Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll Anti - Pilz - Aktivität von primären humanen Immunzellen in Echtzeit zu bewerten unter Verwendung von fluoreszierendem Aspergillus Reportern Konidien in Verbindung mit Live-Zell - Videomikroskopie und Durchflusszytometrie. Erzeugten Daten geben einen Einblick in die Wirts zell- Aspergillus Wechselwirkungen wie fungizide Aktivität, Phagozytose, Zellmigration und Hemmung des Pilzwachstums.
Abstract
Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Pilz Erreger invasive Infektionen bei immunsupprimierten Patienten mit einer hohen Letalität. Forschung untersucht immunologische Reaktionen gegen A. fumigatus wird durch den Mangel an einheitlichen und zuverlässigen Tests zur Messung der Anti - Pilz - Aktivität von Immunzellen in vitro beschränkt. Ein neues Verfahren wird beschrieben , um die antimykotische Aktivität von primären Monozyten und Neutrophilen von menschlichen Spendern gegen A. fumigatus unter Verwendung fluoreszierender Aspergillus REPORTER (FLARE) Conidien zu beurteilen. Diese Konidien enthalten eine genetisch dsRed Reportergen codiert wird , die konstitutiv von lebenden FLARE Konidien exprimiert wird, und extern mit Alexa Fluor 633 markiert ist, die zu einer Verschlechterung im Phagolysosom resistent ist, so dass eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten A. fumigatus Konidien ermöglicht. Video-Mikroskopie und Zytometrie werden fließen anschließend verwendet, um die interact zu visualisierenion zwischen Konidien und angeborenen Immunzellen, der Beurteilung fungizide Aktivität, während auch eine Fülle von Informationen über Phagozyten Migration, Phagozytose und die Hemmung des Pilzwachstums bereitstellt. Diese neue Technik hat bereits spannende neue Einblicke in die Wirt-Pathogen - Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zur Verfügung gestellt. Es ist wichtig, den Laboraufbau beachten erforderlich, um diesen Test durchzuführen, die notwendige Mikroskopie einschließlich und Durchflusszytometrie-Einrichtungen und die Fähigkeit, mit menschlichem Spenderblut zu arbeiten und genetisch manipulierten Pilzen. Dieser Test ist jedoch in der Lage, große Datenmengen zu erzeugen und detaillierte Einblicke in die antimykotische Reaktion offenbart. Dieses Protokoll wird erfolgreich verwendet worden , um die Wirt-Pathogen - Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zu studieren.
Es ist wichtig, den Laboraufbau beachten erforderlich, um diesen Test durchzuführen, einschließlich der notwendigen Mikroskopie und Durchflusszytometrie finrichtungen, und die Fähigkeit, die menschlichen Spenderblutes zu arbeiten und genetisch manipulierten Pilze. Dieser Test ist jedoch in der Lage, große Datenmengen zu erzeugen und detaillierte Einblicke in die antimykotische Reaktion offenbart. Dieses Protokoll wird erfolgreich verwendet worden , um die Wirt-Pathogen - Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zu studieren.
Introduction
Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Pilzpathogens und die häufigste Pilz Ursache für invasive Lungeninfektionen bei immungeschwächten Wirt 1, 2. Zu verstehen , wie Host - Immunzellen erkennen und beseitigen Aspergillus ein wichtiger Bereich der Pilzforschung hat jedoch das derzeit verfügbare fungizide Assays erhebliche Einschränkungen. Colorimetrischen Assays und die Bestimmung der koloniebildenden Einheiten 3, 4 üblicherweise verwendete Methoden umfassen fungizide Aktivität zu messen. Allerdings bieten solche Methoden Informationen über Pilz-Lebensfähigkeit an einem einzigen Zeitpunkt, anstatt die dynamische Interaktion zwischen Wirt und Pathogen sehen. Dementsprechend können diese Verfahren nicht berücksichtigt, ob ein Pilz getötet wurde oder einfach (vorübergehend) beschränkt in Wachstum oder metabolische Aktivität. Wir haben ein Verfahren in der Lage zu beobachten fungici entwickeltdal-Aktivität direkt und gleichzeitig detaillierte Informationen in Bezug auf die Phagozytose, Phagozyten Migration und Hemmung des Pilzwachstums zu erfassen.
