Summary
ここでは、生細胞ビデオ顕微鏡と一緒に蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してリアルタイムに初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性を評価し、フローサイトメトリーするプロトコルを記述します。生成されたデータは、殺菌活性、食作用、細胞遊走および真菌の成長の阻害のような宿主細胞- アスペルギルス相互作用への洞察を提供します。
Abstract
アスペルギルス・フミガタスが高い場合、致死率と免疫不全宿主における侵襲性感染を引き起こす真菌の日和見病原体です。 A. fumigatusのに対して免疫応答を調査研究は、in vitroで特異的免疫細胞の抗真菌活性を測定するための一貫性と信頼性アッセイの欠如によって制限されています。新しい方法は、蛍光レポーターアスペルギルス （FLARE）分生子を用いてA.フミガーツスに対するヒトのドナーから初代単球および好中球の抗真菌活性を評価するために記載されています。これらの分生子は、構成ライブFLARE分生子で表され、外部従って生死A.フミガーツス分生子の区別を可能にする、ファゴリソソーム内分解に耐性であるアレクサフルオロ633で標識された遺伝的にコードされたDsRedレポーターを含みます。ビデオ顕微鏡およびフローサイトメトリーは、その後、相互作用を可視化するために使用されています分生子と自然免疫細胞間のイオンは、また、食細胞の遊走、貪食および真菌の成長の阻害に豊富な情報を提供しながら、殺真菌活性を評価します。この新しい技術は、すでにA. fumigatusのに対する一次免疫細胞の宿主-病原体相互作用にエキサイティングな新しい洞察を提供してきました。必要な顕微鏡を含めて、このアッセイを実施し、施設フローサイトメトリーするために必要な実験室でのセットアップ、および人間のドナーの血液や遺伝子操作菌類と仕事をする能力を注意することが重要です。しかし、このアッセイは、大量のデータを生成することが可能であり、抗真菌応答に詳細な洞察を明らかにすることができます。このプロトコルは、成功したA. fumigatusのに対する一次免疫細胞の宿主-病原体相互作用を研究するために使用されてきました。
必要な顕微鏡を含め、このアッセイを行うために必要な実験室のセットアップを、注意してくださいと、fフローサイトメトリーすることが重要ですacilities、人間のドナーの血液や遺伝子操作菌類と仕事をする能力。しかし、このアッセイは、大量のデータを生成することが可能であり、抗真菌応答に詳細な洞察を明らかにすることができます。このプロトコルは、成功したA. fumigatusのに対する一次免疫細胞の宿主-病原体相互作用を研究するために使用されてきました。
Introduction
アスペルギルス・フミガーツスは、日和見真菌病原体と免疫不全宿主1、2における侵襲性肺感染症の最も一般的な真菌の原因です。宿主免疫細胞が認識し、 アスペルギルス真菌研究の重要な分野である排除する方法を理解する、しかし、現在入手可能な殺真菌のアッセイは、重大な制限があります。殺菌活性を測定する一般的に使用される方法は、比色アッセイおよびコロニー形成ユニット3、4の決意を含みます。しかしながら、そのような方法は、単一の時点ではなく、宿主と病原体との間の動的相互作用を見るよりも、真菌の生存率に関する情報を提供します。したがって、これらの方法は、菌が殺されたり、単純に（一時的に）成長や代謝活性に制限されているかどうかを考慮に入れることができません。私たちは、fungiciを観察することができる方法を開発しました同時に食作用、食細胞の遊走および真菌の成長の阻害に関する詳細な情報を取得しながら、直接のdal活動。
以前に、プロトコルは、マウスマクロファージ細胞株5によってカンジダ・アルビカンスの食作用を測定する手段としてのリアルタイムイメージングを使用して公開しました。この概念は今、蛍光アスペルギルス・レポーター（FLARE）分生子6、7、8を利用した免疫細胞とアスペルギルス相互作用の我々の理解における知識のギャップに対処するために、さらに開発されました。これらの分生子は赤色のフルオロフォア（のDsRed）を発現し、第二のフルオロフォア（アレクサフルオロ633）で標識されています。 FLAREの分生子が殺されたら、それはDsRedの生産を停止し、AF633は、分生子の蛍光と結合したままながら、残りのDsRedは、フェード。これは、ライブと死ん府の間に明確な区別を作成し、ライブセルイメージング中のNGAL細胞およびフローサイトメトリー、および免疫細胞との相互作用次の個々の分生子の運命の追跡を可能にします。
