35 מ"מ המכיל RPMI / B-27 התקשורת התא.
- נער בעדינות את כיסוי הפלסטיק עם המדבקה בתקשורת ה - RPMI / B-27, עם המלקחיים המחזיקים עדיין בכיסוי הפלסטיק, כדי לשחרר את התיקון לתקשורת.
- בדוק את התיקון bioprinted 3D תחת מיקרוסקופ אור לדמיין אם זה מכות על מנת להבטיח כי תיקון bioprinted 3D הוא פונקציונלי.
- דגירה תיקון 3D bioprinted בצלחת 35 מ"מ במשך 3 ימים או יותר (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, לחות 95%).
הערה: לאחר 3 ימים, spheroids להתמזג יחד את החורים באת הטלאי, שבו היו המחטים, כבר לא יהיה גלוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בסוף שלב 4.4 (שיתוף תרבות), התאים בכל טוב צריך צבירה בתחתית של מצורף נמוך במיוחד 96-טוב U-bottom צלחות כדי ליצור spheroids על ידי כוח הכבידה. אלה spheroids להכיל hiPSC-CM, HCFs, ו HUVECs, והוא יכול להיות בחן ויזואלית תחת מיקרוסקופ אור, שם הם צריכים להופיע מעגלית על ידי היטל דו מימדי ( איור 1 ). בסוף שלב 6.3, תיקון לב bioprinted 3D צריך להכיל חללים ברקמה, בשל חורים מחט שנוצרו על ידי מערך המחט ( איור 2 , משמאל). בשלב זה, גבולות בין spheroids צריך להיות מעורפל ואת הטלאי צריך להתחיל להכות באופן ספונטני, המציג שילוב מכני של spheroids. בסוף שלב 6.5, חללים רקמות צריך להיות מלא על ידי הרקמה הסובבת ( איור 2 , מימין), בעוד תיקון 3D bioprinted הלב צריך להמשיך להיותלא באופן ספונטני.
איור 1 : יצירת spheroids תאיים תאיים מעורבים. HiPSC-CM, HCFs ו- HUVECs היו מעורבים ב- hiPSC-CM: HCF: יחס תא HUVEC של 70:15:15, ותערובת התאים חולקה לקרני U-bottom נמוכים במיוחד. בתוך 24 שעות, ספיראידים תאיים רב-תאיים מעורבים (משמאל, מימין) נוצרו, אחד בכל באר. סולם בר = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : יצירת רקמת לב המציגה שילוב מכני של ספרואידים . ביו 3Dמודפס תיקון הלב מיד לאחר הסרת מערך המחט עם חורים המחט גלוי (משמאל). בשלב זה, הגבולות בין הספרואידים כבר לא היו ברורים, והכתם כבר החל לפעום באופן ספונטני, כך שהספרואידים השתלבו באופן מכני. שלושה ימים לאחר הסרת מערך המחטים, חללי הרקמות הנגרמים על ידי מערך המחט נמלאו על ידי הרקמה הסובבת (מימין), ואת התיקון המשיך להכות באופן ספונטני. סולם בר = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מאשרים את מקורות המימון הבאים: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research ו- Maryland Stem Cell Research Research (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