Zuvor wurde ein Protokoll Echtzeit - Bildgebung als Mittel unter Verwendung veröffentlichten 5 Phagozytose von Candida albicans durch eine Maus - Makrophagen - Zelllinie zu messen. Dieses Konzept wurde nun weiterentwickelt , die Wissenslücke in unserem Verständnis von Aspergillus Interaktionen mit Immunzellen zu adressieren , indem fluoreszierenden Aspergillus reporter (FLARE) Konidien 6, 7, 8 verwendet. Diese Konidien exprimieren einen roten Fluorophor (dsRed) und mit einem zweiten Fluorophor (Alexa Fluor 633) markiert. Sobald ein FLARE Konidie getötet wird, stoppt es produziert dsRed und die restlichen dsRed schwindet, während die AF633 an die Konidien Leuchtstoff- und gebunden bleibt. Dadurch entsteht eine klare Unterscheidung zwischen lebenden und toten fungal Zellen während der Live Cell Imaging und Durchflusszytometrie und ermöglicht Verfolgung des Schicksals der einzelnen Konidien nach ihrer Wechselwirkung mit Immunzellen.
Die beschriebenen Assays stellen ein effektives Verfahren der Interaktion zwischen Wirt und Immunzellen Aspergillus Visualisierung und wird in entwirren die zelluläre Signalwege , die für antimykotische Effektormechanismen in angeborenen Immunzellen von beträchtlichem Wert sein. Andere Anwendungen umfassen die Visualisierung , wie Veränderungen in Aspergillus Wachstum, wie zum Beispiel der Umstellung von geschwollenen Konidien ruhen oder von geschwollenen Konidien zu Hyphen, Phagozyten Anerkennung und Funktion beeinflussen.
Das folgende Protokoll beschreibt detailliert, wie menschliche Monozyten und Neutrophilen zu erhalten; wie die FLARE Konidien vorzubereiten; und wie ihre Antworten mit Videomikroskopie zu erfassen und Durchflusszytometrie. Obwohl die Verwendung von menschlichen Immun aus Spenderblut isolierten Zellen wird hier beschrieben, dieseTechnik hat sich ebenso bewährt eine Vielzahl von Maus-Zellpopulationen verwendet wird.
Protocol
Das Protokoll für 9 basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden Neutrophilen und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) zu erhalten. Die Verwendung von Blutproben von gesunden Freiwilligen wird durch die menschliche Forschungsethikkommission der Universität von Aberdeen genehmigt. sicherzustellen, dass alle ethischen Genehmigungen sind an Ort und Stelle für die Erstellung Blut von gesunden Probanden und / oder Patienten zum Zweck des beschriebenen Experiments vor dem Start. Halten Sie Zellen auf Eis, wo möglich, um ihr Überleben zu erhöhen.
1. A. fumigatus , Kultur und Bedingungen
- Bereiten Glukose Minimalagarmedium als 10 beschrieben.
- Justieren Medien auf pH 6,5 unter Verwendung von 1 M NaOH und Autoklaven bei 120 ° C für 20 min.
- Lassen Sie auf 65 ° C abkühlen lassen.
- Arbeiten in einem Sterilströmungshaube, gieße 30 ml gekühltem Medien in einen T75-Kolben gegeben und ermöglichen, mit dem Hals des Kolbens ruht auf einer 25 ml Pipette C abkühleneine agar Steigung reate.
- Streak aus dem dsRed Af293- A. fumigatus - Stamm auf dem Agar und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C + 5% CO 2. Zwei Kolben werden Ausbeute etwa 10 9 Konidien in 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pre-Biotinylierung.
2. A. fumigatus Kennzeichnung und Vorbereitung
Hinweis: Wenn dieses Assays zum ersten Mal durchgeführt wird , bereitet den parentalen Af293- A. fumigatus - Stamm. Nehmen Proben beiden Stämme in Mikrozentrifugenröhrchen und Etikett nur eine von jedem Stamm, wie unten beschrieben. Dies ermöglicht eine Kontrolle Konidien ohne Farbe und Konidien mit einer einzigen Farbe zu haben, entweder dsRed oder AF633, die Einrichtung und Ausrüstung zu testen.
- Ernte A. fumigatus Konidien durch Eintauchen der Kultur mit 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Filtriere die sich ergebende Suspension durch ein 40 & mgr; m Zellsieb in ein 50 ml-Röhrchen Hyphenfragmente zu entfernen.