記載されたアッセイは、宿主の免疫細胞およびAspergillusの間の相互作用を可視化する効果的な方法を提供し、自然免疫細胞における抗真菌エフェクター機構を担当する細胞シグナル伝達経路を解明においてかなりの価値があるだろう。他のアプリケーションは、このような腫れ分生子に休息からスイッチとしてアスペルギルス成長にどのように変化し、可視化する、または腫れ分生子からの菌糸に、食細胞認識や機能に影響を与えています。
以下のプロトコルは、ヒト単球および好中球を取得する方法を詳細に説明します。どのようにFLAREの分生子を準備します。そしてどのようにビデオ顕微鏡とフローサイトメトリーでそれらの応答をキャプチャします。ドナーの血液から単離されたヒトの免疫細胞の使用は、ここで説明されているが、このこの技術は、マウスの細胞集団のさまざまな方法を使っても同様に効果的であることが分かりました。
Protocol
好中球および末梢血単核細胞（PBMC）を得るためのプロトコルは、以前公開された方法9に基づいています。健康なボランティアからの血液サンプルの使用は、アバディーン大学の人間研究倫理委員会によって承認されました。開始する前に、すべての倫理的な承認が記載される実験の目的のために健康なボランティアおよび/または患者から血液を描画するための場所であることを確認してください。彼らの生存を増加させることができる細胞を氷上に保管してください。
1. A. fumigatusの培養条件
- 10に記載されているようにグルコース最小寒天培地を調製します。
- 1 M NaOHを用いてpH6.5にメディアを調整し、20分間120℃でオートクレーブ。
- 65℃に冷却させます。
- 滅菌流フード中で作業し、T75フラスコに冷却媒体の30mLの流動およびC 25 mlピペットでフラスコ休止の首と冷却させます寒天斜面をreate。
- 寒天上のDsRed Af293- A.フミガーツス株アウトストリークし、37℃+ 5％CO 2で7日間インキュベートします。 2つのフラスコを、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）プレビオチンに約10 9分生子をもたらします。
2. A.フミガーツスラベリング及び準備
注：最初にこのアッセイを行う場合、親Af293- A.フミガーツス株を調製します。マイクロ遠心チューブ中の両方の株のサンプルを採取し、以下に説明するようにのみ各株のいずれかを標識します。これは、1つは、セットアップや機器をテストするために、DsRedのかAF633のいずれか、単一の色と色なしと分生子を制御分生子を持つことができるようになります。
- 30mLのPBS + 0.05％のTween-80で培養液を浸漬することにより収穫A.フミガーツス分生子。菌糸断片を除去するために、50mLのチューブに40μmのセルストレーナーを通して得られた懸濁液をフィルタリングします。
- C10分間、805×gでentrifuge、上清を除去し、無菌PBS 20mlに1回洗浄。洗浄工程中の同系統の二つのプレートからのプール分生子。
- 洗浄工程後、マイクロ遠心チューブに5 mlのPBSと転送分生子懸濁液の1mLのアリコートでペレットを再懸濁します。各菌株の懸濁液の1mLを通常生細胞イメージングのために十分です。 4℃で箔とストア内の残りのアリコートを包みます。
- 分生子懸濁液の遠心分離アリコートを室温で10分間、9,300×gで、慎重に上清を除去します。 1 mLの0.05 M NaHCO 3をpHが8.3に分生子ペレットを再懸濁します。
- 500μLのDMSO中に25mgのビオチンを再構成することにより、10 mgのビオチン/ 200μLのジメチルスルホキシド（DMSO）ストック溶液を調製します。アルミホイルに10μLビオチン/マイクロ遠心チューブにDMSOストック溶液、カバーを追加し、4℃でロッカー上で2時間インキュベートします。
- ビオチン/ DMSOストックsolutioの残りをアリコートnと、その後の実験で使用するために-20℃で凍結します。