- Centrifuge bei 805 × g für 10 min, entfernen Sie den Überstand und wasche einmal in 20 ml sterilem PBS. Pool Konidien von zwei Platten des gleichen Stamms während des Waschschrittes.
- Nach dem Waschschritt wird das Pellet in 5 ml PBS und 1 ml Aliquots Übertragung von Konidiensuspension in Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der Suspension von jedem Stamm ist in der Regel ausreichend für die Abbildung lebender Zellen. Wickeln der verbleibenden Aliquots in Folie und lagere bei 4 ° C.
- Zentrifuge Aliquoten Konidiensuspension bei 9.300 xg für 10 min bei Raumtemperatur und sorgfältig entfernen Überstand. Resuspendieren Konidien Pellet in 1 ml 0,05 M NaHCO 3 pH 8,3.
- Herstellung von 10 mg Biotin / 200 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) Stammlösung wird durch Rekonstitution 25 mg Biotin in 500 ul DMSO. Zugabe von 10 & mgr; l Biotin / DMSO Stammlösung zu den Mikrozentrifugenröhrchen, Abdeckung in Aluminiumfolie und Inkubation für 2 h auf einem Schüttler bei 4 ° C.
- Aliquot den Rest des Biotin / DMSO Lager solution und frieren bei -20 ° C für die Verwendung in nachfolgenden Experimenten.
- Zentrifuge für 10 min bei 9.300 xg und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Konidien Pellet in 1 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,0 für 1 h freischwebenden Biotin zu deaktivieren.
- Zentrifuge für 10 min bei 9.300 xg und den Überstand vorsichtig entfernen. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 1 ml sterilem PBS gewaschen und das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert.
- Man löst 1 mg Streptavidin-AF633 in 0,5 ml PBS eine 2 mg / ml Stammlösung herzustellen. Zugabe von 10 ul 2 mg / ml Streptavidin-AF633 pro 1 ml Konidiensuspension und Inkubieren auf einem Schüttler für 40 min bei Raumtemperatur in Aluminiumfolie abgedeckt. Die verbleibende Streptavidin-AF633 kann für die Verwendung in nachfolgenden Experimenten in Aliquots eingefroren werden.
- Zentrifuge für 10 min bei 9.300 xg und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Resuspendieren Konidien Pellet in 1 ml PBS und die Konidien eines Hämozytometers zählen bei einer 1: 1.000-Verdünnung (1: 100 und 1:10). Stellen Sie die Konidien Konzentration auf 3,6 x 10 6 / ml mit CO 2 unabhängige Medien, wickelt in der Folie und bei 4 ° C.
HINWEIS: Die Konidien sind nun mit AF633 markiert und wird als FLARE Konidien bezeichnet werden. - Optional: Wenn die Stimulation mit geschwollenen Konidien erforderlich ist, nach den Konidien (Schritt 2,9) zu zählen, verdünnte Konidien bis 7,2 x 10 6 / ml in Hefe - Stickstoff - Basis (YNB) Medium und 500 & mgr; l Konidiensuspension auf 4,5 ml YNB - Medium in einem 50 autoklaviert fügt ml Erlenmeyerkolben. Abdecken und der Kolben wird in einem Schüttelinkubator (200 UpM bei 37 ° C) für 6 Stunden.
- Übertragen, um das Medium in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifuge bei 805 × g für 10 min bei Raumtemperatur und einmal in PBS waschen. Zentrifuge wieder und Pellet in 1 ml CO 2 unabhängige Medium, was 3,6 x 10 6 Konidien / ml.
Hinweis: Die Konidien oft verklumpen , nachdem sie schwellen an, um genaue Zählen schwierig, es wird empfohlen , mit dem c zu berechnenounted Zahlen von Conidien verwendet ruht.
- Übertragen, um das Medium in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifuge bei 805 × g für 10 min bei Raumtemperatur und einmal in PBS waschen. Zentrifuge wieder und Pellet in 1 ml CO 2 unabhängige Medium, was 3,6 x 10 6 Konidien / ml.
3. Isolierung von Human-Neutrophilen und Monozyten
- Zeichne 20 ml venöses Blut von gesunden Freiwilligen in zwei 10 ml Blutröhrchen, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Für jeden Spender getrennt, gieße 20 ml Blut in ein 50 ml Röhrchen und verdünnt mit 15 ml PBS.
- Unterlags das Blut mit 15 ml einer Lymphozytenisolationslösung (Dichte 1,077 g / ml) mit einer Spritze und Nadel Eisen. Platzieren Sie die Nadel am Boden des Röhrchens und sanft die Lymphozytenisolationslösung herauszudrücken. Zentrifuge bei 630 × g für 20 min ohne Bremse und niedrige Beschleunigung.
- Bereiten PBS, auf Eis gekühlt.
Hinweis: Die Schritte 3.4 und 3.5 müssen gleichzeitig verfolgt werden Monozyten (3.4) und Neutrophile (3,5) zu erzeugen. - Mit Hilfe eines pastette, ernten die PBMC Schicht. Dies ist die Schicht, in der Mitte zwischen dem gelben Serum (oben) und der transparenten Isolationslymphozytenlösung (unterer) Schicht, undTransfer in ein frisches 50-ml-Röhrchen.
- Füllen des Röhrchens mit der PBMC von bis zu 50 ml mit kaltem PBS und Zentrifugation bei 582 × g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und wäscht zweimal mit kaltem PBS und Resuspendieren in 1 ml PBS pro 20 ml Spenderblut verwendet, zunächst.
- Machen 01.10 Verdünnungen für das Zählen durch Zugabe von 20 & mgr; l der Zellsuspension zu 160 ul PBS und 20 ul Trypanblau. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer.
- Vorbereiten einer Pufferlösung durch Zugabe von 26 ml hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) und 2,1 ml 0,5 M EDTA auf 500 ml HBSS. Zentrifugieren der Zellen für 10 min bei 515 xg und Resuspendieren in 40 ul Pufferlösung pro 1 x 10 7 Zellen.
- Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml - Röhrchen und füge 10 ul CD14 Microbeads pro 1 x 10 7 Zellen, gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C, um sicherzustellen , die Rohre alle 5 min zu mischen.
- Wasche die Zellen durch Zugabe von 1 ml Pufferlösung pro 1 × 10 7 Zellen und centrifuge bei 515 xg für 10 min.
- Aspirat Überstand vollständig und resuspendieren bis zu 1 x 10 8 Zellen in 500 ul Pufferlösung.
- Platzieren 1 Spalte pro Probe auf einem Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zuerst waschen Sie die Säule einmal mit 500 & mgr; l Pufferlösung.
- Pipette, um die 500 & mgr; l der Zellsuspension durch die Säule, warten Sie auf die Säule, um zu trocknen und dann waschen durch Wiederholen dieses dreimal mit Pufferlösung.
- Ein neues 15-ml-Röhrchen unter der Säule und nehmen die Säule aus dem Magnetabscheider. spült dann die Zellen aus der Säule in das Röhrchen mit 1 ml Pufferlösung.
- 4 ml Pufferlösung und Zentrifugieren bei 515 xg für 10 min und dann Resuspendieren in 1 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium.
- Machen 01.10 Verdünnungen für das Zählen durch Zugabe von 20 & mgr; l der Zellsuspension zu 160 ul PBS und 20 ul Trypanblau. Zählen der Zellen mit einemHämozytometer.
- Stellen Sie die Zellkonzentration auf 6 x 10 5 / ml mit RPMI und 200 ul auf einem 35 mm Glasbasis Abbildungs dish Samens. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren , mit 5% CO 2.
- Am nächsten Tag, vor der Bilderzeugung, entfernen Sie das RPMI und 200 & mgr; l Medium unabhängig CO 2 hinzuzufügen.
Hinweis: Diese Monozyten können auch in verschiedene Untergruppen Makrophagen vor der Bildgebung zu unterscheiden. Wenn dies eine Technik erforscht wird, ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt die jüngste Arbeit von Ohradanova-Repic et al. 1 1.
- Nach der PBMC Schicht Ernte, entfernen Sie alle aus dem Serum und den größten Teil der Lymphozyten-Isolationslösung, aber darauf achten, nicht die kleinen weißen Band auf dem roten Pellet zu entfernen, wie dies die meisten der Neutrophilen enthalten wird.
- Vorbereiten eines 10x hypotonen Lysepuffers Lager durch Zugabe von 83 g NH 4 Cl und 10 g KHCO 3 in 1 l sterilem Wasser. Lagerung bei 4 °C.