- 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。自由浮動ビオチンを不活性化するために1時間、100mMのトリス-HCl pH8.0の1mLの分生子ペレットを再懸濁します。
- 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。滅菌PBS 1mLで二回ペレットを洗浄し、1mlのPBSにペレットを再懸濁します。
- 2mg / mLのストック溶液を作製するためにPBS 0.5mlのストレプトアビジン - AF633 1mgを溶解させます。分生子懸濁液1mlあたり2ミリグラム/ mLのストレプトアビジンAF633の10μLを加え、アルミホイルで覆われたロッカー上で室温で40分間インキュベートします。残りのストレプトアビジンAF633は、その後の実験で使用するための一定分量で凍結させることができます。
- 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。 PBS 1mLに分生子ペレットを再懸濁し、1で血球計数器を使用して、分生子をカウント：1,000希釈（1：100、その後1:10）。 CO 2独立培地で3.6×10分生子濃度6 / mLに調整し、4℃で箔とストアに包みます。
注：分生子は今AF633で標識されており、FLARE分生子と呼ぶことにします。 - オプション：膨潤分生子による刺激が必要な場合、分生子（ステップ2.9）をカウントした後、酵母窒素塩基（YNB）培地中に7.2×10 6 / mLに分生子を希釈し、オートクレーブ50内に4.5 mLのYNB培地500μLを分生子懸濁液を追加mLの三角フラスコ。カバー6時間振盪インキュベーター（37℃、200 RPM）にフラスコを置きます。
- 15mLのチューブに培地を移します。室温で10分間、805×gで遠心分離し、PBS中で1回洗浄します。遠心分離機再度1mLのCO 2独立培地中でペレットを再懸濁し、3.6×10 6分生子/ mLに与えます。
注：分生子は頻繁に彼らは困難数え正確作る腫れになった後、Cで計算することをお勧めされて凝集使用分生子を休んのounted番号。
- 15mLのチューブに培地を移します。室温で10分間、805×gで遠心分離し、PBS中で1回洗浄します。遠心分離機再度1mLのCO 2独立培地中でペレットを再懸濁し、3.6×10 6分生子/ mLに与えます。
ヒト好中球および単球の3分離
- エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む2本の10 mLの血液チューブに健康なボランティアから静脈血20mLのを描きます。別々に各ドナーのために、50 mLチューブに20mLの血液を注ぎ、15mLのPBSで希釈しました。
- シリンジおよび鉄針とリンパ球分離溶液（密度1.077グラム/ mL）を15 mLの血液を下敷き。チューブの底に針を置き、穏やかにリンパ球分離溶液を押し出します。ブレーキなし、低加速度で20分間、630×gで遠心します。
- PBS、氷上で冷却を準備します。
注：手順3.4と3.5は、単球（3.4）と好中球（3.5）を生成するために同時に従わなければなりません。 - pastetteを使用して、PBMC層を収穫。これは、黄色血清（上部）と透明リンパ球分離溶液（下部）層との間の中央に層であり、そして新しい50mlチューブに移します。
- 10分間582×gで50冷PBSでmL及び遠心分離までPBMCでチューブを埋めます。上清を除去し、最初に使用されるドナー血液の20 1mLあたり1mlのPBSに再懸濁し、冷PBSとで二回洗浄します。
- PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）及びHBSS 500mLの0.5 M EDTAの2.1ミリリットルの26ミリリットルを添加することによって緩衝液を調製します。遠心分離機1×10 7個の細胞当たり緩衝液40μL中515×gで再懸濁で10分間細胞。
- 15mLのチューブに細胞懸濁液を移し、1×10 7細胞あたりのCD14マイクロビーズの10μLを追加し、よく混合し、5分毎のチューブを混合することを確認して、4℃で15分間インキュベートします。