- Verdünnte dieses Lager 10x mit sterilem Wasser und gibt es an die Rohre. Dann vorsichtig 3 mal umdrehen und 15 min in Eis inkubiert.
- Zentrifuge bei 394 × g für 10 min und resuspendieren in hypotonischen Lysepuffer für 10 min in Eis.
- Zentrifuge bei 394 × g und wäscht zweimal mit kaltem PBS. Resuspendieren in 1 ml CO 2 unabhängigen Medium pro Spender.
- Machen 01.10 Verdünnungen für das Zählen durch Zugabe von 20 & mgr; l der Zellsuspension zu 160 ul PBS und 20 ul Trypanblau. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Für die Durchflusszytometrie, passen um die Konzentration auf 6 x 10 5 / ml , und auf eine Platte mit 24 Vertiefungen 400 & mgr; l Zellsuspension hinzu. Für die Mikroskopie, mit 200 ul der gleichen Zellsuspension auf eine 35 mm Glasbasis Abbildungs Schale.
Hinweis: Neutrophile Bildgebung oder Durchflusszytometrie sofort eingeleitet werden soll , aufgrund ihrer Neigung , die Apoptose zu unterziehen , wenn nicht stimuliert gelassen. Wenn dies nicht möglich ist, sollte Neutrophilen auf haltenEis und so schnell wie möglich (am selben Tag) verwendet.
4. Durchflusszytometrie
- Füge 200 & mgr; l von 1,2 x 10 6 / ml FLARE Konidien zu den Zellen in 24-Well - Platte, und fügen Sie dann 100 ul von 20 ug / ml Voriconazol. Fügen 300 ul RPMI und Inkubation für 16 h bei 37 ° C mit 5% CO 2.
HINWEIS: Voriconazol wird hinzugefügt konidiale Keimung zu verhindern. - Zugabe von 25 & mgr; l einer 1 mM Calcofluor-white - Stammlösung in jede Vertiefung für eine Endkonzentration von 25 & mgr; M und Inkubation für 10 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Zentrifuge bei 582 × g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und wasche zweimal mit PBS.
- Zur Ernte adhärente Zellen (Monozyten), 1 ml von PBS mit 3 mM EDTA zu jeder Vertiefung und Inkubation für 10 min bei 37 ° C mit 5% CO 2. Zellen sanft wasche die Platte durch Abpipettieren und Zellen in ein Röhrchen sammeln.
- Wasche einmal in FACS-Puffer (2% fötalem Kälberserum zu PBS), und dann in FACS-Puffer für die FACS-Analyse resuspendieren.
- Für die FACS-Analyse zunächst die Kompensationsparameter des Durchflusszytometers justieren und positive Gattern einfarbige Kompensationsrohre verwenden, einschließlich Konidien eingestellt ohne Farbe: dsRed + Konidien, AF633 + Konidien und Calcofluor White + Konidien (erzeugt, wie in 4.2).
- Befreit Konidien Gate basiert auf Vorwärts- und Seitenstreuung mit Konidien ohne Farbe. Stellen Sie Zell-Gate auf Vorwärts- und Seitenstreuung durch das freie Konidien Tor auszuschließen.
- Analysieren Probenröhrchen von 10.000 Ereignisse aufgezeichnet werden.
Hinweis: Zellen mit Live-Konidien zugeordnet werden + und AF633 + dsRed werden. Zellen mit toten Konidien verbunden sind, werden nur AF633 + sein. Bystander-Zellen, die Sporen nicht beschäftigt haben, werden dsRed- und AF633- sein. Die Konidien-Eingriff-Zellpopulationen sind weiter für Calcofluorwhite Färbung auf dem Pacific Blue Kanal analysiert. Konidien, die außerhalb der Zellen bleiben Calcofluorwhite + und Konidien, die verinnerlicht haben wirdCalcofluor White-.
5. Live Cell Videomikroskopie
Anmerkung: Die Wahl des Mikroskops auf hängt, was lokal verfügbar ist, aber der Mikroskopaufbau benötigt eine invertierte Phase umfassen, eine Klimakammer erhitzt auf 37 ° C und eine geeigneten Anregungs- / Emissionsfilter für dsRed (532/561 nm) und AF633 (633 nm). FLARE Konidien arbeiten nicht mit dem 488-nm-Laser anstelle des 532/561-nm-Laser für dsRed. Wenn sie für dieses erste Mal dieses Experiment durchzuführen, verwenden Sie die Steuer Konidien ohne Farbe und einfarbigen für Hintergrundfluoreszenz zu testen und Durchbluten zwischen den dsRed und AF633 Kanälen.
- Einschalten des Mikroskops Erhitzer vor dem Experiment und ausreichend Zeit für die Umgebungssteuerkammer auf 37 ° C zu erwärmen. Die Zeit für die Kammertemperatur zu stabilisieren genommen werden für die verschiedenen Mikroskopaufbauten variieren.
- Schalten Sie das Mikroskop und Computer, und loAnzeige der Bildbearbeitungssoftware. Montieren Sie die Imaging-Schale auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus der menschlichen Neutrophilen oder Monozyten zu finden.
- Für dsRed und AF633, stellte die Laserleistung auf 10% und die Belichtungszeit auf 1 s in den Erfassungseinstellungen.
- Entfernen des Abbildungsschiebers und mit 100 ul 3 x 10 6 / ml FLARE Konidiensuspension in den entsprechenden Vertiefungen (Gesamtvolumen 300 & mgr; l / Well). Notieren Sie sich die Zeit, die Konidien FLARE werden in die Schale gegeben.
- Bringen Sie den Schieber auf die Bühne und stellen Sie die Empfindlichkeit der Kamera für dsRed und AF633 zu deutlich die Konidien zu sehen, aber nicht das Bild überbelichten. Legen Sie eine Stufe Punkteliste, wenn Mehrpunkterfassung erforderlich ist.
- Abbilden beginnen, wenn alle Punkte im Fokus sind, werden die Kanäle optimiert und die Zykluszeit und Dauer eingestellt. Zykluszeit und Dauer der Bildgebung hängt von der experimentellen Frage. Das Ziel ist es, die Zykluszeit so kurz wie möglich (≤2 min) zu halten, mit 1 min so dass für eingehende Analyse von UPTake Dynamik.
Representative Results
Repräsentative Ergebnisse sind nach dem beschriebenen Protokoll gezeigt. 1 stellt ein repräsentatives 6 h Lebendzell - Video mit menschlichen Neutrophilen und FLARE Konidien. dsRed (rot) wird durch die Konidien selbst ausgedrückt, während sie mit AF633 (Magenta) markiert wurden.
2 ist ein Bild von einem einzigen Zeitpunkt aus einem ähnlichen Film , wie in Abbildung 1 dargestellt ist , welche die Differenz zwischen lebenden und toten FLARE Konidien. Tote Konidien sind aus lebenden Konidien unterscheiden sich durch ihre dsRed (rot) Signal zu verlieren, während eine helle AF633 (magenta) Fluoreszenz beibehalten wird. A. fumigatus Konidien überleben oft innerhalb von Phagozyten für mehr als 6 Stunden. Daher zu quantifizieren wirksam töten, Durchflusszytometrie Plots für ein 16 h Inkubationsdauer in Abbildung 3 dargestellt ist. Diese Daten wurden mit einem Alveolarmakrophage ce erhaltenll Linie als Beispiel, sondern kann mit einem beliebigen Zelltyp durchgeführt werden. In Abbildung 4 ist die Migration in der ersten Stunde der Stimulation für die menschlichen Neutrophilen sowie deren Geschwindigkeit und die Richtungsbewegung gezeigt. Abbildung 5 zeigt den Prozentsatz der Neutrophilen und Monozyten , die mit 1 eingenommen haben, 2, 3 oder mehr Konidien während Abbildung 6 zeigt die Anzahl der Konidien , Hyphen, die in keimen.
Abbildung 1: Live Zelle Videomikroskopie Film von menschlichen Neutrophilen und FLARE Konidien. 3 ist: Neutrophile wurden aus menschlichem Blut und besät mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1 isoliert. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 h erfasst. Maßstabsbalken = 10 um.A in Video gezoomt wird mit den Kanälen gezeigt getrennt, um die Rolle des FLARE Konidien mit DIC in der oberen linken zu klären, dsRed (rot) in der oberen rechten, AF633 (grün) in der unteren linken und der fusionierten Video in der unteren rechten . Bitte klicken Sie hier das Video zum Download bereit .