- 1×10個の7細胞およびCEN当たり緩衝液1mlを添加することによって細胞を洗います10分間515×gでtrifuge。
- 吸引完全上清および緩衝液500μLに1×10 8細胞まで再懸濁します。
- 製造業者の指示に従って磁気分離にサンプル当たり1つのカラムを置き。第1緩衝溶液500μLで一度カラムを洗浄。
- 乾燥した後、緩衝液でこの3回繰り返して洗浄する列を待ち、カラムを通して細胞懸濁液500μLをピペット。
- カラムの下に新しい15mLのチューブを配置し、磁気分離カラムオフを取ります。次いで、緩衝液1mLでチューブにカラムから細胞を洗い流します。
- 10分間、515×gで緩衝液及び遠心分離機の4 mLを加え、次いで、ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地1mLに再懸濁します。
- PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。で細胞を数えます血球計数器。
- RPMI 6×10 5 / mlに細胞濃度を調整し、35mmのガラスベースのイメージング皿上に200μLを播種。 5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。
- 次の日、撮影に先立って、RPMIを除去し、CO 2独立培地200μLを加えます。
注：これらの単球も前に撮像種々マクロファージサブセットに分化させることができます。これは探求する手法であれば、優れた出発点はOhradanova-Repic らによる最近の論文です。 1 1。
- PBMC層を採取した後、血清のすべてを削除し、リンパ球分離液のほとんどが、これは、好中球のほとんどが含まれていますよう赤ペレットの上に小さな白いバンドを削除しないように注意してください。
- NH 4 Cl を 83gの滅菌水1LにKHCO 3 10gを添加することによって、10倍の低張溶解緩衝液ストックを調製します。 4℃で保存C.
- 滅菌水で、この株式の10倍に希釈し、チューブに追加します。その後、慎重に3回を反転し、15分間氷上でインキュベートします。
- 氷上で10分間低張溶解緩衝液中で10分間再懸濁のために394×gで遠心分離。
- 394×gで遠心分離し、冷たいPBSで2回洗浄します。ドナー当たりのCO 2独立培地1mLに再懸濁。
- PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。血球計数器を用いて細胞を数えます。
- フローサイトメトリーのために、6×10 5 / mLの濃度に調整し、24ウェルプレートに400μLの細胞懸濁液を加えます。顕微鏡観察のために、35mmのガラスベースのイメージング皿に同一の細胞懸濁液200μLを加えます。
好中球イメージングのか、刺激されていない放置すればアポトーシスを受けるようにそれらの傾向に即座に開始すべきであるフローサイトメトリー：注意してください。これがない場合には可能性好中球が上に保持されなければなりません（同じ日以内に）できるだけ早く氷と使用。
4.フローサイトメトリー
- 24ウェルプレート中の細胞に1.2×10 6 / mLのFLARE分生子の200μLを追加し、20μgの/ mLのボリコナゾールの100μLを加えます。 RPMIの300μLを添加し、5％CO 2で37℃で16時間インキュベートします。
注：ボリコナゾールは、分生子発芽を防止するために添加されます。 - 25μMの最終濃度のために、各ウェルに1 mMのカルコフロアホワイト原液25μLを添加し、5％CO 2で37℃で10分間インキュベートします。
- 10分間582×gで遠心します。上清を除去し、PBSで2回洗浄します。
- 付着細胞（単球）を採取するために、各ウェルに3 mMのEDTAを含むPBS 1 mLを加え、5％CO 2で37℃で10分間インキュベートします。穏やかにピペッティングすることによってプレートから細胞を洗浄し、チューブ内の細胞を収集します。
- PBにFACSバッファーで1回洗浄（2％ウシ胎児血清S）、その後、FACS分析のためにFACSバッファーに再懸濁します。
- FACS分析のために、第一のフローサイトメーターの補償パラメータを調整しない色の分生子を含む単一色補償管を使用して正のゲート、設定：のDsRed +の分生子、AF633 +分生子、及びカルコフロアホワイト+分生子（4.2のように生成します）。