Abbildung 2: Einzelzeitpunkt Bild den Unterschied zwischen lebenden und toten FLARE Konidien demonstriert. Humane Neutrophile wurden mit Konidien FLARE stimuliert und mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop abgebildet wird. Ein Bild wurde aus den erzeugten Filmen genommen. Tote Konidien aus Hyphen zeichnen sich durch ihre dsRed (rot: rechts oben) verloren Signal, während ihre AF633 Fluoreszenz (grün: unten links) beibehalten wird. Bitte klicken Sie hier , um die sieht eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Quantifizierung und Validierung von Phagozytose und Abtötung von A. fumigatus Konidien. für 16 h in Gegenwart von Voriconazol: 1-Verhältnis Maus Alveolarmakrophagenzellen (MH-S) wurde mit Konidien FLARE bei einem 1 inkubiert. MH-S-Zellen, die mit lebenden Konidien werden in dem roten Tor (dsRed + AF633 +) gezeigt. MH-S-Zellen, die mit toten Konidien sind in dem blauen Tor (dsRed-AF633 +) gezeigt. Bystander MH-S-Zellen sind in dem Gold-Gate gezeigt. Calcofluor White, ein zellundurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff, der an die Pilzzellwand bindet, verwendet wird extrazellulärem Konidien (Calcofluor White +) aus intrazellulären Konidien (Calcofluor White-) zu unterscheiden. Als eine zusätzliche Validierung der Methode ist es, dass die Behandlung mit 2 uM Cytochalasin D hemmt Konidien Aufnahme durch MH-S-Zellen gezeigt.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Migration von menschlichen Neutrophilen und Monozyten gegen A. fumigatus Konidien. 3 ist: Neutrophile wurden aus menschlichem Blut und besät mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1 isoliert. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 Stunden eingefangen. Migration aller einzelnen humanen Neutrophilen pro Feld Tracked wurde mit manuell Tracking - Software gegen ruhende (A) und geschwollene (B) Konidien für 1 h. Daten für 1-Rahmen von Zellen für jede Bedingung des gleichen Spenders. Der mäandernde Faktor (C), ein Maß für directional - Bewegung, und der Geschwindigkeit (D) wurden dann quantifiziert die gleiche Software. Mittelwert ± SEM für 3 Spender mit 30 Zellen pro Spender über 2 unabhängige Experimente dargestellt sind. *: P <0,05 (Welcher korrigiert t-Test). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Die Phagozytose von A. fumigatus Konidien durch menschliche Neutrophile und Monozyten. Neutrophile und Monozyten wurden aus menschlichem Blut isoliert und ausgesät zusammen mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1: 3. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 h erfasst. Die Phagozytose wurde als die Menge von Zellen enthalten, gemessening FLARE Konidien nach 4 h Stimulation. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 3 Spendern präsentiert und 3 Frames pro Spender über 2 unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Hemmung der Keimung von A. fumigatus Konidien von Neutrophilen und Monozyten. Neutrophile und Monozyten wurden aus menschlichem Blut isoliert und ausgesät zusammen mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1: 3. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 Stunden eingefangen. Die Hemmung der Pilz Keimung wurde durch Messung der Prozentsatz der Konidien untersucht, die Keim hatteinated nach 2, 4 und 6 h der Co-Kultur. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 3 Spendern präsentiert und 3 Frames pro Spender über 2 unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Diese Methode beschreibt ein innovatives Verfahren in vitro die antimykotische Aktivität von humanen primären Phagozyten gegen A. fumigatus unter Verwendung fluoreszierender Aspergillus REPORTER (FLARE) Konidien, lebender Zellen und Durchflusszytometrie zu studieren. Frühere Studien haben den zusätzlichen Nutzen der Verwendung von FLARE Konidien sowohl in vivo in murine experimentelle Pilzinfektion und in vitro - Bewertung der antifungalen Immunität 6, 7 gezeigt. FLARE Konidien mit dieser nächsten Generation lebenden Zellen Bildgebungstechnik der Kombination ermöglicht ein Setup - Lebensfähigkeit einzelner Konidien während der dynamischen Interaktionen in vitro zu messen.