- 色のない分生子を使用して自由に前方に基づいて、分生子ゲートおよび側方散乱を設定します。無料の分生子ゲートを除くことにより、前方および側方散乱にセルのゲートを設定します。
- 万回のイベントを記録することにより、サンプルチューブを分析します。
注：ライブの分生子に関連した細胞は、+のDsRedとAF633 +されます。死んだ分生子に関連した細胞は、唯一のAF633 +となります。分生子を従事していないバイスタンダー細胞はdsRed-とAF633-になります。分生子合さ細胞集団は、さらに、パシフィックブルーチャネルでカルコフロアホワイト染色について分析します。内在化されていカルコフロアホワイト+になり、細胞の外に残っている分生子、分生子は次のようになりますカルコフロア白 - 。
5.ライブセルビデオ顕微鏡
注：顕微鏡の選択は局所的に利用可能なものに依存するが、顕微鏡の設定は反転ステージ、37°CとのDsRed（561分の532 nm）をAF633に適切な励起/発光フィルターに加熱し、環境チャンバを含める必要があります（633nmで）。 FLARE分生子はDsRedのための561分の532 nmのレーザーの代わりに488nmのレーザーでは動作しません。この最初に、この実験を行う際に、バックグラウンド蛍光について試験し、ブリードスルーのDsRedとAF633チャネルとの間には、no色および単色で制御分生子を使用します。
- 実験前に、顕微鏡ヒーターの電源をオンにし、環境制御室のための十分な時間が37°Cまで昇温することができます。安定化させるために、チャンバ温度に要する時間が異なる顕微鏡セットアップのために変化するであろう。
- 顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、LO広告イメージングソフトウェア。顕微鏡ステージ上の撮像皿をマウントし、ヒト好中球または単球を見つけるために焦点を合わせます。
- DsRedとAF633ため、取得設定で1秒に10％と露光時間にレーザパワーを設定します。
- 撮像スライドを削除し、適切なウェル（総容量300μL/ウェル）に3×10 6 / mLのFLARE分生子懸濁液100μLを加えます。分生子は皿に添加されているFLARE時間を記録します。
- ステージにスライドを戻し、明確に分生子を参照してくださいが、イメージを露出オーバーしないようにのDsRedとAF633用カメラの感度を調整します。マルチポイント取得が必要な場合は、ステージポイントのリストを設定します。
- 全ての点が焦点にあるとき、チャネルが最適化され、サイクル時間および持続時間が設定された撮像開始。サイクルタイムとイメージングの期間は、実験的な質問に依存します。目標は1分UPTの深さの分析を可能にするとともに、できるだけ短いサイクルタイム（≤2分）維持することですダイナミクスAKE。
Representative Results
代表的な結果を説明したプロトコールに従って示されています。 図1は、ヒト好中球及びFLARE分生子を有する代表的な6時間生細胞ビデオを示します。それらはAF633（マゼンタ）で標識されていながらのDsRed（赤色）は分生子自身によって表されます。
図2は、生と死FLARE分生子の間の差を示す、 図1の表示と同様の映画からの単一時点からの画像です。デッド分生子は明るいAF633（マゼンタ）蛍光を維持しながら、それらのDsRed（赤）信号を失うことにより、ライブ分生子は区別されます。 A.フミガーツス分生子は、多くの場合、6時間にわたってための食細胞内生き残ります。したがって、効果的に死滅を定量化するために、フローサイトメトリープロットは、 図3の16時間のインキュベーション期間のために示されています。このデータは、肺胞マクロファージ、CEを用いて得られました一例として、LLラインが、任意の細胞型を用いて行うことができます。 図4に、移行は、ヒト好中球に対する刺激ならびにそれらの速度及び方向移動の最初の時間で示されています。 図5は、 図6の菌糸に発芽分生子の数を表示しながら、1、2、3またはそれ以上の分生子を摂取している好中球および単球の割合を示します。
図1：ヒト好中球とFLARE分生子のライブセルビデオ顕微鏡ムービー。好中球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。 =10μmのスケールバー。ビデオズームイン左上のDICとFLARE分生子の役割を明確にするために分離チャネルで示され、右上でのDsRed（赤色）下で、AF633（緑色）は、左と右下のマージされたビデオ。 このビデオをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図2：単一の時点の画像は、ライブとデッドFLAREの分生子の違いを実証しました。ヒト好中球は、FLAREの分生子で刺激し、スピニングディスク共焦点顕微鏡で画像化しました。画像が生成され、映画から取りました。そのAF633蛍光（：左下緑色）を維持しながら信号：デッド分生子は、それらのDsRed（右上赤）を失ったことにより、菌糸から区別されます。 こちらをクリックしてください。この図の拡大版を表示します。
図3：定量化し、食作用およびA.フミガーツス分生子の殺害の検証。ボリコナゾールの存在下で16時間：1の比率マウス肺胞マクロファージ細胞（MH-S）が1でFLARE分生子と共にインキュベートしました。生の分生子に関連付けられているMH-S細胞を赤色ゲート（のDsRed + AF633 +）に示されています。デッド分生子に関連付けられているMH-S細胞はブルーゲート（のDsRed-AF633 +）に示されています。バイスタンダーMH-S細胞は、金門に示されています。カルコフロールホワイト、真菌の細胞壁に結合する細胞不透過性蛍光色素は、細胞内の分生子（カルコフロア白 - ）から外分生子（カルコフロールホワイト+）を区別するために使用されます。方法に余分な検証として、それが2μMサイトカラシンDによる処置MH-S細胞による分生子取り込みを阻害が示されています。e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Pleaseこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：A.フミガーツス分生子に対するヒト好中球および単球の遊走。好中球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。フィールド当たりのすべての個々のヒト好中球の移動は、手動で1時間（A）および膨潤（B）分生子を休止に対して追跡ソフトウェアを使用して追跡しました。データは、同じドナーの各条件のための細胞の1つのフレームを表します。蛇行因子（C）、DIRECTIOの尺度NAL運動、および速度（D）は 、同じソフトウェアを用いて定量しました。 3人のドナーについて平均±SEMを2つの独立した実験にわたってドナー当たり30個の細胞を用いて示されています。 *：P <0.05（Welchの修正t検定）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：ヒト好中球及び単球によるA.フミガーツス分生子の貪食。好中球および単球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。細胞の量が含まれているとして、食作用を測定しました刺激の4時間後にFLAREの分生子をする。データは、2つの独立した実験の上に3人のドナーとドナーあたり3つのフレームからの平均±SEMとして提示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： 好中球及び単球による A.フミガーツス分 生子 の発芽の阻害 。好中球および単球は、ヒトの血液から単離され、1の比でCO 2独立培地中FLARE分生子と共に播種した：それぞれ、3。イメージングは、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて37°Cで直接開始しました。画像は6時間かけて1分、55秒間隔で撮影しました。真菌の発芽の阻害は、胚を持っていた分生子の割合を測定することにより調べました共培養の2,4および6時間後にinated。データは、2つの独立した実験の上に3人のドナーとドナーあたり3つのフレームからの平均±SEMとして提示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