Das beschriebene Verfahren hat das Potential, die spezifischen Aufgaben und Bedeutung bestimmter zellulärer Prozesse der Immunzellen auf ihren Anti-Pilz-Reaktionen zu untersuchen. Darüber hinaus Anti-Pilz-Antworten von Phagozyten von bestimmten Patienten, die andefiniert einzelne Komponentenfehler in ihrem Immunsystem genauer beurteilt werden. Schon sehr früh und erste Anti-Pilz-Antworten können sehr detailliert über 6 h der kontinuierlichen Bildgebung untersucht werden. Dies ermöglicht auch feine Unterschiede 12 erfasst wird , wie beispielsweise die Geschwindigkeit von Phagozyten Migration in Richtung des Pilzes, Internalisierung Raten, Dynamik von fungiziden Ereignisse werden, die ununterscheidbar mit Verfahren herkömmlicher Phagozytose wäre.
Jeder Zelltyp kann mit diesem Verfahren verwendet werden; die Zelltypen hier verwendet wurden ausgewählt , weil diese Phagozyten die erste und die zweite Linie der Verteidigung in den menschlichen Atemwege gegen A. fumigatus 13 bilden. Interessanterweise sehr deutliche Unterschiede zwischen, wie Monozyten und Neutrophilen Eingriff mit Rast- und geschwollen Konidien und Hyphen beobachtet werden. Monozyten wandern kaum zu Konidien, während Neutrophilen viel mehr wandernde Aktivität. Zusätzliche Fluoreszenz markers wie auf Immunzellen Live-dead - Marker können in dem Test aufgenommen werden Einblicke in die Phagozyten Überleben mit Aspergillus folgenden Wechselwirkungen zu liefern. Interessante mögliche zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind die Co-Kultur von verschiedenen Wirtszelltypen, die Folgen für die Anti - Pilz - Reaktionen (zB Makrophagen auf einer epithelialen einschichtige, Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen zusammen mit neutrophilen Granulozyten) und der Echtzeit - Messung von reaktiven Sauerstoffspezies Produktion oder neutrophil extrazellulärem trap Bildung mit Aspergillus nach Stimulation.
Einige Punkte sind zu beachten, um dieses Protokoll zu verwenden, in erster Linie den Laboraufbau benötigt: ein Mikroskop mit einer invertierten Phase, eine Klimakammer stabil bei 37 ° C, und den Anregungs- / Emissionsfilter für dsRed (532/561 nm) und AF633 ( 633 nm). Die Fähigkeit des Mikroskops der Zellen im Fokus zu halten und das Eintauchen in Öl (besonders relevant bei m behaltenulti Punkterfassung) sollte in regelmäßigen Abständen aufgrund der langen Dauer der Bildgebung überwacht werden. Zur Quantifizierung der fungiziden Wirkung Durchflusszytometrie Einrichtungen erforderlich sind. Außerdem müssen geeignete institutionelle und ethische Genehmigungen vorhanden sein, mit gesunden Spendern und Patienten abgeleitet Blutproben und genetisch manipulierten Pilzen zu arbeiten. Es wird dringend die Verwendung frischer Blutproben (Verwendung am selben Tag) zu erhöhen, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Erhaltung Funktionalität empfohlen. Im Idealfall ist die Isolierung von Zellen durchgeführt, unmittelbar nachdem die Blutproben Zeichnung und Neutrophile werden unmittelbar nach der Isolierung abgebildet.
Abschließend wird eine nächste Generation Lebendzellabbildungstechnik in großer Detail Phagozyten antimykotische Aktivität zu beurteilen , gegen A. fumigatus beschrieben. Diese Technologie kann einen einzigartigen Einblick in einzelne Zell-Pilz-Interaktionen in der frühen angeborenen Immunabwehr gegen Aspergillus bereitzustellen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Medizinische Mykologie Pilz Immunologie (SFB, JMB, JK, AW) - Diese Arbeit wurde von der MRC und die University of Aberdeen (MRC Zentrum für Medizinische Mykologie) und vom Wellcome Trust Strategic Auszeichnung unterstützt. Ein ganz besonderer Dank an die Unterstützung der Chloe Fonds gegeben. TMH wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Health (NIH, Code RO1 093.808) und das Memorial Sloan Kettering Cancer Center wird unterstützt von NIH Zuschuss P30 CA008748 unterstützt. Darüber hinaus ist TMH ein Ermittler in der Pathogenese von Infektionskrankheiten durch den Fond Burroughs Wellcome unterstützt. Wir wünschen der Aberdeen Mikroskopie und Histologie Einrichtung für ihre Hilfe und Unterstützung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
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