この方法は、蛍光レポーターアスペルギルス （FLARE）分生子、生細胞イメージングを用いてA.フミガーツスに対するヒト初代食細胞の抗真菌活性を研究し、フローサイトメトリーにインビトロ方法で革新的に記載されています。以前の研究では、マウスの実験的真菌感染のin vivoでの抗真菌と耐性6、7の試験管評価の両方で FLAREの分生子を使用しての付加価値を実証しています。この次世代生細胞イメージング技術とFLAREの分生子を組み合わせることにより、in vitroでの動的な相互作用の間に、個々の分生子の生存率を測定するためのセットアップを可能にします。
記載されている方法は、その抗真菌応答に免疫細胞の特定の細胞プロセスの特定の役割と重要性を調査する可能性を秘めています。また、特定の患者の食細胞の抗真菌応答が苦しんでいます彼らの免疫系において定義された単一成分の欠陥は、より詳細に評価することができます。非常に早いと初期の抗真菌応答連続撮影の6時間かけて非常に詳細に研究することができます。これは、そのような真菌に向かって食細胞の遊走の速度として検出することも微妙な差異を可能に内在化速度、従来の食作用の方法を使用して区別できないであろう殺菌イベント12、のダイナミクス。
任意の細胞型がこの方法で使用することができます。これらの食細胞がA.フミガーツス 13に対するヒト気道における防御の1行目と2行目を構成するためにここで使用される細胞型を選択しました。興味深いことに、非常に明確な違いは、単球及び好中球が休息や腫れ分生子と菌糸と係合する方法との間で観察することができます。好中球がはるかに移動活性を示す一方、単球はほとんど、分生子に移行しません。追加の蛍光傷そのような免疫細胞の生死マーカーとしてKERSはアスペルギルスとの相互作用以下の食細胞の生存への洞察を提供するために、アッセイに含めることができます。この技術のための興味深い潜在的な将来のアプリケーションは、異なる宿主細胞種の共培養、抗真菌応答の結果を（ 例えば 、上皮単層、一緒に好中球と単球由来樹状細胞のマクロファージ）、および反応性のリアルタイム測定アスペルギルスによる刺激後の酸素種の生成や好中球細胞外トラップ形成。
反転ステージと顕微鏡、37℃で安定した環境室、及びDsRedの（561分の532 nm）をAF633（の励起/発光フィルター：いくつかのポイントは、まず、このプロトコルを使用するように注意する必要が実験室の設定を必要とします633 nm）を。 M中の焦点で細胞を維持し、油浸を保持する顕微鏡の能力（特に関連ultiポイント取得）による撮像の長い持続時間に定期的に監視しなければなりません。殺真菌活性の定量化のための設備が必要とされているフローサイトメトリー。また、適切な制度的、倫理的な承認は、血液サンプルおよび遺伝子操作菌類派生健康なドナーと患者と仕事をする場所にする必要があります。強く、細胞の生存率を高め、機能を維持するために、新鮮な血液サンプル（同じ日に使用）を使用することをお勧めします。理想的には、細胞の単離は、血液サンプルを描画した後、直ちに実行され、好中球が分離した直後に画像化されます。
結論として、A.フミガーツスに対する非常に詳細食細胞の抗真菌活性を評価するための次世代生細胞イメージング技術が記載されています。この技術は、アスペルギルスに対する初期の自然免疫防御における個々の細胞、真菌の相互作用にユニークな洞察を提供することができます。
Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
医真菌真菌免疫学（SFB、JMB、JK、AW） - この作品は、MRCとアバディーン大学（医真菌のためのMRCセンター）によっておよびウェルカムトラスト戦略的な賞でサポートされています。特別なあなたはクロエ基金からの支援に与えられて感謝しています。 TMHは、米国国立衛生研究所（NIH、コードRO1 093808）、メモリアルスローンケタリングがんセンターからの助成金によってサポートされているNIHのグラントP30のCA008748によってサポートされています。さらに、TMHはバローズウェルカム基金でサポートされている感染症の病因における研究者です。私たちは、彼らの助けと支援のためのアバディーン顕微鏡および組織学施設に感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
